Orientador: Adriana Zerlotti Mercadante / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T11:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Squina_FabioMarcio_M.pdf: 21730351 bytes, checksum: a93d531f3b4f081de1a75a819883dd6a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Os carotenóides compõem um grupo de pigmentos naturais amplamente distribuídos na natureza com grande diversidade de estruturas e funções. O interesse pelos carotenóides tem aumentado onsideravelmente nos últimos anos, havendo uma potencial demanda por fontes naturais destes compostos nas indústrias de alimentos, farmacêutica e cosmética. As principais fontes industriais de carotenóides são a síntese química e a extração a partir de plantas, porém são poucos os carotenóides que possuem métodos economicamente eficientes de produção. Atualmente, apesar do pequeno número de carotenóides produzidos por biossíntese microbiana, esforços têm sido direcionados no desenvolvimento de processos biotecnológicos para a sua produção. Os carotenóides em microrganismos estão localizados intracelularmente, portanto além de uma elevada quantidade de carotenóides, os organismos selecionados para o desenvolvimento de processos biotecnológicos devem apresentar outras possibilidades, como o cultivo em resíduos ou substratos de baixo custo, produção de carotenóides com alto valor agregado, ou de outros compostos de interesse comercial, como ácidos graxas insaturados ou polissacarídeos. A primeira etapa deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia para extração e separação dos carotenóides de Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. araucariae, R. minuta e R. lactosa. Dos métodos de extração testados, a utilização de areia tratada como agente abrasivo para o rompimento da parede celular e liberação dos carotenóides, apresentou grande eficiência ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

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The presented diploma thesis deals with the analysis and production of selected microbial metabolites of the yeast Rhodotorula kratochvilovae in comparison to various species of microalgae. The theoretical part summarizes the knowledge about the conditions for optimal growth and production of secondary metabolites. Analytical methods, by which metabolites were quantified and evaluated, were also described. In the experimental part of this thesis, the amount of accumulated biomass, exoglycolipids, intracellular lipids, phycobiliproteins and carotenoids according to various nutrient sources in the culture medium was studied. Specifically, the yields of these metabolites were investigated in the utilization of various sources of nitrogen (yeast extract, urea, ammonium sulfate, ammonium chloride and potassium nitrate), carbon (glucose, mannose, xylose, glycerol and lactose) and at variable C / N ratios (20; 40; 70; 100 and 120: 1) ideally selected sources of observed nutrients in partial experiments. The last part of the experiment was focused on comparison of the analysis of metabolites of autotrophic algae (chlorophylls, phycobiliproteins and lipids).

Diploma thesis was aimed at studying of lipolytic activity of seven microorganisms, at which this activity was previously assumed or already confirmed. Theoretical part deals with the general characteristics of lipoyltic enzymes, specifics of microbial lipases and their industrial application, with an emphasis on food industry. Experimental part deals with the study of seven microorganisms and their lipolytic activity at the presence of a carbohydrate (glucose) or a lipid (canola oil) or both, as a source of carbon. For further testing were singled out Rhodotorula minuta nad Yarrowia lipolytica. This yeasts were subsequently tested for lipolytic aktivity at the presence of different vegetable oils (olive, sunflower, canola oil and waste cooking oil), nitrogen sources of organic and inorganic origin (urea, yeast extract, amonnium chloride, amonnium sulfate) and also a addition of detergent, which is commonly used in food industry or other food facilities.

The growth of Rhodotorula glutinis in sweet sorghum juice in three levels of three factors of temperature, carbon to nitrogen ratio and pH was evaluated. Accompanying of this growth was the generation of lipids converted to fatty acid methyl ester (FAMEs) and carotenoids. The optimized condition for maximum biomass and carotenoid accumulation was determined to be at 25C, pH of 5.5 and carbon to nitrogen ratio of 10. This condition yielded 22.7 g/L biomass with specific growth rate of 0.213 hr-1. At this condition the carotenoids generation was also maximum with 2.6 mg/gram biomass, comprising of torularhodin, beta-carotene and torulene. The accumulation of lipids following generation of biodiesel was highest at same temperature and pH but carbon to nitrogen ratio of 70, generating 96.3 mg of FAMEs/gram of biomass containing methyl ester of oleic acid, linoleic acid, palmitic acid, stearic acid and linolenic acid.

