Ulm, Univ. Diss., 2006.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2007

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Die ischämische Herzerkrankung (Angina pectoris, Herzinfarkt), eine führende Todesursache in den Industrienationen, wird hauptsächlich durch Intervention an den Koronararterien mittels Ballondilatation meist in Kombination mit einer Stentimplantation behandelt. Trotz aktueller Verbesserungen im Stentdesing und dem Einsatz von medikamente-freisetzenden Stents kommt es immer noch in etwa 10 – 20 % der Interventionen, in Abhängigkeit des jeweiligen Risikoprofils, zu der Entwicklung einer Restenose. Der pathophysiologische Prozess der Neointimaentwicklung, welche der Restenoseentstehung nach Stentimplantation zu Grunde liegt, ist im Wesentlichen durch einwandernde glatte Gefässmuskelzellen (GMZ) bedingt. Eine zentrale Rolle bei der Zellwanderung nehmen alpha V Integrine ein. Um den Prozess der Restenose zu verhindern, stellen somit diese Rezeptoren und die durch sie ausgelösten Signalkaskaden einen vielversprechenden Angriffspunkt dar. Wir konnten nach Stimulation von GMZ aus Schweinen mit den EZM Proteinen Vitronektin (VN), Fibronektin (FN) und Kollagen (CN) eine verstärkte Tyrosinphosphorylierung (PTyr) v.a. eines etwa 116 kDa grossen Proteins zeigen, das mittels Immunpräzipitation als “focal adhesion kinase” (FAK) identifiziert wurde. VN stellte hierbei den stärksten Stimulus dar. Die erhöhte PTyr zeigte sich am Tyrosinrest 397 von FAK (PTyr-397), der Autophosphorylierungsstelle der Kinase, und deutet damit auf eine durch Proteinstimulation induzierte, erhöhte Aktivität von FAK hin. Die erhöhte PTyr von FAK war nicht zu beobachten, wenn die GMZ ohne spezifische Rezeptor-Ligand Interaktion auf Poly-L-Lysin adhärierten. Die Aktivierung von FAK nach Stimulation mit VN, FN und CN war dabei abhängig von alpha V Integrinen und lies sich durch Zugabe eines kompetetiven alpha V Inhibitors in einer Dosis- abhängigen Weise unterdrücken. Die Inhibition war am deutlichsten nach VN Stimulation zu beobachten. Bei Kultivierung der Zellen mit dem Inhibitor über 7 Tage in einer Konzentration von 1 µM war in der Durchlichtmikroskopie im Vergleich zu kultivierten Zellen ohne Inhibitor keine Veränderung zu erkennen. Bei 10 µM Cilengitide verkleinerte sich der Zelldurchmesser, die Zellen blieben jedoch an der Oberfläche der Zellkulturschalen adhärent. In der IF Mikroskopie zeigte sich nach 30 min eine Abnahme der intrazellulären PTyr und ein Abbau des Aktinzytoskeletts unter Einfluss von 10 µM des Inhibitors auf kultivierte adhärente GMZ. Es gab keinen Hinweis auf Induktion einer Apoptose. Auf VN und CN konnten die zuvor suspendierten GMZ gut adhärieren, während auf einer mit FN beschichteten Oberfläche die Anzahl der angehefteten Zellen im Vergleich zu einer unbeschichteten Oberfläche nicht anstieg. Die Adhäsion der GMZ auf VN konnte der Hemmstoff stark vermindern, während er auf die Adhäsion auf FN und CN keinen Einfluss hatte. Die Inhibition der Aktivierung von FAK durch den alpha V Integrininhibitor korrelierte mit der Reduktion der durch die Proteinen stimulierten Migration (Haptotaxis) der primären GMZ. Der Inhibitor führte bei einer Konzentration von 10 µM bei VN Stimulation zu einer fast vollständigen Inhibition der Haptotaxis, während er nach FN bzw. CN Stimulation die Anzahl der gewanderten Zellen bei dieser Konzentration um etwa 30 % verringerte. Die Migrationsrate wurde mit Hilfe eines modifizierten Boyden-Kammer Migrationsversuchs ermittelt. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Schlüsselrolle der alpha V Integrine in der Motilität von GMZ. Sie nehmen Einfluss auf Signalkaskaden, die von FAK abhängig sind und die Haptotaxis zu regulieren scheinen. Diese Ergebnisse machen die alpha V Integrine zu einem vielversprechenden Angriffspunkt, um eine Restenose nach Stentimplantation zu verhindern. Der Einsatz des alpha V Integrininhibitors Cilengitide, der mit einem Medikamente-freisetzenden Stent lokal an dem Ort des pathologischen Geschehens appliziert werden kann, lässt somit eine weitere Reduktion der Restenoserate erhoffen, was in einem nächsten Schritt mittels