The interplay between biochemical signals and mechanical processes during animal development is key for the formation of tissues and organs with distinct shapes and functions. An important step during the formation of many tissues is the formation of compartment boundaries which separate cells of different fates and functions. Compartment boundaries are lineage restrictions that are characterized by a straight morphology. Biochemical signaling across compartment boundaries induce the expression of morphogens in the cells along the boundaries. These morphogens then act at long-range to direct growth and patterning of the whole tissue. Compartment boundaries stabilize the position of morphogens and thereby contribute to proper tissue development. The straight morphology of compartment boundaries is challenged by cell rearrangements caused by cell division and tissue reshaping. Physical mechanisms are therefore required to maintain the straight morphology of compartment boundaries. The anteroposterior (A/P) compartment boundary in the developing Drosophila melanogaster wing is established by biochemical signals. Furthermore, mechanical processes are required to maintain the straight shape of the A/P boundary. Recent studies show that mechanical tension mediated by actomyosin motor proteins is increased along the A/P boundary. However, it was not understood how biochemical signals interact with mechanical processes to maintain the A/P boundary. Here I provide the first evidence that Hedgehog signaling regulates mechanical tension along the A/P boundary. I was able to show that differences in Hedgehog (Hh) signal transduction activity between the anterior and posterior compartments are necessary and sufficient to maintain the straight shape of the A/P boundary, which is crucial for patterning and growth of the adult wing. Moreover, differences in Hh signal transduction activity are necessary and sufficient for the increase in mechanical tension along the A/P boundary. In addition, differences in Hh signal transduction activity are sufficient to generate smooth borders and to increase mechanical tension along ectopic interfaces. Furthermore, the differential expression of the transmembrane protein Capricious is sufficient to increase mechanical tension along ectopic interfaces. It was previously suggested that mechanical tension is generated by an actomyosin-cable through which the increase in mechanical tension is transmitted between the junctions along the A/P boundary. Here I show that mechanical tension is generated locally at each cell bond and not transmitted between junctions by an actomyosin cable. My results provide new insights for our understanding of the interplay between biochemical signals and mechanical processes during animal development.

Methylation of lysine residues in histone tails is an intensively studied epigenetic signal that regulates transcription throughout development. Methylation of histone 3 lysine 4 (H3K4) is usually associated with promoters of actively transcribed genes whereas H3K27 or H3K9 methylation silences genes. Yeast possess only one H3K4 methyltransferase, Set1. In contrast, there are six enzymes capable of catalyzing this modification in mammals implying a certain specialization or division of labor. The present study examined the functions of the mouse H3K4 methyltransferase paralogs, Mixed Lineage Leukemia 1 (Mll1) and Mll2, during neural differentiation and reprogramming of neural stem (NS) cells to induced pluripotency. We could show that Mll2 is required for differentiation of embryonic stem (ES) cells to neural progenitors and identified Nuclear transport factor 2-like export factor 2 (Nxt2) as essential target gene. Mll2 trimethylated the Nxt2 promoter in ES cells in order to allow for transcriptional upregulation during subsequent neural differentiation. Additionally, Mll2 prevented apoptosis of differentiating cells by regulating B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2) levels. Mll1 could replace Mll2 after the first steps of cell commitment towards epiblast stem (EpiS) cells. While Mll2 activity was only required briefly when ES cells started to differentiate, the influence of Mll1 seemed to increase with developmental progression. It stabilized the NS cell state by regulating expression of the neural transcription factor Orthodenticle homolog 2 (Otx2). Thereby, Mll1 impeded early steps of reprogramming to induced pluripotency and its inactivation increased the efficiency. Besides their specificity for certain target genes, both enzymes also differed in their activity. The major function of Mll1 was to prevent silencing by H3K27 methylation and possibly recruitment of transcription factors. In contrast, Mll2 conducted H3K4 trimethylation of its target genes. Importantly, once established in NS cells, the expression of Nxt2 became independent of promoter H3K4 methylation. Thus, Mll2 and its target gene Nxt2 represent an example for H3K4 methylation functioning as priming mechanism rather than for fine-tuning or maintenance of transcription levels.