Producing biodiesel from triacylglycerol (TAG) generates glycerol as a byproduct which could be recycled and used to grow the oleaginous yeast Rhodotorula glutinis. R. glutinis has the ability to produce up to 70% of its weight in the form of TAG. This study is designed to determine the effects of glycerol on the TAG and fatty acids produced by R. glutinis. After 24 hrs, R. glutinis cultured on medium containing dextrose, xylose, glycerol, dextrose and xylose, xylose and glycerol, or dextrose and glycerol accumulated 16, 12, 25, 10, 21, and 34% TAG on a dry weight basis, respectively. The fatty acids derived from R. glutinis were mostly saturated, however, cells cultivated on glycerol alone had the highest degree of unsaturated fatty acids (53%). Growth on dextrose may be enhanced by the addition of glycerol, but it cannot be determined if using glycerol as a secondary carbon substrate enhances lipid production.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nos últimos anos o mercado de enzimas tem crescido muito devido a sua utilização em reações específicas importantes para diversos setores industriais. Os micro-organismos, em especial, as leveduras são capazes de produzir uma ampla variedade de enzimas, e assim, tornam-se cada vez mais interessantes para estudos da utilização dos seus compostos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de produção de enzimas hidrolíticas por leveduras isoladas de solos do Parque Nacional do Viruá e Campus Cauamé, em Roraima. O processo de isolamento permitiu quantificar 6,4x106 UFC/g, contabilizadas em 883 colônias, agrupadas em 11 morfotipos, e identificadas dentro de quatro gêneros: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula e Yarrowia. Foram identificados Cryptococcus podzolicus, Candida pseudointermedia e Rhodotorula mucilaginosa; cinco isolados foram identificados como novas espécies, sendo quatro Yarrowia sp. e uma Candida sp., que estão em fase de descrição. Os isolados testados não produziram amilase e celulase pelos testes utilizados. A produção qualitativa de lipase foi observada em 36% dos isolados, representados por Yarrowia spp. (VR546, VR547, VR571 e VR572). A protease foi produzida por cerca de 90% dos isolados: Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 e VR558), Candida sp. (VR533), Candida pseudointermedia (VR544 e VR545) e Yarrowia sp. (VR546, VR547, VR571 e VR572). Três isolados de Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 e VR558) produziram xilanase e pectinase. O potencial multienzimático foi observado em 63% dos isolados, representados por Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 e VR558) e Yarrowia sp. (VR546, VR547, VR571 e VR572). Os resultados alcançados nesta pesquisa corroboram a importância das áreas protegidas como fontes de novas espécies, inclusive com especial interesse para a Biotecnologia. / In recent years the market for enzymes has grown a lot due to their use in specific reactions important for several industrial sectors. The micro-organisms, in particular, the yeasts are able to produce a wide variety of enzymes, and so, become ever more interesting for studies the use of your compounds. This work aimed to assess the capacity of production of hydrolytic enzymes by yeasts isolated from soils of the Viruá National Park and the Campus of Cauamé, in Roraima. The isolation process allowed to quantify 6,4x106 UFC/g, grouped into 11 morphtypes, and identified within four genuses: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula and Yarrowia. Were identified Cryptococcus podzolicus, Candida pseudointermedia and Rhodotorula mucilaginosa; five isolates have been identified as new species, being four Yarrowia sp and one Candida sp, which are undergoing description. The isolates tested did not produce amylase and cellulase by tests used. Qualitative lipase production was observed in 36 % of the isolates, represented by Yarrowia spp. (VR546, VR547, VR571 e VR572). The protease was produced about 90% of the isolates: Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 and VR558), Candida sp. (VR533), Candida pseudointermedia (VR544 and VR545) and Yarrowia sp. (VR546, VR547, VR571 and VR572).Three isolates of Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 and VR558) produced xilanase e pectinase. The multienzymatic potential was observed in 63 % of the isolates, represented by Cryptococcus podzolicus (VR520, VR535 and VR558) and Yarrowia SP. (VR546, VR 547, VR571 and VR572). The results of this study confirm the importance of protected areas as sources of new species, including with special interest for biotechnology.

Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Micro-organismos oriundos de ecossistemas restritivos e pouco explorados como o continente Antártico têm despertado grande interesse na comunidade científica, visto que pesquisas biotecnológicas podem resultar em produtos de alto valor agregado. Dentre estes produtos, enzimas de psicrófilos ou psicrotolerantes, que apresentam alta atividade catalítica aliada à flexibilidade, estimulam a busca de condições que favoreçam a sua produção. Assim, as proteases se destacam neste universo, visto que respondem por cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi o de selecionar, dentre os isolados de diferentes amostras do continente Antártico, leveduras produtoras destas enzimas, bem como de estabelecer condições de cultivo laboratorial para o favorecimento da atividade proteolítica. Foram utilizadas 99 leveduras previamente isoladas na Divisão de Recursos Microbianos da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria da UNICAMP, das quais 14,14% (n= 14) foram selecionadas como produtoras de proteases por meio de ensaios em placas contendo ágar Sabouraud com leite desnatado (10%). O perfil da atividade proteolítica extracelular, o crescimento e o consumo de açúcar das leveduras selecionadas foram avaliados a partir do cultivo das mesmas em caldo Sabouraud, pH 5,5, a 150rpm, a 25°C por 120h. Todos os isolados selecionados mostraram alguma atividade proteolítica em meio líquido. A levedura Rhodotorula mucilaginosa L07 foi então selecionada para a etapa seguinte, em função da máxima atividade proteolítica (33,36 U.mL-1) observada em meio líquido. Para avaliar o impacto da suplementação do meio de cultivo e da variação de parâmetros físico-químicos sobre a atividade proteolítica desta levedura, e ainda visando o favorecimento da produção de proteases, foi utilizado o planejamento fatorial fracionado 26-2, seguido de planejamento fatorial completo (DCCR 23). Os resultados obtidos permitiram estabelecer um modelo matemático que foi validado, elevando a atividade proteolítica inicial em 45,53%. A caracterização da protease produzida por R. mucilaginosa L07 revelou seu caráter ácido, cuja máxima atividade (71,14 U.ml-1) foi obtida em pH 5,0 a 50°C. Verificou-se ainda que 70% da atividade proteolítica foi conservada quando os ensaios foram realizados a 37°C e 80% em 45 e 60°C. Esta enzima mostrou-se altamente estável após incubação por 1h em temperaturas até 50°C, verificando-se a manutenção da atividade proteolítica. Estas características combinadas com a atividade proteolítica sugerem que esta protease exibe potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos. / Microorganisms from restrictive and unexplored ecosystems as the Antarctic continent have been of great interest in the scientific community, because they can synthesize biotechnological products with high added value. Among these products, psychrotolerants or psychrophilic enzymes, which present high activity coupled with flexibility, stimulates the studies regarding to optimize conditions in order to favor their production. Proteases are highlighted in this universe, because that account for about 60 % of the enzymes world market. In this context, the aim of this work was to select among microorganisms strains isolated from Antarctica, specifically protease-producing yeast, as well as establishing its growth conditions at laboratory scale focusing on its proteolytic activity. Ninety-nine previously isolated yeasts (DRM CPQBA / UNICAMP), from different samples of the Antarctic continent were evaluated and 14,14% (n = 14) were selected as protease producers in Sabouraud Agar containing skim milk (10%). The profile of the extracellular proteolytic activity, growth conditions and sugar consumption by selected yeast strains was reported in Sabouraud broth at pH 5.5, agitation rate of 150 rpm, 25 ° C for 120h. The results showed that all selected strains presented proteolytic activity. The maximum activity values was observed with Rhodotorula mucilaginosa L07 (33,36 U.mL-1), which was selected to continue the experiments. In the next step it was studied the effect of nutrients supplementation of the culture medium and the variation of physicochemical parameters on the proteolytic activity of R. mucilaginosa L07 by using an experimental design consisting of 26-2 fractional factorial followed by a full factorial design (CCRD 23). The results obtained allowed to stablish a mathematical model, which was validated, allowing the increase of the initial proteolytic activity in 45.53%. Characterization of protease produced by R. mucilaginosa L07 showed an acid character, and a maximum activity of 71.14 U.ml-1 was obtained at pH 5.0 at 50°C. It was also found that 70% of the proteolytic activity was preserved when the assays were performed at 37°C and 80% at 45 and 60°C. This enzyme was highly stable after incubation at temperatures <= 50°C/ 1 h, maintaining the proteolytic activity. These characteristics combined with enzymatic activity, suggests that this protease exhibits potential use in biotechnological processes.