Prominin-1 is a lipid raft–associated, cholesterol-binding membrane glycoprotein selectively associated with plasma membrane protrusions and extracellular vesicles derived therefrom. Despite its worldwide use for stem cell isolation and its clinical importance in cancer-initiating cells and photoreceptor morphogenesis the function of prominin-1 remains elusive. This prompted me to investigate its role in the architecture and dynamics of microvilli and primary cilia at the apical plasma membrane of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Therefore, stably transfected cell lines were established expressing human prominin-1 splice variant 1 or 2. Upon the overexpression of prominin-1 the number of individual microvilli and clusters of them increased significantly. I also noticed alterations in their architecture, i.e. branching microvilli. Fascinatingly, two point mutations (Pro37→Ala and Tyr41→Ser) in the ganglioside GM1-binding motif of prominin-1 increased the number of branched microvilli and generated irregular ones with knob-like structures at their tip. Additionally, the release of prominin-1+ vesicles was impaired. Interestingly, both phenotypes were suppressed by the inhibition of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) or the Arp2/3 complex. Impaired interaction of prominin-1 with the PI3K through the introduction of an additional mutation (Tyr828→Phe) in its PI3K-binding site also reduced the amount of structurally altered microvilli. Thus, the interaction of prominin-1 with the PI3K may drive the conversion of the docking phospholipid phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate into phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate resulting in the uncoupling of the microvillar membrane from the underlying actin filaments thereby creating irregular/knob-like microvilli. Simultaneously, the phospholipid conversion might modulate the activity of regulators and/or activators of the Arp2/3 complex leading to the branching of microvilli. The overexpression of human prominin-1 also increased the length of primary cilia. Remarkably, a mutation in the histone deacetylase 6-binding site that mimics acetylation produces shorter cilia in cells expressing human prominin-1.s2. Additionally, it stimulates membrane vesicle release and dome formation. Above these striking observations, I observed branching cilia and cilia with a pearling shape. Collectively, the data suggest that a complex interplay of prominin-1 with its lipid and protein interaction partners regulates the architecture and dynamics of cellular protrusions. Finally, a growing number of studies use canine prominin-1 as an antigenic marker despite the absence of specific antibodies. Studies investigating its expression in dog tissues or cells derived therefrom rely on antibodies directed against its human and murine orthologs. To determine its cross-species immunoreactivity I cloned canine prominin-1 and overexpressed it as a green fluorescent protein fusion protein in MDCK cells. Here, I show that the genomic structure of the canine prom1 gene is similar to that of human and mouse. Canine prominin-1 shows the common characteristics of the prominin-1 family but the primary structure is poorly conserved. Like human and mouse protein, it is targeted to the apical membrane of MDCK cells and specifically enriched in microvilli and primary cilia. Immunocytochemistry, flow cytometry and immunoblotting techniques revealed that none of the applied antibodies against human or mouse prominin-1 recognizes the canine protein.

Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

This dissertation focuses on rationalised DNA design as a tool for the discovery and development of new therapeutic entities, as well as understanding the biological function of DNA beyond the storage of genetic information. The study is comprised of two main areas of study: (i) the use of DNA as a coding unit to illustrate the relationship between code-diversity and dynamics of self-assembly; and (ii) the use of DNA as an active unit that interacts and regulates a target protein. In the study of DNA as a coding unit in code-diversity and dynamics of self-assembly, we developed the DNA-Based Diversity Modelling and Analysis (DDMA) method. Using Polymerase Chain Reaction (PCR) and Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), we studied the diversity and evolution of synthetic oligonucleotide populations. The manipulation of critical conditions, with monitoring and interpretation of their effects, lead to understanding how PCR amplification unfolding could reshape a population. This new take on an old technology has great value for the study of: (a) code-diversity, convenient in a DNA-based selection method, so semi-quantitation can evaluate a selection development and the population\'s behaviour can indicate the quality; (b) self-assembly dynamics, for the simulation of a real evolution, emulating a society where selective pressures direct the population's adaptation; and (c) development of high-entropy DNA structures, in order to understand how similar unspecific DNA structures are formed in certain pathologies, such as in auto-immune diseases. To explore DNA as an active unit in Tumour Necrosis Factor α (TNF-α) interaction and activity modulation, we investigate DNA's influence on its spatial conformation by physical environment regulation. Active TNF-α is a trimer and the protein-protein interactions between its monomers are a promising target for drug development. It has been hypothesised that TNF-α forms a very intricate network after its activation between its subunits and receptors, but the mechanism is still not completely clear. During our research, we estimate the non-specific DNA binding to TNF-α in the low micro-molar range. Cell toxicity assays confirm this interaction, where DNA consistently enhances TNF-α's cytotoxic effect. Further binding and structural studies lead to the same conclusion that DNA binds and interferes with TNF-α structure. From this protein-DNA interaction study, a new set of tools to regulate TNF-α's biological activity can be developed and its own biology can be unveiled.

Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Eignung bakterieller Hüllproteine als Bindungsmatrix für die Kopplung funktionaler Moleküle mit dem Ziel, sensorische Schichten zu erzeugen. Bakterielle Hüllproteine sind biologische SAMs, anderen Oberfläche sich modifizierbare COOH-, NH2- und OH-Gruppen befinden. Die Ausbildung polymerer Strukturen erfolgt dabei in wässrigen Systemen und auf Oberflächen. Im Zuge der boomenden Entwicklung von Biosensoren werden insbesondere Biotemplate gesucht, die zwischen biologischer Komponente und Sensoroberfläche vermitteln. Bakterielle Hüllproteine stellen eine solche Zwischenschicht dar. Als Anwendungsbeispiel wurden die Proteine daher mit einem FRET-Paar und Thrombin und Kanamycin-Aptameren modifiziert. Hierbei wurden das FRET-Paar H488 und H555 an die bakteriellen Hüllproteine der beiden Haldenisolate A12 und B53 mittels EDC mit einer Modifizierungsrate von 0,54 molFarbstoff/molProtein kovalent gebunden. Bei der vorhandenen p4-Symmetrie bedeutet dies, dass ein FRET-Paar pro Einheitszelle vorhanden war. Der Nachweis eines Energietransfers zwischen den beiden am Protein gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen H488 und H555 erfolgte mittels statischer und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Energietransfer nur möglich war, wenn die Proteine in polymerer Form vorlagen, unabhängig davon, ob sich die Proteine immobilisiert an einer Oberfläche oder in wässriger Lösung befanden. Mittels Variieren des Donor-Akzeptor-Verhältnisses konnte ein maximaler Energietransfer von 40 % generiert werden, wenn das Verhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe von Donor und Akzeptor 4 betrug. Die Fluoreszenzintensität der Fluorophore wurde durch die Bindung an die Proteine nicht verringert oder gelöscht. Dies legt nahe, dass die Farbstoffe in den hydrophoben Poren immobilisiert wurden und die Poren die Fluoreszenzfarbstoffe schützen. Um weitere Aussagen über die Lage der gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten, wurden die bakteriellen Hüllproteine der Stämme A12 und B53 enzymatisch verdaut und die Fragmente mittels SEC und SDS-PAGE untersucht. Dabei zeigten sich je nach Enzym und Protein unterschiedliche Bandenmuster bezüglich modifizierter und nativer Hüllproteine. Dies belegt, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an NH2-und COOH-Gruppen der Proteine gebunden wurden und so teilweise den enzymatischen Verdau hinderten. Die SEC deutet an, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an verschiedenen Stellen am Protein gebunden wurden. In einem zweiten Beispiel wurde das bakterielle Hüllprotein von A12 mit einem Aptamer modifiziert. Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die u.a. mittels ihrer ausgebildeten 3D-Struktur spezifisch Zielstrukturen reversibel binden können. Die hier verwendeten Aptamere binden spezifisch Thrombin und Kanamycin. Die Aptamere wurden mit Hilfe einer der beiden Vernetzer PMPI oder Sulfo-SMCC an die bakteriellen Hüllproteine kovalent gebunden. Nach dem Modifizieren der Proteine wurden diese auf entsprechenden Sensorchips immobilisiert und die Aktivität des gekoppelten Aptamers mittels Affinitätsmessungen, SPR-Spektroskopie und QCM-D-Messungen analysiert. Die Funktion des gebundenen Thrombinaptamers konnte mittels Affinitätsmessungen und QCM-D nachgewiesen werden und entspricht in beiden Fällen einer Bindung von 2 nmol Thrombin pro Quadratzentimeter. Die Funktionalität des Kanamycinaptamers sollte mittels SPR bestimmt werden, jedoch konnte keine Funktionalität des gekoppelten Kanamycinaptamers nachgewiesen werden. Alle Messungen bestätigten jedoch, dass die Bindungsmatrix aus bakteriellen Hüllproteinen keinerlei oder nur ein sehr geringes Hintergrundsignal liefert. Werden nun beide Komponenten, FRET-Paar und Aptamere, an das Protein gebunden, ist es möglich, eine sensorische Schicht zu erzeugen. Die Zielstruktur, welche detektiert werden soll, wird an das Aptamer gebunden und so in räumliche Nähe zur Sensorfläche gebracht. Stell die Zielstruktur einen Fluoreszenzlöscher dar, so wird der Energietransfer durch die räumliche Nähe des Fluoreszenzlöscher gestört. Die Detektion des Zielmoleküls erfolgt nun über die Änderung von Fluoreszenzintensitäten. Die hier vorgelegte Arbeit soll einen Grundstein legen für die Entwicklung eines solchen Sensors und insbesondere die Detektion eines Energietransfers optimieren und Schwachstellen in der Detektion nachweisen. Die systematische Untersuchung der Fluoreszenzfarbstoffe auf dem Protein ermöglichen es, in zukünftigen Arbeiten einen FRET zweifelsfrei zu detektieren. Die Modifizierung von bakteriellen Hüllproteinen von A12 mit Aptameren und die Detektion der Funktionalität der Aptamere mittels verschiedener Methoden zeigte auf, dass die bakteriellen Hüllproteine als universelle Bindungsmatrix für sensorische Moleküle dienen können, bei denen Affinitätsmessungen, SPR- oder QCM-D-Messungen genutzt werden. Besonders hervorzuheben ist, dass bakterielle Hüllproteine nahezu kein Hintergrundsignal liefern und aufgrund ihrer dünnen Monolage von etwa 6 - 9 nm die Sensitivität der Messungen nur gering beeinträchtigen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der nichtenzymatischen Glykosylierung auf das Denaturierungsverhalten und die funktionellen Eigenschaften von Molkenproteinen, hier im speziellen die emulgierenden Eigenschaften, untersucht. Nach einer Bestimmung technologisch relevante Glykosylierungsgrade sollten in unterschiedlich glykosylierten Molkenproteinpräparaten das Denaturierungsverhalten sowie die Emulgiereigenschaften in Abhängigkeit vom Glykosylierungsgrad mit unterschiedlichen Methoden bestimmt werden. Der aus praktischer Sicht relevante Einfluss der Glykosylierung auf die sensorischen Eigenschaften wurde einerseits in Molkenproteinlösungen und andererseits in einem komplexen System (Modell-Schmelzkäsezubereitung) erfasst. Schließlich galt es, den Einfluss der Glykosylierung auf die Mikrostruktur und die Festigkeit am Beispiel der Modell- Schmelzkäsezubereitung zu untersuchen und daraus unmittelbare Konsequenzen für die technologische Praxis abzuleiten.

