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Estudos estrutura-função de fosfolipases 'A IND. 2' D49 e K49 homologa isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma : analise comparativa estrutural e biologica / Studies structure-function of phospholiphse 'A IND. 2' D49 and K49 homologue purified from Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma : analyse comparative structure and functionBonfim, Vera Lucia 25 February 2008 (has links)
Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2008 / Resumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamente / Abstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular
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Efeito da L- aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) na indução de apoptose e modulação de microRNAs em células Bcr-Abl positivas / L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) apoptosis induction and microRNAs modulation effect on Bcr-Abl positive cellsBurin, Sandra Mara 23 October 2015 (has links)
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.
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Caracterização funcional e estudo dos mecanismos de resposta ao dano celular causado por uma L-aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma em linhagens celulares humanas / Functional characterization and study of the mechanisms of response to the cellular damage caused by an L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostoma in human cell linesCosta, Tássia Rafaella 05 December 2014 (has links)
As L-aminoácido oxidases (LAAOs) isoladas de peçonhas de serpentes são alvos de um grande número de pesquisas devido às suas inúmeras ações biológicas e farmacológicas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente a Laminoácido oxidase da peçonha de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) por meio das atividades: bactericida, fungicida, leishmanicida, tripanomicida, citotóxica, inflamatória e análise da expressão de genes e proteínas apoptóticas. A CR-LAAO mostrou-se altamente citotóxica sobre as células tumorais HepG2 e HL-60, promovendo cerca de 80% de morte celular na maior concentração testada (100 ?g/mL) e apresentou baixa toxicidade sobre células PBMC. Foi possível observar que a proteína induziu apoptose (AV+) em PBMC. Em HepG2, as menores concentrações (0,1-2,5 ?g/mL) causaram apoptose (AV+), e as maiores (5-100 ?g/mL) causaram apoptose/necrose (PI+/AV+). Em HL-60, as concentrações testadas (0,1-100 ?g/mL) induziram apoptose/necrose (PI+/AV+). A expressão do gene FAS e ativação das caspases 8 e 3 determinou a ativação da via extrínseca da apoptose na linhagem HL-60. A CR-LAAO promoveu algumas alterações na modulação do ciclo celular, sendo que nas linhagens tumorais os atrasos se concentraram nas fases G0/G1 e S do ciclo celular. Ademais, a CR-LAAO mostrouse bactericida contra as cepas S. aureus e E. coli, com maior especificidade para a cepa gram-positiva (S. aureus). Em análises de microscopia de transmissão, foi possível observar um desmantelamento da parede celular bacteriana. Após 6h de pré-incubação com C. albicans, a CR-LAAO foi capaz de inibir 80% do crescimento da levedura. A CR-LAAO mostrou-se também um bom agente leishmanicida contra as espécies L. infantum chagasi (IC50=16,66 ?g/mL) e L. braziliensis (IC50=24,47 ?g/mL) e inibiu o crescimento da forma promastigota do Trypanosoma cruzi (IC50=196,8 ?g/mL). Testes in vivo revelaram que a CR-LAAO promoveu inflamação local aguda, recrutando células inflamatórias como neutrófilos e induzindo a formação de citocinas (IL-6 e IL-1?) e mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2). Os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta potencial biotecnológico evidente, com efeitos antiparasitários, fungicida, bactericida, bem como atividade antitumoral in vitro. Dessa forma, os resultados obtidos para a CR-LAAO fornecem subsídios importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de ação direcionada, como quimioterápicos e antimicrobianos mais eficazes. / L-amino acid oxidases (LAAOs) isolated from snake venoms are targets of a large number of researches due to their numerous biological and pharmacological actions. The objective of this study was to functionally characterize the L-amino acid oxidase from the venom of Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) through the activities: bactericidal, fungicidal, leishmanicidal, trypanocidal, cytotoxic, inflammatory and analysis of gene expression and apoptotic proteins. CR-LAAO showed high cytotoxicity in HepG2 and HL-60 tumor cells, inducing about 80% cell death at the highest concentration tested (100 ?g/mL) and showing low toxicity in PBMC cells. It was observed that the protein induced apoptosis (AV+) in PBMC. In HepG2, lower concentrations (0.1-2.5 ?g/mL) caused apoptosis (AV+), while major concentrations (5-100 ?g/mL) caused apoptosis/necrosis (PI+/AV+). In HL-60, the concentrations tested (0.1-100 ?g/mL) induced apoptosis/necrosis (PI+/AV+). The FAS gene expression and activation of caspases 8 and 3 determined the activation of the extrinsic pathway of apoptosis in HL-60 cells. CR- LAAO promoted some changes in the modulation of the cell cycle, and delays in tumor cell lines were concentrated in G0/G1 and S cell cycle phases. In addition, CR-LAAO proved to be bactericidal against S. aureus and E. coli strains, with higher specificity for Gram-positive strains (S. aureus). In analyses of transmission electron microscopy, it was possible to observe a dismantling of the bacterial cell wall. After 6 hours of preincubation with C. albicans, CR-LAAO was able to inhibit 80% of growth of yeast. CR-LAAO also showed antiparasite potential against species L. chagasi infantum (IC50 = 16.66 ?g/mL) and L. braziliensis (IC50 = 24.47 ?g/mL) and inhibited the growth of Trypanosoma cruzi promastigote form (IC50 = 196.8 ?g/mL). In vivo tests revealed that CR-LAAO promotes acute local inflammation by recruiting inflammatory cells as neutrophils and by inducing the production of cytokines (IL-6 and IL-1?) and lipid mediators (PGE2 and LTB4). The results suggest that CR-LAAO presents evident biotechnological potential, with antiparasite, fungicidal, bactericidal and antitumor effects in vitro. Thus, the results obtained for CR-LAAO provide important information for the development of therapeutic strategies with directed action, such as more effective chemotherapeutic and antimicrobial agents.