eines in vivo Modells untersucht werden muss. / Aberrant migration of smooth muscle cells (SMCs) is a key feature of restenosis after ptca. Since extracellular matrix proteins and their receptors of the integrin family play a critical role in this process, it is instrumental to understand their contibution to cell migration of SMCs on the molecular level. Therefor we investigated the role of alpha V- containing integrins expressed by porcine coronary artery smooth muscle cells (pCASMCs) in vitronectin (VN), fibronectin (FN) and collagen (CN) initiated signaling events, cell adhesion and migration. In pCASMCs alpha V containing integrins were localized at focal adhesion sites. Stimulation through VN, FN and CN led to increase in cell migration and adhesion and concomitantly to enhanced tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase. These events were attenuated by a specific alpha V inhibitor in a dose dependent manner. This inhibitor could be used for a drug eluting stent and maybe could provide an approach to prevent restenosis after ptca.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Die Hauptursache für menschliche Erkrankungen des Herz Kreislaufsystems in den westlichen Industrienationen ist die Atherosklerose. Die konventionelle minimalinvasive Therapie in der Humanmedizin ist die perkutane transluminale Angioplastie (PTA), bei der durch einen arteriellen Gefäßzugang die Stenose mittels Ballonkatheter aufgedehnt und optional eine Gefäßstütze (Stent) implantiert werden kann, um das atherosklerotische Gefäß offen zu halten. In 20 % der Fälle kommt es jedoch ein Jahr nach der Behandlung zum Gefäßwiederverschluss, der in-Stent Restenose (ISR). Einer der postulierten verantwortlichen molekularen Mechanismen ist die überschießende Monozyteninvasion, die durch die Freisetzung spezifischer Signalmoleküle, vor allem dem Monozyten-anlockenden Chemokin CCL2, ausgelöst wird. Die metabolische Stabilität von CCL2 wird durch das Enzym isoGlutaminylzyklase (isoQC) vermittelt. Diese enzymatische Modifikation ist relevant für die chemotaktische Potenz und schützt CCL2 vor einem N-terminalen Abbau durch Aminopeptidasen und der somit verbundenen Inaktivierung. Ziel dieser Arbeit war es, in einem geeigneten Tiermodell das Enzym isoQC nach Stentimplantation zu hemmen, dadurch die Konzentration von zyklisiertem CCL2 zu reduzieren und somit den potentiellen für die ISR mitverantwortlichen Wirkmechanismus der Monozyteninvasion in vivo zu darzustellen.

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A liberação local de drogas como o sirolimus, através dos stents farmacológicos, tem sido usada para prevenir e tratar a restenose intra-stent (RIS). O tratamento com sirolimus por via oral foi testado com sucesso para tratar e prevenir a RIS. Nós estudamos o efeito do sirolimus oral para prevenir e tratar a RIS nas variações de marcadores inflamatórios após o implante de stents coronários. Todos os pacientes tinham doença coronariana clinicamente manifesta. Um grupo de pacientes com alto risco para restenose inta-stent recebeu dose de ataque de 15 mg de sirolimus oral no dia anterior ao procedimento, e 5 mg por dia durante 28 dias sujeitos a ajustes semanais guiados por níveis sanguíneos. O grupo controle foi submetido a angioplastia com stents sem o tratamento com sirolimus. Os dois grupos foram seguidos por 8 semanas. As coletas foram realizadas antes da angioplastia (pré), 24 horas apos a angioplastia (24h), 1 semana, 4 semanas e 8 semanas após a angioplastia. Soro e plasma foram acondicionados a -85 °C. Análise estatística: modelo misto de medidas repetidas e análise de covariância (ANCOVA) com ajuste para os níveis basais dos marcadores. Um grupo de voluntários sadios forneceu os valores de referência para os marcadores. Os marcadores testados foram Proteína-C reativa ultra-sensível (hs-PCR), metaloproteinase 2 (MMP-2) e metaloproteinase 9 (MMP-9), inibidor tecidual de metaloproteinases-1 (TIMP-1), P-selectina, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), fração solúvel do receptor da interleucina 2 alfa (IL-2sR), interleucina 6 (IL-6) e fator estimulador de colônias de monócitos (M-CSF). No tempo basal, o grupo sirolimus teve níveis mais altos de MMP-9 e TIMP-1, e o grupo controle teve níveis maiores de ICAM-1. Durante o seguimento, a proteína C reativa atingiu o pico em 24 horas em ambos os grupos. Após ajuste para os níveis basais, houve diferença marginalmente significativa entre as variações dos grupos sirolimus e controle em 1 semana (-0.90±4.3 vs 0.03±0.3, P = 0.0726), diferença significativa em 4 semanas (-1.50±5.0 vs -0.19±0.4, P = 0.008) e marginalmente significativa em 8 semanas (-1.73±4.3 vs -0.01±0.7, P = 0.0975). Houve uma queda progressiva nos níveis de MMP-9 no grupo sirolimus, com a maior redução em 4 semanas, voltando a ter variação positiva em 8 semanas, 1 mês após a suspensão do sirolimus. Os grupos foram diferentes na primeira semana (-258.9 ± 510 vs +363 ± 438, P = 0.0030) e na quarta semana (-352.9 ± 455 vs +395.2 ± 377, P = 0.0004). Os níveis de ICAM-1 foram mais baixos no grupo sirolimus por todo o seguimento, e após ajuste para níveis basais houve diferença entre os grupos na primeira (-13.1 ± 49.7 vs -16.4 ± 119.1, P = 0.0047) e quarta semana (-3.3 ± 46.0 vs 3.8 ± 138.4, P = 0.0096). A P-selectina mostrou uma variação positiva importante na oitava semana, 1 mês após a suspensão do sirolimus, não observada no gupo controle (46.1±67.9 vs 5.8±23.7, P = 0.0025). Outros marcadores tiveram alterações apenas pontuais, e a IL-6 e o M-CSF não foram detectados pelos métodos empregados. Estes achados sugerem que a ação anti-restenótica do sirolimus oral inclui efeitos anti-proliferativos e modulação da resposta inflamatória com inibição da expressão de moléculas de adesão. / Recent findings in basic and experimental science have supported the notion that atherosclerosis is characterized by a chronic inflammatory vascular response and it is not only a bland lipid storage disease. It is also well known that coronary artery stenting is associated with both local vascular and systemic inflammation, which in turn correlate with increased in-stent restenosis after percutaneous coronary interventions. Sirolimus is an immunossupressant drug approved in the United States to prevent renal transplant rejection. Sirolimus has proved effective to prevent and treat in-stent restenosis (ISR) both with systemic administration and local administration through drug-eluting stents. We studied the effect of oral sirolimus administered to prevent and treat instent restenosis (ISR), on the variation of serum levels of inflammatory markers following coronary stenting. All patients had clinicaly manisfested ischemia. One group of patients at high risk for ISR received a loading dose of 15 mg sirolimus and 5 mg daily thereafter 28 days after stenting (SIR-G). Whole blood concentrations of sirolimus were obtained weekly and drug dose was adjusted accordingly. A control group (CONT-G) was submitted to stenting without sirolimus therapy. Both groups were followed for 8 weeks. Peripheral blood samples were obtained before the procedure (baseline), and 24h, 1 week, 4 weeks and 8 weeks after the procedure. The following biomarkers were evaluated: high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), soluble interleukin-2 receptor alpha (IL-2sRα), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), tissue inhibitor of MMP-1 (TIMP-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) P-selectin, interleukin-6 (IL-6) and Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Samples were centrifugated and serum was stored at -85°C. At baseline, SIR-G had higher levels of MMP-9 and TIMP-1 and CONT-G had higher levels of ICAM-1. At follow-up, the increase in high sensitivity C-reactive protein concentration was highest at 24 h after stenting in both SIR-G and CONT-G. After adjustment for baseline values, a marginally significant difference between the groups was observed at 1 week (-0.90±4.3 vs 0.03±0.3, P = 0.0726), which became significant at 4 weeks (-1.50±5.0 vs -0.19±0.4, P = 0.008) and lost significance 1 month after sirolimus discontinuation (-1.73±4.3 vs -0.01±0.7, P = 0.0975). A continuous fall in MMP-9 concentration was observed in SIR-G, with the greatest reduction at 4 weeks, while a positive variation was noted at week 8, 4 weeks after sirolimus discontinuation. SIR-G and CONT-G variations were different at 1 week (-258.9 ± 510 vs +363 ± 438, P = 0.0030) and 4 weeks (-352.9 ± 455 vs +395.2 ± 377, P = 0.0004). ICAM-1 levels were lower in SIR-G throughout the study. After baseline adjustment, significant differences appeared at week 1 (-13.1 ± 49.7 vs -16.4 ± 119.1, P = 0.0047) and week 4 (-3.3 ± 46.0 vs 3.8 ± 138.4, P = 0.0096). SIR-G exhibited a higher increase in P-selectin after sirolimus discontinuation at week 8 after baseline adjustment (46.1±67.9 vs 5.8±23.7, P = 0.0025). The other biomarkers presented only minor changes. The These findings suggest that the anti-restenotic actions of systemic sirolimus include anti-proliferative effects and modulation of the inflammatory response with inhibition of adhesion molecule expression. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

<p>ZIEL:<br>Untersuchung des Auftretens von In-Stent-Restenosen (ISR) nach stentgeschützter perkutaner transluminaler Angioplastie intrakranieller Stenosen.</p><p> METHODEN:<br> In diese retrospektive Langzeit-Follow-up-Studie wurden konsekutiv 46 Patienten mit insgesamt 49 intrakraniellen Stenosen eingeschlossen, die im Zeitraum von August 2003 bis Juli 2010 mittels Stentangioplastie behandelt wurden. Der Nachbeobachtungszeitraum erstreckte sich bis Februar 2011. Die Quantifizierung der Stenosen erfolgte an angiografischen Bildern. Als ISR wurde eine erneute Stenose >50% innerhalb des Stents oder unmittelbar (d.h. innerhalb von 5mm) neben dem Stent und einem absoluten Lumenverlust von >20% definiert. Die Mittelwerte der Stenosegrade zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden mit dem t-Test für abhängige Stichproben verglichen. Die ISR-freie Überlebenswahrscheinlichkeit wurde mit der Kaplan-Meier-Kurve untersucht und Kurvenvergleiche für Untergruppen erfolgten mit dem Log-Rang-Test.</p><p> ERGEBNISSE:<br> Die mediane Follow-up-Dauer betrug sieben Monate (Spannweite: ein Tag-75 Monate, Interquartilsabstand: 20,25 Monate, Mittelwert: 17,4 Monate). Zwei Patienten verstarben an peri- bzw. post-prozeduralen Komplikationen (eine intrakranielle Blutung aufgrund einer Dissektion mit einem arteriovenösen Shunt und eine Reperfusionsblutung). Sechs Patienten mit sieben behandelten Stenosen verstarben innerhalb des Beobachtungszeitraums ohne bekannte Todesursache. Es gab für 57% der Stenosen mindestens eine Bildgebung im Verlauf. Die 1-Jahres-ISR-freie Überlebenswahrscheinlichkeit für das Gesamtkollektiv lag bei 69%. Insgesamt traten acht ISR auf; sieben davon innerhalb der ersten acht Monate nach Stentplatzierung. Mittels Log-Rang-Test wurde eine signifikant niedrigere 8-Monats-ISR-freie Überlebenswahrscheinlichkeit in der Gruppe der ≤55-jährigen Patienten im Vergleich zu >55-jährigen Patienten (13% versus 79%, p=0,002) ermittelt. Für Patienten ohne eine arterielle Hypertonie resultierte eine signifikant niedrigere 7-Monats-ISR-freie Überlebenswahrscheinlichkeit und eine höhere für Patienten mit einer arteriellen Hypertonie (0% versus 81%, p=0,006). Nur zwei von acht Patienten zeigten zum Zeitpunkt der ISR-Diagnose Symptome. Die Zunahme einer ISR bis zum Gefäßverschluss bei einem Patienten mit einem angiografisch dokumentierten suffizienten Kollateralkreislauf verlief ohne Symptome.</p><p> SCHLUSSFOLGERUNG:<br> Gerade innerhalb der ersten Monate nach stentgeschützter perkutaner transluminaler Angioplastie sind engmaschige Verlaufskontrollen wichtig. Die Festsetzung der Zeitpunkte für Verlaufskontrollen sollte dabei nicht allein auf einer eventuell vorhandenen klinischen Symptomatik basieren. Möglicherweise bilden ≤55-jährige Patienten und Patienten ohne eine arterielle Hypertonie mit höherer Wahrscheinlichkeit eine ISR. ISR können im zeitlichen Verlauf sowohl zu- als auch abnehmen. Der Progress einer ISR bis zum vollständigen Gefäßverschluss kann im Fall einer ausreichenden intrakraniellen Kollateralgefäßversorgung asymptomatisch verlaufen. Somit könnte der zusätzlichen Evaluation des Kollateralstatus in der Verlaufsbeurteilung von ISR ein wichtiger Stellenwert zukommen.</p>