BACKGROUND: A long-standing challenge in the post-genomic era of Bioinformatics is the prediction of protein-protein interactions, and ultimately the prediction of protein functions. The problem is intrinsically harder, when only amino acid sequences are available, but a solution is more universally applicable. So far, the problem of uncovering protein-protein interactions has been addressed in a variety of ways, both experimentally and computationally. MOTIVATION: The central problem is: How can protein complexes with solved threedimensional structure be utilized to identify and classify protein binding sites and how can knowledge be inferred from this classification such that protein interactions can be predicted for proteins without solved structure? The underlying hypothesis is that protein binding sites are often restricted to a small number of residues, which additionally often are well-conserved in order to maintain an interaction. Therefore, the signal-to-noise ratio in binding sites is expected to be higher than in other parts of the surface. This enables binding site detection in unknown proteins, when homology based annotation transfer fails. APPROACH: The problem is addressed by first investigating how geometrical aspects of domain-domain associations can lead to a rigorous structural classification of the multitude of protein interface types. The interface types are explored with respect to two aspects: First, how do interface types with one-sided homology reveal convergently evolved motifs? Second, how can sequential descriptors for local structural features be derived from the interface type classification? Then, the use of sequential representations for binding sites in order to predict protein interactions is investigated. The underlying algorithms are based on machine learning techniques, in particular Hidden Markov Models. RESULTS: This work includes a novel approach to a comprehensive geometrical classification of domain interfaces. Alternative structural domain associations are found for 40% of all family-family interactions. Evaluation of the classification algorithm on a hand-curated set of interfaces yielded a precision of 83% and a recall of 95%. For the first time, a systematic screen of convergently evolved motifs in 102.000 protein-protein interactions with structural information is derived. With respect to this dataset, all cases related to viral mimicry of human interface bindings are identified. Finally, a library of 740 motif descriptors for binding site recognition - encoded as Hidden Markov Models - is generated and cross-validated. Tests for the significance of motifs are provided. The usefulness of descriptors for protein-ligand binding sites is demonstrated for the case of "ATP-binding", where a precision of 89% is achieved, thus outperforming comparable motifs from PROSITE. In particular, a novel descriptor for a P-loop variant has been used to identify ATP-binding sites in 60 protein sequences that have not been annotated before by existing motif databases.

The pathogenesis of inflammatory liver diseases and development of liver fibrosis involves hepatocytes as well as non-parenchymal liver cells like resident liver macrophages (Kupffer cells (KC)), Stellate cells and endothelial cells. Kupffer cells play a critical role in liver (patho)physiology and in the defense of the liver during inflammation. They constitute about 50% of non-parenchymal cells and are the largest population of tissues macrophages in the body. Infections, toxins (lipopolysacharide (LPS)), parenchymal damage and stresses stimulate the inflammatory response of Kupffer cells with the following secretion of bioactive factors, cytotoxicity, antigen processing, etc. Resident liver macrophages are the main producers of inflammatory mediators in the liver. Among them there are prostanoids (prostaglandin (PG) E2 and thromboxane (Tx) A2), cytokines (e.g. interleukin (IL)-1,-6, -10, tumor necrosis factor (TNF) α) and inorganic mediators like nitric oxide (NO). Macrophages-derived products play opposing roles in the development of liver fibrogenesis: IL-1β, TNFα, IL-6, transforming growth factor (TGF)-β and TxA2 (pro-fibrogenic mediators) promote whereas PGE2, IL-10 and nitric oxide (anti-fibrogenic mediators) suppress liver fibrogenesis. The present study shows the production of PGE2 and TxA2 by resident liver macrophages upon prolonged activation by LPS and the characterization of biosynthesis pathways. The production of PGE2 and TxA2 is followed during 24 h after stimulation of macrophages with LPS. The involvement of enzymes is measured on the RNA level (RT-PCR), protein level (Western blot analysis) and