Die durch den obligat biotrophen Protisten Plasmodiophora brassicae hervorgerufene Pflanzenkrankheit Kohlhernie verursacht weltweit hohe ökonomische Verluste. Bis heute gibt es keine effektiven Möglichkeiten, diese Pflanzenkrankheit zu bekämpfen. Eine Analyse der Genexpression in infizierten Wurzeln im Vergleich zu nicht infizierten Wurzeln ergab, dass die Gene für Lipid-Transfer-Proteine während der gesamten Krankheitsentwicklung differentiell reguliert sind. Über die Funktionen von Lipid-Transfer-Proteinen in Pflanzen wird noch spekuliert. Diskutiert wird dabei eine Funktion bei der Anpassung an verschiedene abiotische Stressfaktoren, bei der Pathogenabwehr sowie bei dem Transfer von Lipiden. In dieser Arbeit wurden transgene Pflanzen generiert, in denen die pathogenbedingte LTP-Genregulation umgekehrt ist. Es wurden transgene A. thaliana Pflanzen erzeugt, die die Gene LTP1, LTP3, LTP4, AT1G12090 sowie AT2G18370 überexprimieren und die Genexpression von AT4G33550 sowie AT1G62510 reprimieren. Die Regulation der LTP-Genexpression erfolgte dabei durch den wurzel- und keimlingsspezifischen Promotor Pyk10. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit auch T-DNA-Insertionsmutanten für die Gene AT1G12090, AT2G18370, AT3G22620, AT5G05960, LTP3 sowie LTP4 untersucht. Mittels semiquantitativer Expressionsanalyse konnte die Modulation der LTP-Genexpression in den LTP-Mutanten bestätigt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Modulation der Expression eines LTP-Gens auch die Expression anderer LTP-Gene beeinflusst. Die phytopathologischen Analysen der LTP-Mutanten hinsichtlich der Entwicklung der Pflanzenkrankheit Kohlhernie ergab, dass die Überexpression der Gene LTP1, LTP3 sowie AT2G18370 und die Repression der Expression von AT1G62510 eine verringerte Anfälligkeit für diese Krankheit bewirkt. Die verstärkte Expression der Gene LTP1, LTP3, LTP4, AT1G12090 sowie AT2G18370 resultiert außerdem in einer verringerten Symptomentwicklung infolge einer Pseudomonas syringae-Infektion. Die verringerte Expression des Gens AT4G33550 führt hingegen zu einer größeren Anfälligkeit für eine P. brassicae Infektion; die Infektion mit P. syringae wird dadurch aber nicht beeinflusst. Die physiologische Charakterisierung der LTP-Mutanten umfasste die Analyse des Pflanzenwachstums unter Salzstress bzw. osmotischem Stress sowie die Entwicklung der Seneszenz in abgetrennten Rosettenblättern. Es konnte gezeigt werden, dass die Gene LTP1, LTP3, LTP4, AT4G33550 sowie AT1G62510 bei der Anpassung an Salzstress sowie die Gene LTP3, AT3G22620, AT4G33550 und AT1G62510 bei der Anpassung an osmotischen Stress eine Rolle spielen. Durch die Modulation der Expression der genannten Gene wird das Wachstum unter diesen Stressbedingungen sowohl positiv als auch negativ beeinflusst. Die Entwicklung der Seneszenz wird ebenfalls durch eine veränderte LTP-Genexpression (LTP1, LTP3, LTP4, AT3G22620 sowie AT4G33550) beeinflusst. Für die biochemische Charakterisierung wurden die LTP-Gene aus A. thaliana mit einem Fusionspartner in E. coli exprimiert und die resultierenden Fusionsproteine gereinigt. Diese wurden nach Abspalten des Fusionspartners hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Aktivität und auf die Fähigkeit, Calmodulin zu binden, untersucht. Für die gereinigten Lipid-Transfer-Proteine LTP1, LTP3, LTP4, AT2G18370 sowie AT1G62510 konnte unter den bisher getesteten Versuchsbedingungen keine antimikrobielle Aktivität nachgewiesen werden. Für die Proteine LTP1, LTP3 und LTP4 konnte eine calciumunabhängige Calmodulin-Bindung nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Versuche ermöglichen keine Aussage bezüglich der genauen Funktion der einzelnen Lipid-Transfer-Proteine, geben aber Hinweise darauf, dass diese bei den entsprechenden Stress-Vorgängen eine Rolle spielen. Welche Funktion sie dabei genau erfüllen, muss in weiterführenden Analysen untersucht werden.

Cytoplasmic dynein is a ubiquitous minus-end directed motor protein that is essential for a variety of cellular processes ranging from cargo transport to spindle and chromosome positioning. Specifically, in fission yeast during meiotic prophase, the fused nucleus follows the spindle pole body in oscillatory movements from one cell pole to the other. The three molecular players that are essential to this process are: (i) the motor protein dynein, which powers the movement of the nucleus, (ii) microtubules, which provide the tracts for the movement and (iii) Num1, the anchor protein of dynein at the cortex. Dyneins that are localized to the anchor protein at the cortex and simultaneously bound to the microtubule emanating from the spindle pole body, pull on that microtubule leading to the movement of the nucleus. The spindle pole body, by virtue of its movement establishes a leading and a trailing side. Previous work by Vogel et al. has elucidated the mechanism of these oscillations as that of asymmetric distribution of dynein between the leading and trailing sides. This differential distribution is a result of the load-dependent detachment of dynein preferentially from the trailing microtubules. This self-organization model for dynein, however, requires a continuous redistribution of dynein from the trailing to the leading side. In addition, dyneins need to be bound to the anchor protein to be able to produce force on the microtubules. Anchored dyneins are responsible for many other important processes in the cell such as spindle alignment and orientation, spindle separation and rotation. So we set out to elucidate the mechanism of redistribution of dynein as well as the targeting mechanism of dynein from the cytoplasm to cortical anchoring sites where they can produce pulling force on microtubules. By employing single-molecule observation using highly inclined laminated optical sheet (HILO) microscopy and tracking of fluorescently-tagged dyneins using a custom software, we were able to show that dyneins redistributed in the cytoplasm of fission yeast by simple diffusion. We also observed that dynein bound first to the microtubule and not directly to the anchor protein Num1. In addition, we were able to capture unbinding events of single dyneins from the microtubule to the cytoplasm. Surprisingly, dynein bound to the microtubule exhibited diffusive behaviour. The switch from diffusive to directed movement required to power nuclear oscillations occurred when dynein bound to its cortical anchor Num1. In summary, dynein employs a two-step targeting mechanism from the cytoplasm to the cortical anchoring sites, with the attachment to the microtubule acting as the intermediate step.