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Caracterização funcional e estudo dos mecanismos de resposta ao dano celular causado por uma L-aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma em linhagens celulares humanas / Functional characterization and study of the mechanisms of response to the cellular damage caused by an L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostoma in human cell linesTássia Rafaella Costa 05 December 2014 (has links)
As L-aminoácido oxidases (LAAOs) isoladas de peçonhas de serpentes são alvos de um grande número de pesquisas devido às suas inúmeras ações biológicas e farmacológicas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente a Laminoácido oxidase da peçonha de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) por meio das atividades: bactericida, fungicida, leishmanicida, tripanomicida, citotóxica, inflamatória e análise da expressão de genes e proteínas apoptóticas. A CR-LAAO mostrou-se altamente citotóxica sobre as células tumorais HepG2 e HL-60, promovendo cerca de 80% de morte celular na maior concentração testada (100 ?g/mL) e apresentou baixa toxicidade sobre células PBMC. Foi possível observar que a proteína induziu apoptose (AV+) em PBMC. Em HepG2, as menores concentrações (0,1-2,5 ?g/mL) causaram apoptose (AV+), e as maiores (5-100 ?g/mL) causaram apoptose/necrose (PI+/AV+). Em HL-60, as concentrações testadas (0,1-100 ?g/mL) induziram apoptose/necrose (PI+/AV+). A expressão do gene FAS e ativação das caspases 8 e 3 determinou a ativação da via extrínseca da apoptose na linhagem HL-60. A CR-LAAO promoveu algumas alterações na modulação do ciclo celular, sendo que nas linhagens tumorais os atrasos se concentraram nas fases G0/G1 e S do ciclo celular. Ademais, a CR-LAAO mostrouse bactericida contra as cepas S. aureus e E. coli, com maior especificidade para a cepa gram-positiva (S. aureus). Em análises de microscopia de transmissão, foi possível observar um desmantelamento da parede celular bacteriana. Após 6h de pré-incubação com C. albicans, a CR-LAAO foi capaz de inibir 80% do crescimento da levedura. A CR-LAAO mostrou-se também um bom agente leishmanicida contra as espécies L. infantum chagasi (IC50=16,66 ?g/mL) e L. braziliensis (IC50=24,47 ?g/mL) e inibiu o crescimento da forma promastigota do Trypanosoma cruzi (IC50=196,8 ?g/mL). Testes in vivo revelaram que a CR-LAAO promoveu inflamação local aguda, recrutando células inflamatórias como neutrófilos e induzindo a formação de citocinas (IL-6 e IL-1?) e mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2). Os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta potencial biotecnológico evidente, com efeitos antiparasitários, fungicida, bactericida, bem como atividade antitumoral in vitro. Dessa forma, os resultados obtidos para a CR-LAAO fornecem subsídios importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de ação direcionada, como quimioterápicos e antimicrobianos mais eficazes. / L-amino acid oxidases (LAAOs) isolated from snake venoms are targets of a large number of researches due to their numerous biological and pharmacological actions. The objective of this study was to functionally characterize the L-amino acid oxidase from the venom of Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) through the activities: bactericidal, fungicidal, leishmanicidal, trypanocidal, cytotoxic, inflammatory and analysis of gene expression and apoptotic proteins. CR-LAAO showed high cytotoxicity in HepG2 and HL-60 tumor cells, inducing about 80% cell death at the highest concentration tested (100 ?g/mL) and showing low toxicity in PBMC cells. It was observed that the protein induced apoptosis (AV+) in PBMC. In HepG2, lower concentrations (0.1-2.5 ?g/mL) caused apoptosis (AV+), while major concentrations (5-100 ?g/mL) caused apoptosis/necrosis (PI+/AV+). In HL-60, the concentrations tested (0.1-100 ?g/mL) induced apoptosis/necrosis (PI+/AV+). The FAS gene expression and activation of caspases 8 and 3 determined the activation of the extrinsic pathway of apoptosis in HL-60 cells. CR- LAAO promoted some changes in the modulation of the cell cycle, and delays in tumor cell lines were concentrated in G0/G1 and S cell cycle phases. In addition, CR-LAAO proved to be bactericidal against S. aureus and E. coli strains, with higher specificity for Gram-positive strains (S. aureus). In analyses of transmission electron microscopy, it was possible to observe a dismantling of the bacterial cell wall. After 6 hours of preincubation with C. albicans, CR-LAAO was able to inhibit 80% of growth of yeast. CR-LAAO also showed antiparasite potential against species L. chagasi infantum (IC50 = 16.66 ?g/mL) and L. braziliensis (IC50 = 24.47 ?g/mL) and inhibited the growth of Trypanosoma cruzi promastigote form (IC50 = 196.8 ?g/mL). In vivo tests revealed that CR-LAAO promotes acute local inflammation by recruiting inflammatory cells as neutrophils and by inducing the production of cytokines (IL-6 and IL-1?) and lipid mediators (PGE2 and LTB4). The results suggest that CR-LAAO presents evident biotechnological potential, with antiparasite, fungicidal, bactericidal and antitumor effects in vitro. Thus, the results obtained for CR-LAAO provide important information for the development of therapeutic strategies with directed action, such as more effective chemotherapeutic and antimicrobial agents.
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Efeito da L- aminoácido oxidase de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) na indução de apoptose e modulação de microRNAs em células Bcr-Abl positivas / L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) apoptosis induction and microRNAs modulation effect on Bcr-Abl positive cellsSandra Mara Burin 23 October 2015 (has links)
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.
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