Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The aim of the thesis was to determine whether the individual Se-speciation in the mammalian organism are affected by the form of received selenium. Selenium is an essential micronutrient important for humans and animals. It plays an important role in the antioxidant protection of the organism and in the conversion of thyroid hormones. In our experiment the laboratory Wistar rats were divided into three groups. Each group had a different diet. The rats were fed with selenium in the form of soy, sodium selenite and extracted rapeseed meal. Urine samples were regularly collected during the four-week experiment and in the end of the feeding study, the blood serum was also collected. The total selenium content was measured by ICP-MS, while the individual Se-speciation in urine and serum by HPLC coupled with ICP-MS. In the urine the identified speciation were methylselenocystein (MeSeCys), trimethylselenium (TMSe) and selenosugar 1 and 3. In the blood serum the measured speciation were TMSe, selenite, selenate and selenosugar 1. For the group fed with sodium selenite the measured values in the urine were generally higher, this might be due to a higher overall intake and also an inorganic form of selenium with a lower absorbency. Groups that received selenium from plant sources took in several Se-compounds and the total measured content of Se-speciation and secretion dynamics were not significantly different. Additionally speciation of selenosugar 2 was measured for the group fed with rapeseed meals, which in the other groups did not appear. When receiving selenium from plant sources the biotransformation in the mammalian organism differs in comparison to receiving selenium from mineral salts. The initial hypothesis that Se-speciation is influenced by the form of selenium administered in the diet was confirm by our results. Since the group fed rapeseed showed similar results as the group fed a standard feed with soy, the extracted rapeseed meal could serve as a good source in livestock nutrition.

Les interactions protéine-ligand interviennent dans de nombreux processus biochimiques et permettent notamment à certaines protéines sanguines d’assurer leur rôle de transport. Parmi ces protéines figurent notamment l’albumine, protéine la plus abondante du plasma, ou l’apolipoprotéine A1 (ApoA1), majoritaire au sein des lipoprotéines de haute densité (HDL). Dans un contexte diabétique, la glycation des protéines induit des modifications structurales affectant ainsi leur potentiel d’interaction.Le premier objectif de ce travail de thèse visait à déterminer l’impact de la glycation de l’albumine sur sa liaison au liraglutide, un médicament de plus en plus utilisé dans le traitement du diabète de type 2. Ensuite, la seconde partie de ce travail a consisté en la production d’une ApoA1 humaine recombinante fonctionnelle afin d’étudier ses propriétés d’interaction, sous forme libre ou associée aux phospholipides. La technique RMN (résonance magnétique nucléaire) a été utilisée sur les protéines préalablement marquées au fluor (pour le liraglutide) ou aux isotopes stables 13C/15N (pour l’ApoA1). La titration microcalorimétrique isotherme (ITC), méthode complémentaire à la RMN a été appliquée pour l’étude des interactions avec l’avantage de ne nécessiter aucun marquage. Différentes stratégies de clonage ont été explorées pour la surexpression de l’ApoA1 en bactérie Clearcoli.Les résultats obtenus démontrent une altération de l’affinité de l’albumine pour le liraglutide in vitro et in vivo, dépendante du degré de glycation. Ces résultats, enrichis d’une analyse lipidomique et peptidique, permettent d’expliquer les observations cliniques concernant la baisse de l’efficacité de médicaments liant l’albumine chez les patients ayant un diabète mal contrôlé. Concernant l’ApoA1, le choix de l’étiquette de fusion reste à optimiser, mais sa surexpression de manière soluble et abondante a été obtenue pour l’ApoA1 marquée et non marquée. / Protein-ligand interactions are involved in many biochemical processes. They are notably implicated in the role of transporter proteins in blood. Albumin, the most abundant plasma protein, and apolipoprotein A1 (ApoA1), which is the main component of high-density lipoprotein (HDL) belong to this class of proteins. In the context of diabetes, proteins are altered by glycation which leads to structural modifications and potentially affect their interactions.The first objective of this work was to determine the impact of albumin glycation on its binding to liraglutide, a drug increasingly used in the treatment of type 2 diabetes. Then, the second part of this work involved the production of recombinant functional human ApoA1 in order to study its interaction properties, in its lipid-free form or associated with phospholipids. The NMR (nuclear magnetic resonance) technique has been used on proteins previously labeled with fluorine (for liraglutide) or stable 13C/15N isotopes (for ApoA1). In addition, isothermal titration microcalorimetry (ITC), has been applied to the study of interactions with the advantage of not requiring any labeling. Various cloning strategies have been explored for the overexpression of ApoA1 in Clearcoli bacteria.The results demonstrate an alteration of the affinity of albumin for liraglutide in vitro and in vivo, depending on the degree of glycation. These results, supported by a lipidomic and peptide analysis, explain clinical observations concerning the decrease of efficacy of albumin-binding drugs in patients with poorly controlled diabetes. Regarding ApoA1, the choice of the fusion tag remains to be optimized, but both labeled and unlabeled ApoA1 were successfully overexpressed at high yields in a soluble form.

