Omi/HtrA2 is a mitochondrial serine protease that is known to translocate to the cytoplasm upon induction of apoptosis and to activate caspase-dependent and caspase-independent cell death. The molecular mechanism of Omi/HtrA2's function is not clear but involves degradation of specific substrates. These substrates include cytoplasmic, mitochondrial, as well as nuclear proteins. We have isolated a new Omi/HtrA2 interactor, the THAP5 protein. THAP5 is a fifth member of a large family of transcription factors that are involved in cell proliferation, apoptosis, cell cycle control, chromosome segregation, chromatin modification and transcriptional regulation. THAP5 is an approximately 50kDa nuclear protein, with a restricted pattern of expression. Furthermore, there is no mouse or rat homolog for this protein. THAP5 mRNA is highly expressed in the human heart but some expression is also seen in the brain and skeletal muscle. The normal function of THAP5 in the heart or heart disease is unknown. THAP5 protein level is significantly reduced in the myocardial infarction (MI) area in the heart of patients with coronary artery disease (CAD). This part of the heart sustains most of the cellular damage and apoptosis. Our data clearly show that THAP5 is a specific substrate of the proapoptotic Omi/HtrA2 protease and is cleaved and removed during cell death. The molecular mechanism of THAP5's function is unclear. THAP5 can bind to a specific DNA sequence and repress transcription of a reporter gene. Our work suggests that THAP5 is a tissue specific transcriptional repressor that plays an important role in the normal function of the human heart as well as in the development of heart disease.

Plants respond to environmental stress by altering their gene expression. Under stress conditions some genes are activated and some genes are repressed. Even though a lot of work has been done to understand mechanisms of gene activation under abiotic stress very little information is available on how stress responsive genes are kept repressed under normal growth conditions. Recent work has revealed that plants use transcriptional repression as common mechanism of gene repression. Transcriptional repression is achieved by recruitment co-repressor complexes to the target genes. Recent studies have revealed that the co-repressor LUH complexes with SLK1 and SLK2 to silence Arabidopsis thaliana stress responsive genes. However, the transcription factors involved in the recruitment of this complex to its target genes are not known. In this study, we identified SLK2INT1, as a novel transcription factor that is involved in silencing of select Arabidopsis thaliana stress responsive genes by recruiting the LUH-SLK2 complex.

First, expression profiling of ZNFs with CpG islands at 10 clusters of Chr19 was examined in a panel of NPC and ESCC cell lines by semi-quantitative RT-PCR, with adult normal tissues - larynx and esophagus as controls. Several down-regulated genes were identified, and I further focused on 5 candidates: ZNF382, ZNF545, ZFP30, ZNFT1 and ZNFT2. These genes were frequently downregulated in NPC, ESCC, lung, gastric, colon and breast carcinomas. Their promoters were frequently methylated in multiple downregulated cell lines but less in non-tumor cell lines as revealed by methylation-specific PCR (MSP) and bisulfite genomic sequencing (BGS). Their expression could be restored by pharmacologic or genetic demethylation, suggesting that DNA methylation was directly involved in their silencing. The frequent methylation of these genes indicated they could act as potential biomarkers. / In conclusion, several novel candidate TSGs epigenetically silenced in tumor cells were identified in this study. Their downregulation by promoter methylation was tumor-specific, which could be use as epigenetic biomarkers for diagnosis. / More functional studies were done for ZNF382 and ZNF545, I found that ectopic expression of ZNF382 and ZNF545 in tumor cells lacking endogenous expression could inhibit tumor cell clonogenicity, proliferation and induce apoptosis. I found that ZNF382 suppressed tumorigenesis through mediating heterochromatin formation, as ZNF382 was revealed to be co-localized and interacts with heterochromatin protein. For ZNF545, I found that it is a transcriptional repressor. I further showed that ZNF545 was located in the nucleus and sequestered in the nucleolus. ZNF545 could inhibit tumorigenesis at least partially through downregulating the transcription of target genes or regulating nucleolus function such as ribosome biogenesis. / The development of a tumor from a normal cell is a complex and multi-step process. A large number of oncogenes, tumor suppressor genes (TSGs) and signal transduction pathways are involved in this process. Tumor-specific methylation of TSGs in multiple tumors indicated that it could be used as epigenetic biomarker for molecular diagnosis and therapeutics. / The functions of KRAB-containing proteins are critical to cell differentiation, proliferation, apoptosis and neoplastic transformation. A large number of ZNF genes are located in 10 clusters at chromosome 19. Some of the KRAB-ZNF may function as potential TSGs with epigenetic alterations. Thus, I try to identify silenced novel KRAB-ZNF candidate TSGs through screening chromosome 19. / Cheng, yingduan. / Adviser: Tao Qian. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-02, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 110-136). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Dosage compensation is a mechanism that equalizes the expression of X-linked genes in those organisms in which males and females differ in the number of X chromosomes. In Drosophila melanogaster, dosage compensation is achieved by up-regulating the transcription of the single male X chromosome. This effect is mediated by a chromatin remodeling complex known as the Male Specific Lethal (MSL) complex or Dosage Compensation Complex (DCC). In female flies, dosage compensation is inhibited primarily because of the translational repression of the mRNA encoding one of the DCC subunits, MSL-2, by the female-specific RNA binding protein Sex-lethal (SXL). To inhibit translation, SXL binds to poly(U) stretches present in both the 5’ and 3’ UTRs of msl-2 mRNA. Sequences adjacent to those SXL-binding sites in the 3´UTR are also required for translation inhibition and are bound by co-repression. In this thesis work, we have designed an affinity chromatography assay to isolate the putative co-repressor(s), and have identified the protein Upstream of N-ras (UNR). Drosophila UNR (dUNR) is an ubiquitous, conserved protein that contains 5 cold shock domains (CSD) and a glutamine- (Q) rich amino- terminal extension. We show that dUNR is a necessary co-factor for SXL-mediated msl-2 repression. SXL recruits dUNR to the 3’ UTR of msl-2 mRNA, imparting a sex-specific function to this ubiquitous protein. Domain mapping experiments indicate that dUNR interacts with SXL and msl-2 mRNA through CSD1, and that the domains for translation inhibition and SXL interaction can be distinguished. Our data indicate that the Q-rich domain, together with CSDs 1 and 2, plays an important role in translational repression, and suggest that factors in addition to dUNR and SXL are required for repression of msl-2 mRNA. Using a combination of UNR immunoprecipitation and microarray analysis, we have identified the mRNAs that are bound to dUNR in male and female flies. Our results suggest that dUNR is not only a novel regulator of dosage compensation, but also a general post-transcriptional regulator of gene expression.

L’expression d’un gène donné est généralement le résultat de la dualité qui existe entre l’activation et la répression transcriptionnelle de ce gène. Au laboratoire, nous tentons de mieux comprendre la régulation de la transcription génique, et c’est dans ce cadre que nous étudions certaines protéines qui appartiennent à la famille de facteurs de transcription Ets.<p>Ces derniers sont caractérisés par un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé, le domaine ETS, qui se lie sur les promoteurs de leurs gènes cibles au niveau de sites comportant le motif central 5’- GGAA/T -3’. <p>Certaines de ces protéines ont été montrées comme étant impliquées dans des processus du développement normal et cancéreux. <p><p>Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le facteur transcriptionnel Fev dont l’expression est restreinte au noyau du raphé dans le cerveau, à la prostate et à l’intestin grêle. Nous avons participé à la caractérisation fonctionnelle de ce facteur permettant de le définir comme répresseur transcriptionnel. Plus particulièrement, nous avons identifié la partie carboxy-terminale riche en résidus alanine comme étant impliquée dans la répression. Afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire qui régit la répression induite par Fev, nous avons tenté d’identifier les partenaires protéiques impliqués dans ce processus transcriptionnel. Dans un premier temps, nous avons montré que Fev interagit physiquement avec les co-répresseurs transcriptionnels à activité histone désacétylase HDAC1 et HDAC3. Aussi, nous proposons de définir le rôle biologique de cette interaction. Par la suite, nous avons utilisé le système de criblage de banques par « double hybride en levures ». En utilisant comme appât soit Fev, soit sa partie carboxy-terminale, nous avons isolé plusieurs candidats interacteurs, dont la protéine DP103 qui est impliquée dans la régulation transcriptionnelle induite par d’autres facteurs de