Vor zirka 45 Jahren wurde das La Protein (SS-B) erstmals als Autoantigen von Patienten mit Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) oder Primären Sjögren’s Syndrom beschrieben. Jahrzehntelange Forschungen befassten sich mit seiner Struktur- und Funktionsaufklärung, sowie der Untersuchung von monoklonalen anti-La Antikörpern (anti-La mAK). Doch noch immer werfen nukleäre Antigene wie das La Protein und die gegen sie gerichteten Autoantikörper verschiedene Fragen auf. Diese betreffen besonders deren Entstehung und die pathophysiologische Bedeutung. So war es die Zielsetzung dieser Arbeit, die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins in der Autoimmunkrankheit und der Krankheitsentstehung bei SLE-Patienten weiter aufzuklären. Im Zentrum der Untersuchungen stand dabei die Redoxsensitivität des La Proteins und deren Einfluss auf die räumliche Proteinstruktur, die zelluläre Lokalisation, die Funktion der Nukleinsäurebindung, sowie die Antigenität. Dabei konnte erstmals mit Hilfe von CD-Spektroskopieanalysen deutlich gezeigt werden, dass die drei Cysteine (C18, C232 und C245) des La Proteins für die Struktur eine zentrale Rolle spielen. Es konnte demonstriert werden, dass die Fähigkeit zur redoxabhängigen Strukturumfaltung zum Verlust der protektiven Wirkung des La Proteins auf gebundene Nukleinsäure führt, wodurch diese für Nukleasen zugänglich gemacht wird und abgebaut werden kann. Dies ließ sich in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe verschiedener Experimente verifizieren, beispielsweise durch die Anwesenheit von Kupferionen (Cu2+), oder auch durch die Änderung des pH-Wertes von 7,0 auf 4,5. Parallel hierzu wurden neben Wildtyp La Protein auch verschiedene Cysteinmutanten getestet, um die Redoxabhängigkeit auch durch den Austausch der Cysteine C18, C232 und C245 zu zeigen. Die Änderungen des Redoxzustands beeinflussten jedoch nicht nur Sekundär- und Tertiär-struktur des La Proteins, sondern auch sein Di- und Oligomerisationsverhalten, sowie die Antigenerkennung durch bestimmte anti-La mAK (mAK der 312B Gruppe). Erstmals konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper nicht nur gegen die nor-malerweise nukleär vorliegende, reduzierte Form des La Proteins existieren. Es waren eben-so Patientenautoantikörper gegen die zytoplasmatische, oxidierte Form nachweisbar. Auch auf zellulärer Ebene wurde die Wirkung einer redoxabhängigen Umfaltung des La Proteins deutlich. Durch den Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) konnte eine zytoplasmatische Anreicherung beobachtet werden. Die dazu bereits bekannten Daten aus der Literatur konnten mit dieser Arbeit nochmals belegt und darüber hinaus ergänzt werden. Die zytoplasmatische Anreicherung wurde in der vorliegenden Arbeit für verschiedene ROS Stimuli gezeigt, darunter H2O2, Cu(II)SO4, Fe(II)Cl2 und darüber hinaus auch für NO-Glutathion (Stimulus reaktiver Stickstoffspezies NO). Des Weiteren konnte erstmals eine zytoplasmatische La Anreicherung durch eine Veränderung des intrazellulären ROS Levels nach Rezeptorstimulation gezeigt werden. Spannender Weise gelang dies für dendritische Zellen, wie moDCs und slanDCs, als auch für Endothelzellen (HUVECs). Die Induktion erfolgte dabei über Toll-like Rezeptoren (TLR), wie TLR4 (LPS-abhängiger Toll-like Rezeptor) und auch über TLR7/8, zwei Toll-like Rezeptoren, die für die Bindung von ssRNA, beispielsweise nach Virusinfektion zuständig sind. Unter dem Einfluss dieser Stimuli, kommt es zur Umfaltung des La Proteins, zum Loslösen von seinem potentiellen, indirekt über den anti-La mAK 7B6 nachgewiesenen Bindepartner und zum Verlust der nukleären Lokalisation. Im Zytoplasma kann die oxidierte Proteinvariante ihre protektive Aufgabe bezüglich der gebundenen Nukleinsäure nicht weiter ausführen. Es kommt unter normalen Umständen zu Dissoziation der gebundenen Nukleinsäuren und einem potentiellen Abbau dieser. Da bei Autoimmunpatienten jedoch sehr häufig eine Reduktion der Nukleaseaktivität nachweisbar ist, könnte der Nukleinsäureabbau in diesen Patienten gestört sein, was zu einem oxidierten La Protein mit noch gebundener Nukleinsäure führen würde. Neben der zytoplasmatischen Lokalisation wurde für das La Protein auch eine Lokalisation an der Zelloberfläche diskutiert. Die hier durchgeführten Studien mit den verschiedenen Sauerstoff- oder