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2800985 bytes, checksum: 40fca2e6fae55c6c55dc0ea1697df826 (MD5) Previous issue date: 2013-10-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In pigmented microorganisms, carotenoids are pigments, precursors of vitamin A that provide protective effects against oxidative damage. Extrinsic environmental factors such as temperature, specific carbon sources and inducers of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and light associated with physiological conditions (maximum exponential growth phase, early and late stationary phase) influence the accumulation of carotenoids in microbial cells. A pigmented yeast was isolated from an orchard in Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The main aims were to identify the isolated yeast and analyze the influence of environmental (light, temperature and arabinose) and physiological conditions (log phase, early and late stationary phase) on the production of carotenoids and the growth rate of the yeast. The taxonomical identification of the yeast strain was accomplished through analysis of 5.8S and 26S rRNA by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) and biochemical and molecular approaches. The yeast was identified as Rhodotorula mucilaginosa. In order to analyze the influence of factors on production of carotenoids and growth rate we used a methodology of response surface (RSM), and a central composite factorial design (CCD) with three factors and six replicates of central point was applied. The 20 experiments were done in batch in 91h and samples were collected at different physiological stages of the culture, at maximum growth rate (log phase), at deceleration growth phase (2h initial at the entrance of the stationary phase) and at stationary phase (60h after reaching the maximum cell mass). It implicates that carotenogenesis is not associated with cellular growth. The maximum carotenoid yield per cell mass (&#956;g/g) occurred at deceleration growth phase. The growth rate (&#956;) and total carotenoid yield (&#956;g/g) calculations well- adjusted to the mathematical model, with R2 of 0.96 and 0.91, respectively, and the lack of fit was not significant (p>0.05). The levels of light (&#956;mol m-2s-1), arabinose (%w/v) and temperature (°C) that created a maximum answer of total carotenoid yield (93.92 &#956;g/g) were 100 &#956;mol m-2s-1; 5% and 18 °C and growth rate (0.31h-1) were 63.6 &#956;mol m-2s-1; 3.7% and 24.6 °C. / Em micro-organismos produtores, carotenoides são pigmentos, precursores de vitamina A, que os protegem contra o estresse oxidativo. Fatores ambientais extrínsecos tais como temperatura, fontes específicas de carbono e indutores de espécies reativas de oxigênio (ROS) como luz e peróxido de hidrogênio associados a condições fisiológicas (fase de crescimento exponencial máxima, fase estacionária inicial e tardia) influenciam no acúmulo de carotenoides pelas células microbianas. Uma levedura pigmentada foi isolada do horto da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Os objetivos desse trabalho foram identificar esta levedura isolada no horto da UFV e analisar a influência dos fatores ambientais (temperatura, intensidade de luz e concentração de arabinose) e das diferentes condições fisiológicas (fase log, estacionária inicial e tardia) na produção de carotenoides e na velocidade de crescimento da levedura. A identificação taxonômica da levedura foi feita pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) por meio das análises das sequências 5,8S e 26S do rRNA e por ferramentas moleculares e bioquímicas, resultando na identificação da espécie como Rhodotorula mucilaginosa. A influência das condições ambientais e fisiológicas na produção de carotenoides e na taxa de crescimento foi verificada pela metodologia de superfície de resposta (RSM) por meio de um delineamento composto central (CCD) com três fatores e seis replicatas do ponto central. Os 20 experimentos foram feitos em 91h de batelada e as amostras foram coletadas em diferentes estados fisiológicos da cultura, isto é na fase de crescimento máximo (fase log), fase de desaceleração do crescimento (2h iniciais na entrada da fase estacionária) e fase estacionária (60h após alcançar a massa celular máxima). Demonstrou-se que a formação de carotenoides pela levedura não é associada ao crescimento. O rendimento máximo de carotenoides por massa celular (&#956;g/g) ocorreu na fase de desaceleração do crescimento. A velocidade específica máxima de crescimento (&#956;max) e o rendimento em carotenóide total por massa celular (&#956;g/g) foram ajustados ao modelo matemático, com R2 de 0,96 e 0,91 respectivamente, e o desajuste não foi significante (p>0,05). Os níveis de intensidade de luz (&#956;mol m-2s-1), arabinose (%p/v) e temperatura (°C) que criaram a resposta máxima de rendimento de carotenóides totais (93,92 &#956;g/g) foram 100 &#956;mol m-2s-1; 5%; 18 °C e da velocidade de crescimento (0,31h-1) foram 63,6 &#956;mol m-2s-1; 3,7% e 24,6 °C.