activity (activity assays), respectively. The amounts of released prostanoids are measured at time points 2, 4, 8 and 24 h after LPS stimulation. The production of PGE2 is very low without stimulation, shows a delay within the first few hours after stimulation with LPS, and thereafter linearly increases up to 24 h. TxA2 production is very low without stimulation, and increases without a time-delay after the addition of LPS. Prostanoid biosynthesis is inhibited by dexamethasone. The present study shows the involvement and regulation of the AA cascade by the following enzymes: cPLA2: is expressed in resting Kupffer cells; cPLA2 expression and phosphorylation is increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect, localization in membrane fraction. COX-1: is expressed in resting Kupffer cells; COX-1 expression is not influenced by LPS and dexamethasone. The COX-1 inhibitor SC560 suppresses the LPS-induced production of PGE2 and TxA2 (8h and 24h), localization predominantly in membrane fraction. COX-2: is almost not expressed in resting Kupffer cells; COX-2 expression is highly increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect. The COX-2 inhibitor SC236 inhibits the production of PGE2 and TxA2 at 8h by about 77% and 20%, and at 24h by about 42% and 34%, respectively, localization predominantly in membrane fraction. mPGES-1: is almost not expressed in resting cells; mPGES-1 expression is highly increased by LPS, dexamethasone suppresses the LPS effect, localization in membrane fraction. mPGES-2: is expressed in resting Kupffer cells; mPGES-2 expression is slightly increased by LPS, localization predominantly in membrane fraction. cPGES: is expressed in resting Kupffer cells; LPS has no effect, localization predominantly in soluble fraction. TxA2 synthase: is expressed in resting Kupffer cells; LPS and dexamethasone have no effect, localization predominantly in membrane fraction. Treatment of Kupffer cells with IL-1ß and TNF-α leads to an enhanced release of PGE2 and TxA2 and upregulate the expression of cPLA2, COX-2 and mPGES-1. IL-6 has no effect on prostanoid production. In contrast, IL-10 suppresses the LPS-induced production of PGE2 and TxA2 and expression of cPLA2, COX-2 and mPGES-1. Resting Kupffer cells release very low amounts of NO and do not express iNOS, nNOS and eNOS. LPS, TNF-α and IL-1ß upregulate NO release and the expression of iNOS whereas dexamethasone and IL-10 downregulate NO release and the expression of iNOS. PGE2 suppresses the LPS-induced release of NO but enhances the cytokine-induced release of NO. NO induces a release of PGE2. Thus, the study demonstrates a crosstalk between prostanoids, nitric oxide and cytokines in Kupffer cells under inflammatory conditions and demonstrates a possible anti-fibrogenic effect of PGE2 in the process of liver fibrogenesis.

Sowohl bei der Forschung der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln als auch im menschlichen Körper lag das Hauptaugenmerk bislang auf der Reaktion der Carbonylfunktion mit den Aminofunktionen der Seitenketten wie Lysin oder Arginin, da sie in vielen Lebensmitteln oder physiologischen Proteinen die größte Quelle an Aminofunktionen darstellen. Dagegen wurde eine vergleichbare Reaktion mit dem N-Terminus von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen weniger beachtet, obgleich in lysinarmen oder peptidhaltigen Lebensmitteln die N-terminalen Aminofunktionen dominieren und die Seitenketten körpereigener Proteine räumlich für einen Angriff der Carbonylfunktion unzugänglich sein können. Da in den HA-Nahrungen die allergieauslösenden Proteine hydrolytisch gespalten vorliegen, stehen für eine mögliche Amadori-Produktbildung gegenüber den konventionellen Säuglingsnahrungen quantitativ mehr alpha-Aminogruppen als epsilon-Aminogruppen zur Verfügung. Demzufolge sollte für die Beurteilung von HA-Nahrungen eine Methode entwickelt werden, mit deren Hilfe eine Aussage über die Amadori-Produktbildung auch am N-Terminus getroffen werden kann. Aufbauend auf den Ergebnissen der Furoylmethylderivate-Bestimmung (FMAA-Bestimmung) in peptidhaltigen Lebensmitteln, war es ein weiteres Ziel der vorliegenden Dissertation die entwickelte Methode auch auf ihre Anwendbarkeit auf die Beurteilung des Glykierungsstatus des Hämoglobin in vivo zu testen. Nach der N-terminalen Amadori-Produktbildung im Zuge der frühen Phase der Maillard-Reaktion lag im zweiten Teil der Dissertation das Hauptaugenmerk auf die fortgeschrittene Phase der Maillard-Reaktion am N-Terminus von Peptiden oder Proteinen. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Bildung von 2-(1H)-Pyrazinonen im komplexen trockenen Lebensmittel und in vivo.