The development of total hip arthroplasty has reached a state when quality prostheses are made, whose longevity is influenced significantly by material properties, design, component fixation and rate of wear of the articulating surfaces. It is the wear rate which is the most important factor influencing successful results for the use of total hip prostheses. The aim of this thesis is to perform a research on the various combinations of hip prostheses and its loading conditions. Also an experimental measurements of Bovine serum lubricating film thickness between the artificial femoral head and a glass disc are performed for different contact kinematic conditions.

Background: The method of serum bactericidal assay represents an alternative possibility of optimization of anti-infectious therapy and administration of antibiotics. It mirrors the real activity of one or more administered antibiotics in the complex system of the antibacterial effect of patient's serum. The paper aimed to confirm non-inferiority of bactericidal testing using the broth dilution method according to CLSI M21-A Guidelines (time to results 48, 72 hours) in comparison with modified methods of testing on the basis of turbidimetry (time to result 6, 8, 24 hours) and resazurin color (time to results 8, 24 hours). Methods: Four antibiotics were tested: gentamicin, amikacin, piperacillin/tazobactam and meropenem with 30 Escherichia coli strains isolated from blood cultures of 29 pacients hospitalised in different wards, University Hospital in Hradec Kralove. Human blood sera (n = 76) from ten hematological patients (4th Department of Clinical Medicine, University Hospital, Hradec Kralove) were tested to establish bactericidal titer. Patients' blood was withdrawn prior to and in the course of the first and third day of antibiotic therapy of febrile neutropenia. Testing employed the reference strain Escherichia coli ATCC 25922. Results: A comparison with the standard CSLI showed that the...

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant un garçon sur 3500. Elle entraîne une dégénération progressive et irréversible des muscles. Actuellement, la maladie est incurable et aucune thérapie ne permet de traiter les patients de façon efficace et sécuritaire. La thérapie cellulaire, qui consiste à injecter des cellules musculaires humaines saines, les myoblastes, dans les muscles des personnes atteintes de la DMD, a déjà donné des résultats cliniques prometteurs. Par contre, quelques problèmes entravent le développement de cette thérapie. Entre autre, le milieu de culture utilisé pour l’expansion des myoblastes contient du sérum fœtal bovin (FBS). Le FBS est un produit animal non défini pouvant être contaminé par des bactéries, des virus ou des prions. Les risques possibles pour la santé des patients peuvent entraver l'acceptation de la thérapie. Il est donc préférable de remplacer le FBS par un mélange d'additifs définis, notamment par des cytokines. De plus, les procédés de production actuels sont inadéquats pour répondre à la demande en cellules musculaires. Ce projet vise à élaborer un milieu de culture sans sérum pour la prolifération in vitro des cellules musculaires et à développer un procédé de production à grande échelle de ces cellules. Pour développer un milieu sans sérum, une méthode en boucle a été utilisée. Celle-ci se divise en 3 étapes : a) monter une banque de facteurs potentiels en identifiant les récepteurs cellulaires par RT-PCR et par un criblage de la littérature, b) tester ces facteurs en culture en utilisant, entre autre, une planification statistique des expériences (DOE) permettant de vérifier les effets individuels et synergiques de ces additifs et c) ajouter les additifs générant une réponse bénéfique au milieu de culture. Cette boucle a été itérée jusqu'à ce que le nombre de facteurs testés soit suffisant pour que la réponse cellulaire avec le nouveau milieu soit comparable au milieu avec FBS. Pour atteindre l'objectif de mise à l’échelle, le projet s’est limité à la sélection de microporteurs permettant une adhésion efficace des myoblastes. Suite à l'essai par DOE de 9 milieux de base et de 72 additifs, un milieu sans sérum, le LOBSFM, a été développé. Il s'agit, à notre connaissance, du seul milieu de culture sans sérum existant qui est aussi efficace que le milieu traditionnel pour la prolifération des myoblastes. Un brevet a été déposé pour protéger ce milieu. Il permet la prolifération spécifique des myoblastes (~80% myoblastes dans la culture, vérifié par marquage immunocytochimique) aussi efficacement que le milieu standard contenant 15% de FBS, durant au moins 60 jours de culture. De plus, les myoblastes cultivés dans le LOBSFM conservent leur capacité de fusionner et ainsi former des fibres musculaires. Pour ce qui est du procédé de culture, les microporteurs poreux Cytoline2™ ont permis d'obtenir une concentration cellulaire finale de 1,5E6 cell/mL, comparable à la culture en flacon statique. Les pores protègent les myoblastes contre les contraintes hydrodynamiques et permettent une récupération simple des cellules. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic disease affecting one boy out of 3500. It leads to progressive and irreversible muscle degeneration. Currently, there is no cure for this disease and no therapy allows an efficient and safe treatment. Cell therapy consists in injecting healthy human muscle cells, myoblasts, into the muscles of DMD patients. Promising results have been obtained in clinical trials using this approach. However, some problems need to be overcome. Particularly, the original culture medium used to expand myoblasts contains Foetal Bovine Serum (FBS). FBS is an undefined product derived from animal, which can be contaminated with bacteria, viruses or prions. The possibility of harmful consequences for the patients hampers the acceptability of the therapy, so FBS must be replaced by a mixture of defined factors such as specific recombinant cytokines. Moreover, the production processes are currently inappropriate to meet the demand for muscle cells. Therefore, this project aims to develop a serum-free medium for the in vitro proliferation of muscle cells and a large-scale process for the production of those cells. A multi-step method was used to develop the serum-free medium. It is divided into three main steps: a) to build a panel of potential factors from a screen of the literature followed by the detection of more than 100 receptors and autocrine factors using RT-PCR, b) to test those factors in culture using statistical design of experiment (DOE) allowing to verify individual and synergistic effects and c) to add the factors that generate beneficial response to the culture medium. Those steps are followed until a cellular response comparable to the culture in standard medium is obtained. To achieve the scale-up objective, the project was limited to the selection of microcarriers that allowed the proper adhesion of myoblasts. The potential factors identified in the first stage, together with additional ones taken from the literature, formed a panel of 9 basal culture media and 72 additives that have been tested by means of DOE. At the end of this process, a serum-free medium, LOBSFM, was developed. To our best knowledge, it is the only existing efficient serum-free medium for myoblast proliferation and a patent has been obtained to protect its use. It allows a specific expansion of myoblasts (~80% myoblasts, verified by immunostaining) comparable to a standard medium containing 15% FBS over a 60-day culture period. Moreover, myoblasts kept their ability to form muscle fibers. Porous microcarriers Cytoline2 allowed a final cell concentration of 1.5E6 cells/mL, comparable to cell expansion in static culture plate. The pores protected the cells against mechanical stresses while the cell recovery remained easy.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3ème cause de mortalité par cancer dans le monde. L'identification de nouveaux marqueurs sériques est cruciale pour améliorer le pronostic. Dans ce travail, nous avons évalué l'intérêt de la spectroscopie vibrationnelle, infrarouge et Raman, appliquée au sérum pour le diagnostic du CHC. Dans un premier temps, nous avons réalisé 2 études pilotes pour évaluer le potentiel de ces deux approches. L'intérêt de la spectroscopie Raman appliquée au sérum a été évalué chez 37 patients cirrhotiques avec CHC et 34 patients cirrhotiques sans CHC. L'analyse des données spectrales a permis de classer les patients avec un taux d'exactitude diagnostique de 85 à 91%. Nous avons également démontré l'intérêt diagnostique de la spectroscopie IRTF dans une population de 40 patients avec CHC et 39 patients sans CHC. Dans cette étude, le taux d'exactitude diagnostique était de 82 à 86%. Dans un deuxième temps, nous avons mené une étude sur un plus grand nombre de patients afin de valider les résultats obtenus dans l'étude pilote IRTF. Les caractéristiques spectrales IRTF du sérum de 308 patients cirrhotiques avec CHC ont été comparées à celles du serum de 509 patients cirrhotiques sans CHC. L'analyse des données spectrales par deux méthodes de classification supervisée, SVM et PLS-DA, n'a pas permis de confirmer les résultats obtenus dans cette étude pilote. Avec un taux d'exactitude diagnostique entre 50 et 60 %, l'analyse spectrale IRTF du sérum entier n'apparait pas discriminante pour distinguer les patients cirrhotiques avec et sans CHC. Ce résultat souligne la nécessité de confirmer sur un grand nombre de patients les résultats obtenus dans des études pilotes. L'analyse spectrale ciblée sur des fractions du sérum pourrait permettre d'identifier plus efficacement des marqueurs diagnostiques en évitant la superposition des informations spectrales liées aux multiples molécules présentes dans le sérum entier. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third cause of cancer death in the world. The identification of novel serum markers is crucial to improve the prognosis. In this work, we evaluated the potentiels of vibrational spectroscopy, infrared and Raman spectroscopy, applied to serum to diagnose HCC. On a first step, two pilot studies were conducted to evaluate these two approaches. Raman spectroscopy applied to the serum was tested in 37 cirrhotic patients with HCC and 34 cirrhotic patients without HCC. Analysis of spectral data showed that it was possible to classify patients with a diagnostic accuracy rate of 85 to 91%. We also demonstrated the diagnostic performance of FTIR spectroscopy in a population of 40 patients with HCC and 39 patients without HCC. In this study, the diagnostic accuracy rate was 82 to 86%. In a second step, an FTIR study on a larger number of patients was performed to validate the results obtained in the pilot studiey. FTIR spectral characteristics of 308 serum from cirrhotic patients with HCC were compared with those of 509 cirrhotic patients without HCC. The supervised classification methods, SVM and PLS -DA were applied but did not confirm the results obtained in the pilot study. The diagnostic accuracy was between 50 and 60%, FTIR spectral analysis of whole serum does not appear discriminant enough to differentiate cirrhotic patients with and without HCC. This result highlights the need to confirm on a large number of patients results in pilot studies. Spectral analysis of serum fractions could be an alternative to more effectively identify diagnostic markers avoiding overlapping spectral information related to the complex composition of whole serum.