Stickstoffstressstimuli zeigten jedoch unter den gewählten Bedingungen keine Exposition des La Proteins auf die Zelloberfläche. Daher wurden apoptotische und nekrotische Zellen als mögliche La Proteinquelle für die Dekoration lebender Nachbarzellen untersucht. War in der Literatur noch über „apototic bodies“ als Quelle des La Proteins als Autoantigen spekuliert wurden, so konnte hier gezeigt werden, dass das La Protein aus humanen, apoptotischem Zellmaterial zu keiner nachweislichen Oberflächendekoration lebender Zellen führte. Anders verhielt es sich bei nekrotischem Zellmaterial. Hier konnte zum Beispiel humanes oxidiertes La Protein auf den murinen Zellen nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Analysen zeigte sich darüber hinaus, dass sowohl oxidiertes als auch reduziertes La Protein auf die Oberfläche verschiedener Zelltypen binden kann. Insgesamt konnte jedoch mehr oxidiertes La Protein auf den verschiedensten Zellentypen nachge-wiesen werden, als reduziertes La Protein unter gleichen Bedingungen. Auch ergaben sich Unterschiede bezüglich der Proteinbindung zwischen einzelnen Zelltypen. Vertreter von Anti-gen präsentierenden Zellen, wie Monozyten oder B-Zellen (Radji), sowie Endothelzellen (HUVECs), aber auch murine A9 Fibroblasten konnten im Vergleich zu T-Zellen und NK-Zellen, mehr La Protein auf ihrer Oberfläche binden. Diese Resultate lassen eine pathophysiologische Bedeutung des La Proteins bei SLE Patienten erkennen. Im Zuge von Zellschä-digungen, wie beispielsweise nach UV-Stress, kommt es zu einem nekrotischen Zellzerfall. Dieser führt zur Freisetzung von oxidiertem La Protein, welches auf benachbarte Zellen bindet. Dadurch können sie zum Ziel einer komplementsystemvermittelten Immunreaktion, sowie einer antikörpervermittelten, NK-Zellen gestützten Zelllyse (ADCC) werden. Für die Initiation einer Immunantwort, und im Besonderen für die Reifung autoreaktiver B-Zellen zu autoantikörpernproduzierenden Plasmazellen, bedarf es jedoch zunächst einer Aktivierung von dendritischen Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass lösliches La Protein dendritische Zellen aktivieren kann, belegt über die dokumentierte, finale TNFα Sekretion. Dabei war jedoch nicht entscheidend, ob La in einem reduzierten oder oxidierten Zustand vorlag, sondern das es assoziierte Nukleinsäuren aufwies. Experimentell führten an La Protein gebundene Nukleinsäuren zur Aktivierung von dendritischen Zellen (slanDCs). Wurde die Nukleinsäuren jedoch zuvor durch RNaseA Behandlung oder die Inkubation in Serum eines gesunden Spenders abgebaut, so lag keine oder eine nur sehr geringe Aktivierung von slanDCs vor. Eine Inkubation von La Protein in SLE Patientenserum hatte keine solche verminderte Aktivierung dendritischer Zellen zur Folge. Unter Berücksich-tigung der oben geschilderten Versuchsergebnisse ließ sich dieses Resultat mit der geringeren Nukleaseaktivität bei SLE Patienten begründen, was bereits aus der Literatur bekannt ist. Diese reduzierte Nukleaseaktivität stellt somit offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei der Aktivierung einer Autoimmunantwort in Zusammenhang mit dem La Protein und anti-La Autoantikörpern dar. Mit dieser Arbeit konnte also eindeutig gezeigt werden, dass das La Protein unter sich wechselnden Redoxbedingungen seine Struktur ändert. Dabei spielen die drei enthaltenden Cysteine eine bedeutende Rolle. Derartige Strukturveränderungen beeinflussen die Nukleinsäureschutzfunktion und die Erkennung durch Antikörper. Darüber hinaus bestätigte sich eine ROS induzierte Anreicherung von La im Zytoplasma. Auch die Fähigkeit des La Proteins, aus nekrotischem Zellmaterial auf die Oberflächen von lebenden Zellen zu binden, wurde gezeigt. Dadurch wäre es für Autoantikörper bei SLE Patienten zugänglich und somit pathophysiologisch relevant. Außerdem konnte auch die Eigenschaft von nukleinsäurege-koppelten La Proteins zur Aktivierung dendritischer Zellen belegt werden, was zur krankheitsauslösenden Aktivierung von autoreaktiven T- und im weiteren Verlauf von B-Zellen führen kann. Dadurch konnten die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate deutliche Hinweise auf die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins, nicht nur während der Autoimmunerkrankung, sondern auch für die Frühphase der Krankheitsentstehung, geben.

