• Refine Query
  • Source
  • Publication year
  • to
  • Language
  • 91
  • 3
  • 1
  • Tagged with
  • 95
  • 95
  • 21
  • 21
  • 18
  • 17
  • 16
  • 15
  • 14
  • 10
  • 9
  • 9
  • 9
  • 9
  • 8
  • About
  • The Global ETD Search service is a free service for researchers to find electronic theses and dissertations. This service is provided by the Networked Digital Library of Theses and Dissertations.
    Our metadata is collected from universities around the world. If you manage a university/consortium/country archive and want to be added, details can be found on the NDLTD website.
31

Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
32

Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.
33

Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
34

Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.
35

Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.
36

Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
37

Atividade acaricida, inibi??o da acetilcolinesterase e an?lise qu?mica de res?duos agroindustriais

Bispo, Jorge Luiz Peixoto 27 April 2018 (has links)
Submitted by Verena Pereira (verenagoncalves@uefs.br) on 2018-07-12T21:46:04Z No. of bitstreams: 1 JORGE LUIZ PEIXOTO BISPO.pdf: 1928389 bytes, checksum: 3d95674032c8b830a0db8b942fc740ae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T21:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JORGE LUIZ PEIXOTO BISPO.pdf: 1928389 bytes, checksum: 3d95674032c8b830a0db8b942fc740ae (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / The aim of this study was to analyze the in vitro efficacy of crude extracts of agroindustrial residues obtained from fruits against engorged females of Rhipicephalus microplus, using the adult immersion test. The first chapter gathers studies about the fruits used in this study and the bovine ectoparasites of economic importance. In the second chapter, the fruit residues of Spondias mombin, Tamarindus indica, Genipa americana and Citrus latifolia were submitted to maceration with ethanol to obtain the extracts. Engorged females were collected for acaricidal evaluation. The treatments consisted of six groups with extracts at 50 mg mL-1 concentration and two control groups (positive: fipronil and negative: 70 % ethanol). The extract of S. mombin fruit peel showed an acaricidal efficiency of 96.37 %. In order to investigate the mechanism of acaricide action, the in vitro effect of the extracts against acetylcholinesterase was evaluated and only the extract of the bagasse of C. latifolia showed a correlation with the acaricide effect. The extracts were monitored by high performance liquid chromatography and identified derivatives of phenolic compounds. In the third chapter, the fruit extract of S. mombin presented an acaricidal efficacy of 98.4 % at a concentration of 12.5 mg mL-1 and larvicidal efficacy of 84.8 % at a concentration of 25 mg mL-1. After fractionation of the S. mombin extract, the fraction with the major inhibition potential of the acetylcholinesterase enzyme was identified. The active fraction was analyzed by gas chromatography and a mixture of unsaturated fatty acids and terpenoids were identified, which act synergistically in the acaricidal action / O presente trabalho teve como objetivo analisar a efic?cia in vitro dos extratos bruto de res?duos agroindustriais contra f?meas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, utilizando o teste de imers?o de adultos. O primeiro cap?tulo re?ne estudos sobre os frutos utilizados neste trabalho e os ectoparasitos bovinos de import?ncia econ?mica. No segundo cap?tulo, os res?duos dos frutos de Spondias mombin, Tamarindus indica, Genipa americana e Citrus latifolia foram submetidos a macera??o com etanol para obten??o dos extratos. F?meas ingurgitadas foram coletadas para avalia??o acaricida. Os tratamentos foram constitu?dos por seis grupos com extratos na concentra??o 50 mg mL-1 e dois grupos controles (positivo: fipronil; e negativo: etanol 70 %). O extrato da casca do fruto de S. mombin apresentou efic?cia de 96,37 %. Com o intuito de investigar o mecanismo de a??o acaricida, foi avaliado o efeito in vitro dos extratos frente a acetilcolinesterase e apenas o extrato do baga?o de C. latifolia apresentou correla??o com o efeito acaricida. Os extratos foram monitorados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia e identificado derivados de compostos fen?licos. No terceiro cap?tulo o extrato da casca do fruto de S. mombin apresentou uma efic?cia acaricida de 98,4 % a uma concentra??o de 12,5 mg mL-1 e efic?cia larvicida de 84,8 % a uma concentra??o 25 mg mL-1. Ap?s o fracionamento do extrato de S. mombin, foi identificada a fra??o com maior potencial de inibi??o da enzima acetilcolinesterase. A fra??o ativa foi analisada por cromatografia gasosa e identificou-se mistura de ?cidos graxos insaturados e terpen?ides, que agem sinergicamente na a??o acaricida
38

Caracterização molecular da resistência de populações do carrapato dos bovinos do estado de Minas Gerais às principais bases químicas carrapaticidas

Faza, Aline Pasqualini 05 February 2013 (has links)
Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-03-01T11:26:21Z No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-03-03T14:35:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T14:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) Previous issue date: 2013-02-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O monitoramento da resistência de populações do carrapato dos bovinos às bases químicas em uso tem se limitado ao perfil fenotípico, havendo escassez de registros abordando perfil genotípico da resistência para carrapaticidas no Brasil. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo efetuar a caracterização molecular e traçar perfil genético da resistência de populações de Rhipicephalus microplus aos grupos químicos dos organofosforados e piretroides. Para tal, foram genotipadas larvas constituintes de 893 populações (587 para piretroides e 306 para organofosforados) do carrapato dos bovinos, utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase. Foi constatado que 75,49 e 97,44% das amostras processadas apresentavam resistência para organofosforados e piretroides, respectivamente. Entre as populações resistentes a piretroides, verificou-se que 91,9% são heterozigotas, evidenciando que a maior parte das populações resistentes apresenta apenas um alelo responsável pela resistência. Assim, é possível concluir que as populações genotipadas provenientes do estado de Minas Gerais, apresentam alto grau de resistência aos organofosforados e principalmente aos piretroides. Estas informações são fundamentais para melhor compreensão dos mecanismos de resistência de R. microplus aos carrapaticidas, o que pode contribuir para aprimorar técnicas de controle. / The monitoring of the resistance of cattle tick populations in Brazil to the chemical bases in use is largely limited to investigation of the phenotypic profile. There are few studies investigating the role played by the genotypic profile in acaricide resistance in the country. Therefore, the aim of the present study was to carry out molecular characterization and trace out the genetic profile of populations of Rhipicephalus microplus with respect to resistance to the organophosphate and pyrethroid chemical groups. For that purpose, were genotyped larvae belonging to 893 populations (587 for pyrethroids and 306 for organophosphates), using the polymerase chain reaction technique. It was found that 75.49% and 97.44% of the samples studied showed resistance to the organophosphates and pyrethroids, respectively. Among the populations resistant to pyrethroids, 91.9% were heterozygotes, showing that most of the resistant populations have only one allele responsible for resistance. Therefore, it is possible to conclude that the genotyped populations have high resistance to organophosphates, and even more so to pyrethroids. This information are fundamental to understanding the mechanisms of resistance of R. microplus to acaricides, which can help to improve control techniques.
39

Atividade anticoagulante da catepsina L-like protease BmCL1 do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Xavier, Marina Amaral January 2016 (has links)
Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.
40

Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

Page generated in 0.0934 seconds