La voie de synthèse non-ribosomique représente une source importante de molécules d’intérêt. Mettant en jeu de larges complexes multi-enzymatiques, les Synthétases de Peptides Non Ribosomiques (NRPS), ce mode de production aboutit à la formation de peptides originaux d’une grande diversité structurale et fonctionnelle. Les problématiques de recherche de nouvelles molécules d’origines naturelles pour une utilisation dans différents domaines industriels font des molécules d’origine non-ribosomique de parfaites candidates pour la découverte des médicaments, surfactants ou antibiotiques des prochaines années. Les travaux décrits ont pour but l’étude du mécanisme de production de deux familles de molécules issues de la synthèse non-ribosomique, la kurstakine, un lipopeptide produit par Bacillus thuringiensis, et les PPCC (PentaPeptides Cycliques Chlorés), regroupant plusieurs molécules d’origine eucaryote. L’étude de la production de kurstakine par une série de mutants de B. thuringiensis a permis d’identifier plusieurs facteurs limitant la production de cette molécule, et d’ouvrir la voie à la mise en place de procédé de production en milieu liquide de cette molécules. L’étude des PPCC a permis d’identifier plusieurs gènes NRPS potentiellement impliqués dans la production de ces familles de molécules dans le génome de deux moisissures. / The Non Ribosomal Synthesis pathway is a very important source of molecules of interest. Based on large multi-enzymatic complexes, the Non Risosomal Peptide Synthetases (NRPS), this production mode leads to the formation of original peptides, with a large structural and activities diversity. The need of new molecules from natural sources, turns the non-ribosomal molecules into a promising source of drugs, surfactant or antibiotics for the future. This work aim to the understanding of the production mechanism of two families of non-ribosomal molecules, the kurstakin, a lipopeptide produced by Bacillus thuringiensis, and the CCPPs (Chlorinated Cyclic Penta Peptides), regrouping several eukaryotic molecules. The study of the kurstakin production using a series of B. thuringiensis mutants led to the identification of several limitating factors for the production of this molecule, and opened the possibility to the setting up of production process in liquid medium of this molecule. The study of CCPPs led to the identification of several genes, potentially implied on the production of these molecules in the genome of two fungal strains.

Les « terminal balls » qui constituent des complexes de maturation sont détectées à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes eucaryotes inspectés à ce jour ; générant les images de référence en « arbres de Noël ». La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées « SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes. Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S). Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres de Noël ». La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation. Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité 5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de mécanismes de contrôles de qualité. Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage (liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases 3’-5’ l’ Exosome.

Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

Le syndrome de Werner est caractérisé par un vieillissement prématuré. Au niveau cellulaire, nous observons une instabilité chromosomique importante et une sénescence accélérée comparé à des cellules normales. Le gène muté (WRN) responsable de ce syndrome code pour une protéine possédant un domaine exonuclease et hélicase à ADN impliqués dans la replication de l'ADN, la réparation et la transcription. Toutefois, nous ne savons toujours pas laquelle de ses fonctions est responsable du vieillissement prématuré. Nous pensons que l'identification de nouvelles protéines interagissant directement avec la protéine WRN pourrait nous donner des réponses. Des analyses par spectrométrie de masse sur 1'immunoprecipitation de la protéine WRN ont permis d'identifier la protéine ribosomale RPS3 et plusieurs autres comme nouveaux partenaires potentiels. Plusieurs approches biochimiques furent utilisées afin de confirmer l'interaction directe entre WRN et RPS3. Nous avons démontré que RPS3 interagit directement avec la protéine WRN in vitro. Des études additionnelles sont requises pour comprendre la fonction de ce complexe in vivo.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Avec près d’un million de nouveaux cas par an à travers le monde, le cancer colorectal est un problème de santé publique majeur. Il est la 2ème cause de mortalité par cancer en France, ce fort taux de mortalité étant relié à un pourcentage important de récidives et de métastases. L’hétérogénéité tumorale, la dissémination, la résistance aux traitements et la récidive seraient notamment dues à une population particulière de cellules tumorales appelées cellules souches cancéreuses (CSC). Ces cellules sont dotées d’une capacité d’adaptation extraordinaire et la compréhension des mécanismes moléculaires sous-tendant cette plasticité cellulaire est un objectif majeur pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques les ciblant spécifiquement. La synthèse protéique joue un rôle clé dans la carcinogénèse : d’une part, une synthèse protéique élevée est nécessaire à la prolifération des cellules tumorales, d’autre part, la traduction sélective favorise l’expression de protéines pro-oncogéniques. Considéré pendant des années comme un acteur passif de la traduction, le ribosome semblerait jouer un rôle majeur dans la régulation de la synthèse protéique. En effet, des études récentes ont montré que la composition du ribosome était « flexible » et permettrait de favoriser la traduction de certains ARN messager (ARNm). De plus, l’expression de certaines protéines ribosomiques (PR) varie entre le tissu sain et le tissu cancéreux, parfois même entre la tumeur initiale et la métastase. Ce projet vise à déterminer de quelle manière le contrôle traductionnel intervient dans plusieurs étapes clé du cancer colorectal, en se focalisant tout particulièrement sur l’acquisition ou la perte de propriétés propres aux CSC. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires exploités par les CSC afin de résister aux traitements et s’adapter à leur environnement. De plus, ce projet pourrait mettre en évidence un rôle exercé par certaines protéines ribosomiques dans le contrôle traductionnel, à travers la filtration des ARNm par le ribosome. A plus long terme, il pourrait déboucher sur le développement de nouveaux traitements permettant de cibler spécifiquement la machinerie traductionnelle des CSC. / Despite significant advances in diagnostics and treatment, colorectal cancer (CRC) remains a major cause of mortality worldwide and occurrence of metastasis represents the primary cause of death. Metastasis process, chemoresistance and tumor recurrence is powered by a minor subpopulation of tumor cells endowed with self‐renewal and multi‐lineage differentiation ability: the cancer stem cells (CSC).Translation of mRNA into protein is the final step in gene-expression process, which mediates the formation of the translatome from genomic information. Several mechanisms, such as signaling pathways, translation factors availability, alternative open reading frame and alternative initiation pathways account for real time translatome remodeling. Moreover, an emerging concept suggests that ribosome is heterogeneous and can be "reprogrammed". These "specialized ribosomes" would preferentially engage certain mRNA at the expense of others and therefore drive cell phenotype and favor cell adaptation. Many studies have correlated deregulation of both translation machinery composition and activity with cancer initiation and evolution. From that perspective, CSC might well represent a perfect model to test whether the translation apparatus takes an active part in tumor initiation, progression, and metastasis. Our goal is to demonstrate that protein synthesis is differentially regulated depending on cancer cell subpopulation and determine whether ribosomal heterogeneity could influence tumoral evolution and plasticity. In a long run, we envision the development of novel therapies based on specific targeting of translational control in CSC.

La biogenèse des ribosomes eucaryotes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARNr et 80 protéines. La production des deux sous-unités du ribosome, 40S et 60S, débute dans le nucléole par la synthèse d'un long précurseur commun contenant les séquences des ARNr matures et se termine dans le cytoplasme où ont lieu les dernières étapes d'assemblage des protéines ribosomiques et de clivage des ARNr. La production de ribosomes nécessite la participation de plus de 200 co-facteurs, qui catalysent les clivages et modifications des ARNr, coordonnent leur repliement et leur association aux protéines ribosomiques, et assurent des étapes de contrôle-qualité. Ces protéines sont associées aux particules en cours de maturation et absentes des sous-unités matures. Cette voie de synthèse, globalement conservée chez les eucaryotes, a été principalement étudiée chez la levure. Cependant, des études récentes ont montré des différences importantes de ce processus entre levure et mammifères. Un des verrous importants pour comprendre la fonction des co-facteurs, est l'absence de données sur la structure des précurseurs des sous-unités ribosomiques. J'ai donc entrepris une étude structurale de l'assemblage cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique chez l'homme par cryo-microscopie électronique à transmission. Le but de ma thèse était de déterminer la structure 3D des précurseurs de la petite sous-unité ribosomique purifiés à différentes étape de leur maturation. Ce travail a été conduit en collaboration avec l'équipe du Pr. Ulrike Kutay (ETH Zurich) pour la purification des particules pré-40S à partir de cellules humaines. La première structure 3D de particule pré-40S intermédiaire purifiée en étiquetant le co-facteur LTV1 a été déterminée à 19Å de résolution. Dans un deuxième temps, la structure 3D de la particule pré-40S tardive purifiée à via RIO1(KD) a aussi été déterminée à 15Å de résolution. Ces données nous ont permis de proposer un modèle de localisation des co-facteurs sur les précurseurs de la petite sous-unité ribosomique et de montrer une nouvelle différence dans la formation de la petite sous-unité chez l'Homme comparé à la levure, du fait de la présence de la protéine RACK1 sur les particules pré-40S humaines. La comparaison des structures des précurseurs de la petite sous-unité obtenues a permis de mettre en lumière l'existence de remodelages structuraux de la particule pré-40S au cours de sa maturation. Ce travail met en lumière les premières structures 3D de particules pré-40S humaines et pose les fondements méthodologiques d'explorations futures de la dynamique structurale des particules pré-ribosomiques. / Ribosome biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNAs with 80 ribosomal proteins. In Human, the production of the two subunits, 40S and 60S, is initiated by the transcription of a pre-ribosomal rRNA precursor to the mature 18S, 5.8S, and 28S rRNAs by the RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed by endo- and exoribonuclease, in order to form the mature rRNAs. The nascent pre rRNA associated with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and so called co-factors leading to the assembly of an initial 90S particle. This particle is then split into pre-40S and pre-60S pre-ribosomal particles that fallow independent maturation to form the mature subunit into the cytoplasm. Production of eukaryotic ribosomes implies the transient intervention of more than 200 associated proteins and ribonucleoprotein particles, that are absent from the mature subunits. Synthesis of ribosome, globally conserved in eukaryotes, has been principally studied in yeast. However, recent studies reveal that this process is more complex in human compared in yeast. An important bottleneck in this domain is the lack of structural data concerning the formation of intermediate ribosomal subunits to understand the function of assembly factors. Determination of the structural remodeling of pre-ribosomal particles is crucial to understand the molecular mechanism of this complex process. So I have undertaken a structural study on the assembly of the small ribosomal subunit using cryo-electron microscopy and image analysis. The goal of my thesis is to determine the 3D structures of human pre-40S particles at different maturation stages to see the structural remodeling that occurs during the biogenesis of the small ribosomal subunit. We are collaborating with the group of Pr Ulrike Kutay at ETH Zurich, who purify human pre-40S particles. The 3D structures of human pre-40S particles purified at an intermediate and late maturation stages, has been determined with a resolution of 19 and 15Å respectively. Supplementary densities, compared to the mature subunit, indicate the presence of assembly factors and show the unexpected presence of the RACK1 protein in the precursor of the human small ribosomal subunit in the cytoplasm. The comparison of the 3D structures of human pre-40S particle allows showing the structural remodeling that occur during the maturation of the small ribosomal subunit. This work provides the first 3D structure of human pre-40S particles and laid the methodological foundations for future exploration of the structural dynamics of pre-ribosomal particles.