Histone post-translational modifications (PTMs), as the histone code assumes, are related with regulation of gene transcription, an important mechanism of cells in the differentiation process. Many PTMs are simultaneously present in histone proteins, and changes in the PTM stoichiometric ratios can have several effects, like changes in the chromatin structure leading to a transcriptionally active or repressive state. Significant progresses were made to map variations of histone PTMs by mass spectrometry (MS), and although many protocols were developed there are still some drawbacks. Incomplete and side reactions were identified, which can directly affect the quantification of histone PTMs, because both (incomplete and side reactions) can be misinterpreted as endogenous histone post translational modifications. Therefore, a protocol for derivatization of histones with no noticeable undesired reactions (<10%) was required. In this thesis a new chemical modification methodology is presented, which allows the improvement of sequence coverage by acylation with propionic anhydride of lysine residues and N-terminal (free ε- and α- amino groups) and trypsin digestion. more than 95% of complete reaction was achieved with the new derivatization methodology. This strategy (chemical derivatization of histones), in combination with bottom-up MS approach, allows the quantification of lysine methylation (Kme) and acetylation (Kac) in histones from Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae), mouse embryonic stem cells (mESCs) and human cell lines. The results showed histone H3 PTM pattern as the most variable profile regarding histone Kme and Kac across the three different organisms and experimental conditions. Therefore, it was concluded that quantification of H3 PTM pattern can be used to examine changes in chromatin states when cells are subjected to any kind of perturbation.

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) is a unique approach to study the mechanical unfolding of proteins. SMFS unfolding experiments yield insight into how interactions stabilize a protein and guide its unfolding and refolding pathways. In contrast to various water-soluble proteins whose unfolding and refolding patterns have been characterized, only α-helical membrane proteins have been probed by SMFS. It was shown that α-helical membrane proteins unfold via many intermediates; this differs from the two-state unfolding process usually observed in water-soluble proteins. In membrane proteins, upon mechanically pulling the peptide end of the protein, single and grouped α-helices and polypeptide loops unfold in steps until the entire protein is unfolded. Whether the α-helices and loops unfold individually or cooperatively to form an unfolding intermediate depends on the interactions established within the membrane protein and the membrane. Each unfolding event relates to an unfolding intermediate with the sequence of these intermediates defining the unfolding pathway of the protein. β-barrel-forming membrane proteins are the second major group of membrane proteins and have not yet been studied by SMFS. To fill this void this study was designed to characterize interactions, unfolding, and refolding of the β-barrel forming outermembrane protein G (OmpG).Folding of transmembrane proteins, despite the important part these proteins play in every biological process in a cell, is studied in only a few examples. Of those only a handful were β-stranded membrane proteins (Tamm et al., 2004; Kleinschmidt et al., 2006). Current models describe that transmembrane β-barrels fold into the lipid membrane via two major steps. First the unfolded polypeptide interacts with the lipid surface where it then folds and inserts into the membrane (Kleinschmidt et al., 2006; Huysmans et al., 2010). Conventionally, thermal or chemical denaturation is used to study folding of membrane proteins. In most cases membrane proteins were solubilized in detergent or exposed to urea to be studied, conditions that are not compatible with In vivo conditions. This suggests that the folding pathways described so far may not be a realistic representation of such pathways in nature. SMFS represents a unique approach to study the unfolding and refolding of membrane proteins into the lipid membrane (Kedrov et al., 2006; Kessler et al., 2006). Using SMFS makes it possible to study unfolding and refolding of membrane proteins in their nativephysiological environment with controlled pH, electrolyte, temperature, and most importantly in the absence of any chemical denaturant or detergent. In this thesis, SMFS was utilized to unfold and refold OmpG in E coli lipid extract. Bulk unfolding experiments suggested that OmpG unfolds and folds reversibly and much faster than α-helical proteins (Conlan et al., 2000). The folding process is thought to be a coupled two-state membrane partition-folding reaction. To the contrary, the mechanical unfolding of OmpG consisted of many sequential unfolding intermediates. Our SMFS refolding experiments showed that a partially unfolded OmpG molecule also refolds via several sequential steps. The predominant refolding steps are defined by individual β-hairpins that could later assemble the transmembrane β-barrel of OmpG. In conclusion, the most probable unfolding and refolding pathways of OmpG