transcription de la famille Ets. Après avoir montré par co-immunoprécipitation que Fev interagit avec DP103, nous tentons de mettre en évidence la fonctionnalité de cette interaction. <p><p>Dans la seconde partie de ce travail, nous avons étudié Erm, un activateur transcriptionnel de la famille Ets, qui est exprimé dans certains types de tumeurs, telles que les cancers mammaires métastatiques, et qui y régule l’expression de métalloprotéases. Ce facteur joue aussi un rôle régulateur dans les lymphocytes CD4+ T helper de type 1 (Th1) via l’interleukine-12. Néanmoins, les cibles ainsi que le rôle de Erm ne sont pas encore clairement identifiés dans les lymphocytes. Dans cette partie du travail, nous avons initié une étude sur les voies de signalisation impliquées dans la régulation transcriptionnelle de Erm. Nous avons montré que dans la lignée cellulaire Molt4 d’origine lymphoblastique ce facteur de transcription est la cible de la cascade de signalisation impliquant la famille des protéines kinases C (PKC). Grâce à l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des différentes sous-familles des PKC, nous avons montré que la transcription de Erm est régulée par les PKC conventionnelles. Aussi, après avoir isolé un fragment de 0,5 Kpb du promoteur de Erm, en amont de l’exon 1a, nous avons identifié une région régulatrice qui est activée par la voie des PKC. <p><p>Ainsi, les approches que nous avons développées dans ce travail nous ont permis de progresser dans la caractérisation des facteurs de transcription Fev et Erm. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Σκοπός της παρούσης διατριβής είναι να προτείνει ένα τυπικό πλαίσιο για μια μεθοδολογία ανάλυσης που να ενσωματώνει ποσοτικά, και λειτουργικά δεδομένα και στοχεύει στο σχεδιασμό πειραμάτων για την επιβέβαιωση μεταγραφικών παραγόντων που δεσμεύονται σε ένα λειτουργικά ενεργό μοτίβο στον υποκινητή γονιδίων. Το πλαίσιο αυτό που βασίζεται στη Bayesian πιθανοκρατική θεωρία όπως αυτή θεμελιώνεται στη θεωρία λήψης αποφάσεων, εφαρμόζεται σε ένα πρόβλημα από το ερευνητικό πεδίο της ανοσοβιολογίας. Συγκεκριμένα μελετούμε την ανίχνευση μεταγραφικών παραγόντων που ενέχονται στην αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διαδικασία ενεργοποίσης των Τ λεμφοκυττάτων. Η υιοθέτηση του προτεινούμενου πλαισίου σμιλεύει μαι αυστηρή διαδοχή διεξαγωγής in vitro και in silico πειραμάτων που ξεκινά από τεχνικές μαζικής ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης, περνά μέσα από βάσεις δεδομένων μεταγραφικών παραγόντων και μέσω πειραμάτων ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electromobility Shift Assays) στοχεύεται στην επιβεβαίωση που προσφέρουν τα πειράματα διαμόλυνσης (transfection and reporter assays). Κατά την τυποποίηση της λογικοφανούς αυτής προσέγγισης ανακύπτει ένα από τα γνωστότερα προβλήματα της εφαρμοσμένης στατιστικής, το πρόβλημα των "δύο μέσων όρων" ή πρόβλημα Behrens-Fisher. Για τη λύση αυτού του προβλήματος προτείνονται νέα μαθηματικά εργαλεία τα οποία αξιοποίηθηκαν για την κατασκευή αντίστοιχου λογισμικού. Με την εφαρμογή αυτών των εργαλείων στο εφαρμοσμένο ανοσοβιολογικό πρόβλημα προέκυψε μια μη αναμενόμενη σχέση μεταξύ δυο φαινομενικά μη συνδεόμενων συστημάτων¨των γονιδίων των κυτταροκινών και του ιού HIV. Μέσω της περιγραφόμενης μεθοδολογίας κατέστη εφικτή μια υποθεσο-εξαρτώμενη προσέγγιση σε ένα σημαντικό πρόβλημα το οποίο δεν ήταν δυνατό να λύθέί με κλασσικές βιοχημικές τεχνικές λόγω τεχνικών δυσκολιών / The current disertation concerns the description of a formal framework and an analytic methodology which aims to validate transcription factors controlling gene expression through functional and quantitative data. This Bayesian decision theory inspired framework is applied to a specific immunobiological problem. The problem targetted was the discovery of transcriptional repressors implicated in the negative control of T cell activation. Adopting the proposed framework leads one to a staged experimental strategy which starts from high-throughput gene expression data and transcription factor databases and through Electrophoretic Mobility Shift Assays targets the design of transfection and reporter gene assays. The formalization of the proposed approach, led to one of the famous applied statistics problems i.e. the two means or Behrens - Fisher problem. In order to deal with the computational aspects of this problem, we applied a novel integral transformations and ported them to software. The application of these tools to the immunobiological problem led to an unexpected connection between two seemingly unrelated systems: cytokine gene protomers and HIV LTR. The proposed methodology enabled a hypothesis-driven approach to an important basic immunobiological problem which could not be solved by standard biochemical techniques.

Les protéines de la Famille Ets sont des facteurs de transcription qui reconnaissent par l'intermédiaire d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé le domaine ETS, une séquence nucléotidique centrée sur un core consensus 5'-GGAA/T-3'. Le gène fev, un membre de cette famille, a été isolé chez l'humain après avoir été identifié dans une tumeur de Ewing chez l'enfant comme le résultat d'une translocation chromosomique. Une étude préliminaire de 1997 indiquait que chez l'Homme, Fev possède une expression tissulaire restreinte au petit intestin et à la prostate "adulte". Dans la première partie de ce travail, nous avons observé une surexpression de l'ARNm de ce facteur de transcription dans une large série d'adénocarcinomes prostatiques de différenciation variable en comparaison au profil d'expression observé dans un groupe témoin de prostates hyperplasiées. En recherchant des lignées cellulaires qui expriment ce facteur, nous avons mis en évidence la présence de ce messager dans la lignée humaine d'origine prostatique LNCaP. De même, les lignées humaines d'origine hématopoïétiques Dami/HEL92.1.7, K-562, KU-812 F et U-937 expriment ce facteur. Parallèlement, nous avons réalisé l'étude de l'expression de Fev dans le cerveau humain. En effet, chez le rat et chez la souris, l'homologue de Fev (mPet-1/Pet-1) est exprimé spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques. Nous avons ainsi montré sur le cerveau humain que l'ARNm de Fev est exclusivement exprimé dans les noyaux du raphé qui contiennent les neurones sérotoninergiques. Il est co-exprimé avec deux marqueurs de ces neurones, la SERT/5-HTT et la TPH2.<p>Parallèlement, nos travaux de caractérisation fonctionnelle de la protéine Fev ont permis de définir ce facteur comme un répresseur transcriptionnel. En effet, ce facteur possède un domaine carboxy-terminal riche en résidus alanines qui lui confère, en partie, sa fonction de répresseur de la transcription (répression active); la délétion de cette région conduisant à une réduction drastique de l'effet répresseur. Parallèlement, nous avons montré que le domaine ETS de Fev est responsable d'une activité répressive passive par l'occupation des sites de liaison aux facteurs Ets. Néanmoins, nous ne connaissons pas, à l'heure actuelle, les gènes-cibles spécifiques qui sont directement réprimés par Fev dans les cellules dans lesquelles le gène est normalement exprimé. Nous avons tenté de développer, par établissement de clones stables, des modèles cellulaires où le gène d'intérêt est surexprimé, mais ces tentatives furent infructueuses. Cet effet drastique de Fev est conféré par la partie carboxy-terminale. Il est ainsi probable que la surexpression de ce répresseur transcriptionnel spécifique de certains gènes cibles de la famille Ets provoque des effets sur la survie des cellules en régulant des gènes indispensables à la croissance cellulaire, et ainsi empêchant la prolifération de clones cellulaires.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The transcriptional repressor BCL6 has been shown to be essential for the differentiation of germinal center (GC) B cells and follicular T helper (TFH) cells. The interaction of TFH and GC B cells is necessary for the development of high affinity antibodies specific for an invading pathogen. Germline BCL6-deficient mouse models limit our ability to study BCL6 function in T cells due to the strong inflammatory responses seen in these mice. To overcome this, our lab has developed a new BCL6 conditional knockout (cKO) mouse using the cre/lox system, wherein the zinc finger region of the BCL6 gene is flanked by loxP sites. Mating to a CD4-Cre mouse allowed us to study the effects of BCL6 loss specifically in T cells, without the confounding effects seen in germline knockout models. Using this cKO model, we have reaffirmed the necessity of BCL6 for TFH differentiation, including its role in sustained CXCR5 surface expression, a signature marker for TFH cells. This model also allowed us to recognize the role of BCL6 in promoting the expression of PD-1, another key surface marker for TFH cells. Without BCL6, CD4+ T cells cannot express PD-1 at the high levels seen on TFH cells. Our discovery of DNMT3b as a target for BCL6 suggests BCL6-deficient T cells have increased DNA methyltransferase activity at the PD-1 promoter. This data establishes a novel pathway for explaining how BCL6, a transcriptional repressor, can activate genes. Experiments with the BCL6 cKO model have also established a role for BCL6 in naïve CD4+ T cell activation. Furthermore, we did not observe increased differentiation of other helper T cell subsets, in contrast to what has been reported elsewhere with germline BCL6-deficient models. Unexpectedly, we found decreased T helper type 2 (Th2) cells, whereas mouse models with a germline mutation of BCL6 have increased Th2 cells. These results indicate that BCL6 activity in non-T cells is critical for controlling T cell differentiation. Finally, using an HIV-1 gp120 immunization model, we have, for the first time, shown BCL6-dependent GCs to be limiting for antibody development and affinity maturation in a prime-boost vaccine scheme.