Membrane proteins are vital for cellular homeostasis. They maintain the electrochemical gradients that are essential for signaling and control the fine balance of trace elements. In order to fulfill these tasks, they need to undergo controlled conformational transitions within the lipid bilayer of a cell membrane. It is well-recognized that membrane protein structure and function depends on the lipid membrane. However, much less is known about the role of water re-partitioning at the protein–lipid interface and particularly within a membrane protein during functional transitions. Intra-membrane protein hydration is expected to be particularly important for ion transport processes, where the hydration shell of a solvated ion needs to be rearranged and partially removed in order to bind the ion within the transporter before it is re-solvated upon exiting the membrane protein. These processes are spatially and temporally organized in metal-transporting ATPases of the PIB-subtype of P-type ATPases. Here, the functional role of water entry into the transmembrane region of the copper-transporting PIB-type ATPase CopA from Legionella pneumophila (LpCopA) has been investigated. The recombinant protein was affinity-purified and functionally reconstituted into nanodiscs prepared with the extended scaffolding protein MSP1E3D1. Nanodiscs provide a planar native-like lipid bilayer in a water-soluble nanoparticle with advantageous optical properties for spectroscopy. The small polarity-sensitive fluorophore 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (BADAN) was used as a probe for the molecular environment of the conserved copper-binding cysteine-proline-cysteine (CPC) motif which is located close to a wide “entry platform” for Cu+ to the transmembrane (TM) channel. The systematic study of proteins with mutated metal-binding motifs using steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy indicates that strong gradients of hydration and protein flexibility can exist across the narrow range of the CPC motif. The data suggest that Cu+ passes a “hydrophobic gate” at the more cytoplasmic C384 provided by rather stable TM helix packing before entering a more flexible and readily hydratable site in the interior of LpCopA around C382 where the polarity is strongly regulated by protein–lipid interactions. This flexibility could also be partly mediated by rearrangements of an adjacent amphipathic protein stretch that runs parallel to the membrane surface as a part of the cytoplasmic entry site. Using tryptophan fluorescence, circular dichroism, and Fourier-transform infrared absorption spectroscopy of a synthetic peptide derived from this segment, its lipid-dependent structural variability could be revealed. Depending on lipid-mediated helix packing interactions, the CPC motif has the potential to support a strong dielectric gradient with about ten units difference in permittivity across the CPC distance. This property may be crucial in establishing the directionality of ion transport by a non-symmetric re-solvation potential in the ion release channel of LpCopA. The experimental elucidation of these molecular details emphasizes not only the importance of intra-membrane protein water which has been hypothesized particularly for PIB-type ATPases. Moreover it is shown here, that the lateral pressure of a cell membrane may provide a force that restores a low hydration state from a transiently formed state of high internal water content at the distal side of the CPC motif. ATP-driven conformational changes that induce intra-membrane protein hydration of a conformational intermediate of the Post-Albers cycle could thus be set back efficiently by lateral pressure of the cell membrane at a later step of the cycle.

Molecular biology has entered an era of systematic and automated experimentation. High-throughput techniques have moved biology from small-scale experiments focused on specific genes and proteins to genome and proteome-wide screens. One result of this endeavor is the compilation of complex networks of interacting proteins. Molecular biologists hope to understand life's complex molecular machines by studying these networks. This thesis addresses tree open problems centered upon their analysis and quality assessment. First, we introduce power graph analysis as a novel approach to the representation and visualization of biological networks. Power graphs are a graph theoretic approach to lossless and compact representation of complex networks. It groups edges into cliques and bicliques, and nodes into a neighborhood hierarchy. We demonstrate power graph analysis on five examples, and show its advantages over traditional network representations. Moreover, we evaluate the algorithm performance on a benchmark, test the robustness of the algorithm to noise, and measure its empirical time complexity at O (e1.71)- sub-quadratic in the number of edges e. Second, we tackle the difficult and controversial problem of data quality in protein interaction networks. We propose a novel measure for accuracy and completeness of genome-wide protein interaction networks based on network compressibility. We validate this new measure by i) verifying the detrimental effect of false positives and false negatives, ii) showing that gold standard networks are highly compressible, iii) showing that authors' choice of confidence thresholds is consistent with high network compressibility, iv) presenting evidence that compressibility is correlated with co-expression, co-localization and shared function, v) showing that complete and accurate networks of complex systems in other domains exhibit similar levels of compressibility than current high quality interactomes. Third, we apply power graph analysis to networks derived from text-mining as well to gene expression microarray data. In particular, we present i) the network-based analysis of genome-wide expression profiles of the neuroectodermal conversion of mesenchymal stem cells. ii) the analysis of regulatory modules in a rare mitochondrial cytopathy: emph{Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic acidosis, and Stroke-like episodes} (MELAS), and iii) we investigate the biochemical causes behind the enhanced biocompatibility of tantalum compared with titanium.