La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique qui nécessite de nombreuses étapes de maturation et de modification des ARNr ainsi que l’assemblage et le transport des RNPs précurseurs. Un ribosome mature contient une centaine de pièces, ARN et protéines confondus, mais son assemblage requiert l’intervention de plus de 400 facteurs de synthèse. De part le coût énergétique important de ce processus, plusieurs voies de régulation interviennent pour contrôler la biogenèse des ribosomes en fonction des conditions nutritives. L’une des voies les plus connue est la voie TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation agît principalement au niveau de la transcription des différents intervenants de la biogenèse : les ARNr, les protéines ribosomiques mais aussi les facteurs de synthèse. Ces facteurs, ayant une action transitoire dans la maturation des ribosomes, sont, par économie, recyclés pour la synthèse de nouveaux ribosomes. Nous nous sommes donc intéressés au devenir de ces facteurs, plus particulièrement de ceux intervenants dans la biogenèse de la petite sous unité, lorsque les conditions environnementales sont inadaptées à la croissance cellulaire. Ainsi, nous avons pu montré, pour quatre facteurs particuliers : Dim2, Rrp12, Hrr25 et Fap7, que leur localisation est dépendante de la synthèse ribosomique. Ainsi, lors de carence en sources nutritives, l’inhibition de la synthèse et de l’activité ribosomique entraîne un confinement de ces facteurs ribosomiques dans le nucléole ou dans des corps cytoplasmiques. En outre, la localisation particulière des facteurs ribosomiques Hrr25 et Fap7 dans les P-bodies en phase de croissance saturée laisse penser que ces corps cytoplasmiques sont le lieu de dégradation des pré-ribosomes lorsque les carences nutritives perdurent.

Les terminal balls qui constituent des complexes de maturation sont détectées<p>à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes<p>eucaryotes inspectés à ce jour ;générant les images de référence en « arbres de Noël ».<p>La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées<p>« SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes.<p>Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur<p>l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la<p>première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un<p>rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S).<p>Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres<p>de Noël ».<p>La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la<p>finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines<p>ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non<p>moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le<p>concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation.<p>Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C<p>ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un<p>mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité<p>5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape<p>qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres<p>composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus<p>d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de<p>mécanismes de contrôles de qualité.<p>Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage<p>des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités<p>protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la<p>synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a<p>conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices<p>de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse<p>et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une<p>inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement<p>requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation<p>m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de<p>contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage<p>(liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces<p>facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme<p>que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance<p>nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases<p>3’-5’ l’ Exosome. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished