Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

O presente trabalho caracterizou alguns aspectos enzimáticos da digestão de vitelina e de hemoglobina no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Um novo protocolo foi desenvolvido para a purificação de uma cisteíno endopeptidase de larvas do carrapato (R. microplus Larval Cysteine Endopeptidase; RmLCE). A seqüência parcial de aminoácidos de RmLCE mostrou similaridade com outra cisteíno endopeptidase descrita neste organismo (Boophilus microplus Cathepsin -L1; BmCL1). Vitelina (Vt), preparada a partir de homogenatos de ovos e larvas de R. microplus, foi degradada diferencialmente por RmLCE e VTDCE (Vitellin-Degrading Cysteine Endopeptidase; uma enzima de atividade semelhante purificada de ovos de R. microplus). RmLCE também apresentou capacidade de degradação de hemoglobina em pH 4,0, e a presença de uma atividade cisteíno endopeptidásica acídica em intestino de larvas foi demonstrada. A atividade peptidásica total, presente em homogenatos de ovos, larvas e intestino de partenóginas, sobre substrato sintético em pH 4,0, mostrou-se diferencialmente susceptível a inibidores de cisteíno e aspártico endopeptidases (E-64 e pepstatina A, respectivamente). A ação combinada dos dois inibidores inibiu completamente a atividade peptidásica. Estes inibidores também afetaram a degradação de vitelina e hemoglobina por homogenatos de larvas e intestino de partenóginas. A presença de pepstatina A inibiu cerca de 50 % da atividade sobre hemoglobina em larvas, enquanto E-64 foi capaz de inibir completamente a degradação das proteínas por ambos os homogenatos. Um enzima com atividade aspártico endopeptidásica presente em larvas de R. microplus foi parcialmente purificada e identificada por Western blot e seqüenciamento N-terminal como Boophilus Yolk Cathepsin (BYC). Esta enzima foi eluída de uma coluna de gel-filtração em pH ácido associada a uma atividade cisteíno endopeptidásica. A degradação de hemoglobina de forma sinérgica pela aspártico endopeptidase (BYC) e a cisteíno endopeptidase (RmLCE) purificadas de larva indica a existência de uma cascata enzimática responsável pela digestão de hemoglobina. Estes resultados sugerem que RmLCE tem um papel continuo na digestão de vitelina e hemoglobina durante o desenvolvimento de R. microplus.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

O presente trabalho caracterizou alguns aspectos enzimáticos da digestão de vitelina e de hemoglobina no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Um novo protocolo foi desenvolvido para a purificação de uma cisteíno endopeptidase de larvas do carrapato (R. microplus Larval Cysteine Endopeptidase; RmLCE). A seqüência parcial de aminoácidos de RmLCE mostrou similaridade com outra cisteíno endopeptidase descrita neste organismo (Boophilus microplus Cathepsin -L1; BmCL1). Vitelina (Vt), preparada a partir de homogenatos de ovos e larvas de R. microplus, foi degradada diferencialmente por RmLCE e VTDCE (Vitellin-Degrading Cysteine Endopeptidase; uma enzima de atividade semelhante purificada de ovos de R. microplus). RmLCE também apresentou capacidade de degradação de hemoglobina em pH 4,0, e a presença de uma atividade cisteíno endopeptidásica acídica em intestino de larvas foi demonstrada. A atividade peptidásica total, presente em homogenatos de ovos, larvas e intestino de partenóginas, sobre substrato sintético em pH 4,0, mostrou-se diferencialmente susceptível a inibidores de cisteíno e aspártico endopeptidases (E-64 e pepstatina A, respectivamente). A ação combinada dos dois inibidores inibiu completamente a atividade peptidásica. Estes inibidores também afetaram a degradação de vitelina e hemoglobina por homogenatos de larvas e intestino de partenóginas. A presença de pepstatina A inibiu cerca de 50 % da atividade sobre hemoglobina em larvas, enquanto E-64 foi capaz de inibir completamente a degradação das proteínas por ambos os homogenatos. Um enzima com atividade aspártico endopeptidásica presente em larvas de R. microplus foi parcialmente purificada e identificada por Western blot e seqüenciamento N-terminal como Boophilus Yolk Cathepsin (BYC). Esta enzima foi eluída de uma coluna de gel-filtração em pH ácido associada a uma atividade cisteíno endopeptidásica. A degradação de hemoglobina de forma sinérgica pela aspártico endopeptidase (BYC) e a cisteíno endopeptidase (RmLCE) purificadas de larva indica a existência de uma cascata enzimática responsável pela digestão de hemoglobina. Estes resultados sugerem que RmLCE tem um papel continuo na digestão de vitelina e hemoglobina durante o desenvolvimento de R. microplus.