as a membrane β-barrel protein go through the β-hairpins as the structural segments or unfolding-refolding intermediates and the process is a multi step one rather than the simple two state process. We also used SMFS to study the physical interactions that switch the functional state and gating of OmpG. The structural changes that gate OmpG have been previously described by X-ray crystallography (Yildiz et al., 2006). They showed when the pH changes from neutral to acidic the flexible extracellular loop L6 folds into the pore and closes the OmpG pore. Here, SMFS was used to structurally localize and quantify the interactions that are associated with the pH-dependent closure. At an acidic pH, a pH-dependent interaction at loop L6 was detected. This interaction changed the unfolding of loop L6 and β-strands 11 and 12, which connect loop L6. All other interactions detected within OmpG were found to be unaffected by changes in pH. These results provide a quantitative and mechanistic explanation of how pHdependent interactions change the folding of a peptide loop to gate the transmembrane pore. It has also been shown how the stability of OmpG is optimized so that pH changes modify only those interactions necessary to gate the transmembrane pore and there are no global changes in protein conformation or mechanical properties. In the next step of interactions study, dynamic SMFS (DFS) was applied to quantify the parameters characterizing the energy barriers in energy landscape for unfolding of the OmpG. Some of these parameters are: free energy of activation and distance of the transition state from the folded state. The pH-dependent functional switching of OmpG directs the protein along different regions at the unfolding energy landscape. The two functional states of OmpG sequential folding take the same unfolding pathway as β-hairpins I–IV. After the initial unfolding events, the unfolding pathways diverge. In the open state, the unfolding of β-hairpin V in one step precedes the unfolding of β-hairpin VI. In the closed state, β-hairpin V and β-strand S11 with a part of extracellular loop L6 unfold cooperatively, and subsequently β-strand S12 unfolds with the remaining loop L6. These two unfolding pathways in the open and closed states join again in the last unfolding step of β-hairpin VII. Also, the conformational change from the open to the closed state witnesses a difference in Xu and κ in the energy landscape that translates to rigidified extracellular loop L6 at the gating area. Thus, a change in the conformational state of OmpG not only bifurcates its unfolding pathways but also tunes its mechanical properties for optimum function.

Protein-protein and protein-ligand interactions are fundamental as many proteins mediate their biological function through these interactions. Many important applications follow directly from the identification of residues in the interfaces between protein-protein and protein-ligand interactions, such as drug design, protein mimetic engineering, elucidation of molecular pathways, and understanding of disease mechanisms. The identification of interface residues can also guide the docking process to build the structural model of protein-protein complexes. This dissertation focuses on developing computational approaches for protein-ligand and protein-protein binding site prediction and applying these predictions to improve protein-protein docking. First, we develop an automated approach LIGSITEcs to predict protein-ligand binding site, based on the notion of surface-solvent-surface events and the degree of conservation of the involved surface residues. We compare our algorithm to four other approaches, LIGSITE, CAST, PASS, and SURFNET, and evaluate all on a dataset of 48 unbound/bound structures and 210 bound-structures. LIGSITEcs performs slightly better than the other tools and achieves a success rate of 71% and 75%, respectively. Second, for protein-protein binding site, we develop metaPPI, a meta server for interface prediction. MetaPPI combines results from a number of tools, such as PPI_Pred, PPISP, PINUP, Promate, and SPPIDER, which predict enzyme-inhibitor interfaces with success rates of 23% to 55% and other interfaces with 10% to 28% on a benchmark dataset of 62 complexes. After refinement, metaPPI significantly improves prediction success rates to 70% for enzyme-inhibitor and 44% for other interfaces. Third, for protein-protein docking, we develop a FFT-based docking algorithm and system BDOCK, which includes specific scoring functions for specific types of complexes. BDOCK uses family-based residue interface propensities as a scoring function and obtains improvement factors of 4-30 for enzyme-inhibitor and 4-11 for antibody-antigen complexes in two specific SCOP families. Furthermore, the degrees of buriedness of surface residues are integrated into BDOCK, which improves the shape discriminator for enzyme-inhibitor complexes. The predicted interfaces from metaPPI are integrated as well, either during docking or after docking. The evaluation results show that reliable interface predictions improve the discrimination between near-native solutions and false positive. Finally, we propose an implicit method to deal with the flexibility of proteins by softening the surface, to improve docking for non enzyme-inhibitor complexes.

Increasing the integration density of electron device components will necessitate the use of new nanofabrication paradigms that complement and extend existing technologies. One potential approach to overcome the current limitations of electron-beam lithography may involve the use of hybrid systems, in which existing lithographic techniques are coupled with “bottom up” approaches such as supramolecular self-assembly. In this respect, biological systems offer some unique possibilities as they combine both self-organization and spatial patterning at the nanometer length scale. In particular, Surface Layer Proteins (S-layers) can facilitate high order organization and specific orientation of inorganic structures as they are two-dimensional porous crystalline membranes with regular structure at the nanometer scale. In this framework, the aim of the present work was the characterization of the S-layer of Sporosarcina ureae ATCC 13881 (SslA) with respect to its self-assembling properties and modification that would allow it to be employed as a patterning element and a new building block for nanobiotechnology. In vitro recrystallization experiments have shown that wild type SslA self-assembles into monolayers, multilayers or tubes. Factors such as initial monomer concentration, Ca2+ ions, pH of the recrystallization buffer and the presence of a silicon substrate have a strong influence on the recrystallization process. SslA monolayers proved to be an excellent biotemplate for ordered assembly of gold nanoparticle arrays. The recombinant SslA after expression and purification formed micrometer sized, crystalline monolayers exhibiting the same lattice structure as the wild type protein (p4 symmetry). This remarkable property of self-assembling has been preserved even when SslA was truncated. The deletion of both, N- and C-terminal SslA domains does not hinder self-assembly; the resulting protein is able to form extended monolayers that exhibit the p4 lattice symmetry. The central SslA-domain is self sufficient for the self-assembly. The possibility to change the natural properties of S-layers by genetic engineering techniques opens a new horizon for the tuning of their structural and functional features. The SslA-streptavidin fusion protein combines the remarkable property of self-assembling with the ligand i.e. biotin binding function. On silicon wafers, this chimeric protein recrystallized into coherent protein layers and exposes streptavidin, fact demonstrated by binding studies using biotinylated quantum dots. In this way, it can serve as a functional surface for controlled immobilization of biologically active molecules but also as a platform for the synthesis of planar arrays of quantum dots. Furthermore, the results open up exciting possibilities for construction of hybrid S-layers, structures that may ultimately promote the fabrication of miniaturized, nanosized electronic devices.

A key prerequisite for cellular and organismal health is a functional proteome. A variety of human protein misfolding diseases are associated with the occurrence of amyloid protein aggregates, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or Huntington’s disease. The proteins involved in disease manifestation all contain aggregation-prone sequences of low compositional complexity. Such sequences are also known as prion-like, because of their sequence similarity to yeast prions. Yeast prion proteins are a specific subset of amyloid forming proteins with distinct physio-chemical and functional features, which give them transmissible properties. The aggregation properties of yeast prions and disease-related prion-like proteins reside in structurally independent, prion-forming domains (PrDs). These domains are highly enriched for uncharged polar amino acids, such as glutamine (Q) and asparagine (N). These compositional features can be used to predict prion-like proteins bioinformatically. To investigate the prevalence of prion-like proteins across different organisms, we analyzed a range of eukaryotic proteomes. Our analysis revealed that the slime mold D. discoideum contains the highest number of prion-like N/Q-rich proteins of all organisms. Based on this finding, we hypothesized that D. discoideum could be a valuable model system to study protein homeostasis (proteostasis) and the molecular basis of protein misfolding diseases. To explore how D. discoideum manages its highly aggregation-prone proteome, we analyzed the behavior of several well-characterized misfolding-prone marker proteins (variants of the disease-causing exon 1 of the huntingtin protein as well as wildtype and variant versions of the Q/N-rich yeast prion Sup35NM). Intriguingly, these proteins did not form cytosolic aggregates in D. discoideum, as they do in other organisms. Aggregates, however, formed as a result of heat stress, which indicates that the tested proteins have the capacity to aggregate, but are kept under tight control under normal conditions. Furthermore, when the stress level was reduced, the stress-induced aggregates dissolved, suggesting that D. discoideum has evolved mechanisms to reverse aggregation after a period of acute stress. Together, these findings reveal an unusual resilience of D. discoideum to aggregation-prone proteins, which very likely results from specific adaptations in its proteostasis network. By studying these specific adaptations, we could get important insight into the strategies that nature employs to control and maintain a highly aggregation-prone proteome. So far, our experimental investigations have revealed evidence for three specific adaptations. First, we identified the disaggregase Hsp101 as a key player in the acute stress response of D. discoideum. A functional analysis of Hsp101 in yeast and D. discoideum revealed that it supports thermotolerance. Second, we found evidence for an important role of the nucleus and nucleolus in proteostasis. We discovered that a small fraction of highly aggregation-prone proteins accumulated in the nucleus or