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

O presente trabalho caracterizou alguns aspectos enzimáticos da digestão de vitelina e de hemoglobina no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Um novo protocolo foi desenvolvido para a purificação de uma cisteíno endopeptidase de larvas do carrapato (R. microplus Larval Cysteine Endopeptidase; RmLCE). A seqüência parcial de aminoácidos de RmLCE mostrou similaridade com outra cisteíno endopeptidase descrita neste organismo (Boophilus microplus Cathepsin -L1; BmCL1). Vitelina (Vt), preparada a partir de homogenatos de ovos e larvas de R. microplus, foi degradada diferencialmente por RmLCE e VTDCE (Vitellin-Degrading Cysteine Endopeptidase; uma enzima de atividade semelhante purificada de ovos de R. microplus). RmLCE também apresentou capacidade de degradação de hemoglobina em pH 4,0, e a presença de uma atividade cisteíno endopeptidásica acídica em intestino de larvas foi demonstrada. A atividade peptidásica total, presente em homogenatos de ovos, larvas e intestino de partenóginas, sobre substrato sintético em pH 4,0, mostrou-se diferencialmente susceptível a inibidores de cisteíno e aspártico endopeptidases (E-64 e pepstatina A, respectivamente). A ação combinada dos dois inibidores inibiu completamente a atividade peptidásica. Estes inibidores também afetaram a degradação de vitelina e hemoglobina por homogenatos de larvas e intestino de partenóginas. A presença de pepstatina A inibiu cerca de 50 % da atividade sobre hemoglobina em larvas, enquanto E-64 foi capaz de inibir completamente a degradação das proteínas por ambos os homogenatos. Um enzima com atividade aspártico endopeptidásica presente em larvas de R. microplus foi parcialmente purificada e identificada por Western blot e seqüenciamento N-terminal como Boophilus Yolk Cathepsin (BYC). Esta enzima foi eluída de uma coluna de gel-filtração em pH ácido associada a uma atividade cisteíno endopeptidásica. A degradação de hemoglobina de forma sinérgica pela aspártico endopeptidase (BYC) e a cisteíno endopeptidase (RmLCE) purificadas de larva indica a existência de uma cascata enzimática responsável pela digestão de hemoglobina. Estes resultados sugerem que RmLCE tem um papel continuo na digestão de vitelina e hemoglobina durante o desenvolvimento de R. microplus.

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

Carrapatos são parasitas hematófagos que secretam, em sua saliva, componentes imunomoduladores capazes de promover sua alimentação e suprimir as respostas imunológicas do hospedeiro. Dentre as classes de imunomoduladores presentes na saliva, encontram-se as evasinas, proteínas com capacidade de ligarem-se a quimiocinas, inibindo sua atividade relacionada ao recrutamento de células imunes. Neste trabalho, nós descrevemos a produção recombinante e caracterização estrutural e funcional de uma nova evasina putativa, a proteína Bm-nr-264079, identificada no sialotranscriptoma do carrapato bovino R. microplus. Observamos que a proteína Bm-nr-264079 apresenta similaridade estrutural com outras evasinas de carrapatos Rhipicephalus sanguineus já caracterizadas. A proteína foi produzida na forma recombinante com sucesso a partir da expressão em Escherichia coli Rosetta e purificação em condição desnaturante por cromatografia de afinidade a metais. Esta proteína apresentou atividade inibitória sobre o desenvolvimento de psoríase em modelo animal, limitando o desenvolvimento de lesão local nos animais tratados após a indução da doença por aplicação de imiquimode. A proteína Bm-nr- 264079 não apresentou efeito inibidor do crescimento de Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis, bactérias que comumente colonizam a pele de bovinos suscetíveis à infestação por R. microplus. Os resultados aqui apresentados demonstram que a proteína Bm-nr-264079, em sua forma recombinante, apresenta atividade inibidora da inflamação, com potencial atividade de evasina. Novos estudos são necessários para uma caracterização mais específica das possíveis atividades farmacológicas desta proteína / Ticks are hematophagous parasites that secrete, in their saliva, immunomodulatory components capable of promoting their feeding and suppressing the immune responses of the host. Among the classes of immunomodulators present in saliva, we have the evasins, proteins capable of binding to chemokines, inhibiting the recruitment of immune cells. In this work, we describe the recombinant production and structural and functional characterization of a novel putative evasin, the protein Bm-nr-264079, identified in the sialotranscriptome of the R. microplus cattle tick. We have found that the protein Bm-nr-264079 shows structural similarity to other already characterized Rhipicephalus sanguineus tick evasins. The protein was successfully produced with expression in Escherichia coli Rosetta and purification in denaturing condition by metal affinity chromatography. This protein showed inhibitory activity on the development of psoriasis in the animal model, limiting the development of local lesion in the treated animals after the induction of the disease by the application of imiquimod. The protein Bm-nr-264079 showed no inhibitory effect on the growth of Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis, bacteria that commonly colonize the skin of cattle susceptible to R. microplus infestations. The results presented herein demonstrate that Bm-nr-264079, in its recombinant form, exhibits antiinflammatory activity with potential evasin activity. Further studies are needed to characterize more specifically the pharmacological activities of this protein