nucleolus of D. discoideum cells. The magnitude of this nuclear accumulation could be increased by proteasome impairment, which suggests that the ubiquitin-proteasome system (UPS) is involved. This finding is consistent with previous studies in other organisms and hints at the possibility that D. discoideum disposes of aggregation-prone proteins by degrading them in the nucleus/nucleolus. Third and finally, we found that cells containing nuclear accumulations are asymmetrically distributed in the multicellular developmental stage (slug), suggesting that D. discoideum employs cell-sorting mechanisms to dispose of cells with accumulated protein damage. Although our current understanding of proteostasis in D. discoideum is preliminary, we have gained important insight into the molecular mechanisms and cellular pathways that D. discoideum uses to counteract protein aggregation. Findings from this work will inform similar comparative studies in other organisms and will impact our molecular understanding of protein misfolding diseases and aging. / Eine wesentliche Voraussetzung für die Gesundheit von Zellen und Organismen ist ein funktionales Proteom. Eine Reihe von humanen Protein- Missfaltungs-Erkrankungen, wie Chorea Huntington und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) werden mit dem Auftreten von amyloiden Protein- Aggregaten in Verbindung gebracht. Sämtliche Proteine, die in der Pathogenese dieser Krankheiten eine Rolle spielen, enthalten aggregations-anfällige Sequenzen mit geringer Sequenzkomplexität. Solche Sequenzen werden als Prion-ähnlich bezeichnet, da sie in ihrer Zusammensetzung den Prionen aus der Hefe S. cerevisiae gleichen. Die Prion-Proteine der Hefe gehören zu einer Unterart von amyloid-aggregierenden Proteinen, die durch bestimmte physikochemische und funktionelle Eigenschaften einen infektiösen Charakter erhalten. Die Aggregations-Eigenschaften von Hefeprionen und aggregationsanfällige Proteinen, die mit Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, basieren auf strukturell unabhängigen, Prion-bildenden Domänen (prion domain, PrD). Diese Domänen sind angereichert mit polaren Aminosäuren wie Glutamin und Asparagin. Diese Zusammensetzung kann dazu verwendet werden prion-ähnliche Proteine bioinformatisch vorherzusagen. Um die Verbreitung von Prion-ähnlichen Proteinen in verschiedenen Organismen zu untersuchen, analysierten wir eine Reihe von eukaryotischen Proteomen. Unsere Analyse zeigte, dass der Schleimpilz D. discoideum die höchste Anzahl von Prion-ähnlichen N/Q-reichen Proteinen aufzeigt. Aufgrund dieser Erkenntnisse erstellten wir die Hypothese, dass D. discoideum ein nützlicher Modellorganismus sein könnte, um Protein Homöostase (Proteostase) sowie die molekulare Basis von Proteins-Missfaltungs-Erkrankungen zu ergründen. Um zu analysieren, wie D. discoideum mit seinem höchst aggregations-anfälligen Proteom umgehen kann, untersuchten wir das Verhalten mehrerer bereits charakterisierter aggregations-anfälliger Marker-Proteine in D. discoideum. Hierbei verwendeten wir Varianten des krankheits-erzeugenden Exon 1 des humanen Huntingtin Protein sowie den wild-typ und Varianten des N/Q-reichen Hefe Prions Sup35. Interessanterweise bildeten diese Proteine, anders als in anderen Organismen, keine zytosolischen Aggregate in D. discoideum aus. Aggregate wurden jedoch unter Hitzestress-Bedingungen gebildet. Dies deutet darauf hin, dass die getesteten Proteine durchaus das Vermögen zu aggregieren besitzen, jedoch unter normalen Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Wenn, darüberhinaus das Stress- Level gesenkt wurde, kam es zur Auflösung der stress-induzierten Aggregate. Dies deutet darauf hin, dass D. discoideum Mechanismen entwickelt hat, um Aggregate nach Perioden von akutem Stress wieder aufzulösen. Zusammengenommen enthüllen diese Erkenntnisse eine ungewöhnliche Widerstandsfähigkeit gegenüber aggregations-anfälligen Proteinen. Diese beruht höchstwahrscheinlich auf spezifischen Modifikationen im Proteostase Netzwerk. Durch die Analyse dieser spezifischen Anpassungen könnten wichtige Einblicke in die Strategien gewährt werden, welche die Natur benutzt, um ein höchst aggregations-anfälliges Proteom zu erhalten und zu kontrollieren. Bisher erbrachten unsere Experimente Anhaltspunkte für drei spezifische Anpassungen. Erstens zeigten wir, dass die Disaggregase Hsp101 eine Schlüsselrolle in der akuten Stressantwort in D. discoideum einnimmt. Eine funktionale Analyse von Hsp101 in D. discoideum und Hefe zeigte, dass die Disaggregase Thermotoleranz fördert. Zweitens haben wir Anhaltspunkte, dass der Nukleus und der Nukleolus eine wichtige Rolle in der Proteostase einnehmen. Eine geringe Fraktion der überaus aggregations-anfälligen Proteine akkumuliert im Nukleus oder Nukleolus von D. discoideum. Das Ausmaß der nuklearen Akkumulation konnte erhöht werden, wenn das Proteasom beeinträchtigt wird. Dies deutet darauf hin, dass das Ubiquitin-Proteasom-System involviert sein könnte. Diese Beobachtung ist im Einklang mit jüngsten Berichten aus anderen Organismen und daraus folgt, dass D. discoideum möglicherweise aggregations-anfällige Proteine durch Abbau im Nukleus entsorgt. Drittens konnten wir feststellen, dass Zellen, die nukleare Akkumulationen enthalten, asymmetrisch in der multizellulären Entwicklungs-Struktur des Pseudoplasmodiums verteilt sind. Dies deutet darauf hin, dass D. discoideum möglicherweise den Zellsortierungsmechanismus während der Entwicklung nutzen kann, um Zellen mit angereicherten Protein-Schäden zu beseitigen. Auch wenn das gegenwärtige Verständnis der Proteostase in D. discoideum nur vorläufig ist, haben wir wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen und zellulären Prozesse erhalten, die D. discoideum verwendet, um Protein-Aggregation zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden ähnliche vergleichende Studien in anderen Organismen beeinflussen und Auswirkungen auf unser molekulares Verständnis über Protein-Missfaltungs-Erkrankungen und das Altern haben.