O presente estudo teve como objetivo avaliar a conversão dos açúcares do bagaço de cana em etanol, com foco na integração entre o pré-tratamento com H2SO4 diluído, sacarificação com celulases comerciais e fermentação com Scheffersomyces stipitis DSM- 3651, buscando-se uma configuração simplificada. Previamente aos ensaios de integração, o bagaço foi moído para a redução de sua heterogeneidade granulométrica. Após a moagem, o bagaço foi submetido a fracionamento, por fluxo de ar, separando frações de fibras e finos. Estas frações foram submetidas a analise composicional e observou-se que a fração de finos possui elevados teores de cinzas e extrativos, além de baixo teor de lignina em relação à fração de fibras, entretanto a estratégia de fracionamento do bagaço não foi seletiva. Os experimentos de definição da condição de pré-tratamento mais adequada para a avaliação entre integração entre sacarificação e fermentação foram conduzidos em reator Parr (2 gal) com 2Kg de mistura reacional, incluindo bagaço (10%), água e ácido. Três condições operacionais de pré-tratamento foram avaliadas: 140°C/1%H2SO4/20 min, 150°C/2% H2SO4/30 min e 160°C/3% H2SO4/40 min. Após o pré-tratamento, o slurry foi separado em sólido pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico, por filtração. Em seguida o bagaço pré-tratado foi lavado exaustivamente com água destilada e submetido à hidrólise enzimática com celulases (10 FPU/g bagaço) por 72h. Paralelamente, o hidrolisado foi submetido à fermentação com S. stipitis (3 g/L) por 120h. As composições das frações geradas após o pré-tratamento (bagaço pré-tratado, hidrolisado e água de lavagem), quanto aos teores de açúcares e sólidos (solúveis e insolúveis) foram determinadas. As três condições de pré-tratamento levaram a remoção completa de hemicelulose do bagaço, e o aumento da severidade do pré-tratamento acarretou em aumento da eficiência de sacarificação dos sólidos pré-tratados, porém em menor recuperação de glicose após hidrólise enzimática. Por outro lado, o aumento da severidade do pré-tratamento prejudicou a recuperação de açúcares no hidrolisado hemicelulósico, elevando concentrações de ácido acético, furfural e HMF, resultando em inibição completa de fermentação daqueles obtidos nas condições de 150°C e 160°C. A conversão do sólido prétratado (lavado ou não-lavado) + hidrolisado (destoxificado ou não), e do slurry completo (destoxificado ou não) ambos obtidos após pré-tratamento à 140°C, foi avaliada em duas configurações, respectivamente: \"Fermentação do hidrolisado hemicelulósico (FHH), em separado da sacarificação do sólido pré-tratado e da fermentação do hidrolisado celulósico, separadas (SHF)\" e \"Sacarificação do sólido pré-tratado, em separado da co-fermentação dos hidrolisados celulósico e hemicelulósico, integradas (ISHCF)\". Na primeira, observouse que a destoxificação do hidrolisado com lacase (1U/mL) aumentou a produção de etanol, e possibilitou a redução do tempo de conversão em 48h. A sacarificação de sólidos não-lavados foi prejudicada pela presença de compostos solúveis e o condicionamento com lacase não influenciou a eficiência de sacarificação. A eficiência máxima de conversão em configuração de SHF+FHH foi de 28,4%, devido a não lavagem do sólido pré-tratado (13,7%) e destoxificação do HH (14,7%). Em ISHCF, observou-se que a eficiência de conversão de slurry integral destoxificado com lacase é mais alta (38,9%) do que em SHF+FHH, devido a não separação sólido-líquido e maior disponibilidade de açúcares. / This study aimed to evaluate the conversion of sugarcane bagasse into ethanol, focusing on integration between pretreatment with dilute H2SO4, saccharification with commercial cellulases and fermentation with Scheffersomyces stipitis DSM-3651, in a simplified design process. Prior to integration assays, the bagasse was milled to reduce its granulometric heterogeneity. After milling, the fractions of bagasse (fiber and pith) were separated by air flow. These fractions had their chemical composition determined and it was observed that pith fraction has higher content of ash, soluble extractives and low lignin content than fiber fraction; however the separation method was not selective. The experiments to define the most suitable pretreatment condition for evaluating the integration between saccharification and fermentation were conducted in a Parr reactor (2 gal) with 2 kg of reaction mixture, including bagasse (10%), water and acid. Three operational conditions of pretreatment were evaluated: 140°C/1% H2SO4/20min, 150°C/ 2% H2SO4/30 min and 160°C/3% H2SO4/40min. After pretreatment, the slurry was separated in pretreated solid and hemicellulosic hydrolyzate, by filtration. The pretreated solid was thoroughly washed with distilled water and submitted to enzymatic hydrolysis with cellulases (10 FPU / g residue) for 72h. In parallel, the hemicelullosic hydrolyzate was submitted to fermentation with S. stipitis (3 g / L) for 120h. The compositions of the fractions generated after pretreatment (pretreated bagasse, hemicellulosic hydrolyzate and washing water), regarding sugars and solids (soluble and insoluble) contents were determined. All pretreatment conditions led to complete removal of hemicellulose from the bagasse, and the increase of pretreatment severity improved the saccharification yield of pretreated solid, but, leaded to low recovery of glucose after enzymatic hydrolysis. On the other hand, the increase of pretreatement severity impaired the recovery of sugars in hemicellulosic hydrolysate besides increasing the concentrations of acetic acid, furfural and HMF, resulting in complete inhibition of fermentation of those obtained under the pretreatement conditions of 150°C and 160°C. The conversion of pretreated solid (washed and non-washed) + hemicellulosic hydrolyzate (with or without detoxification) and of the whole slurry, both obtained at 140°C was evaluated in two process designs, respectively: \"Fermentation of hemicellulosic hydrolyzate (FHH), separated from hydrolysis of pretreated solid and fermentation of cellulosic hydrolyzate, separately (SHF)\" and \"Integrated hydrolysis of pretreated solid separated from co-fermentation of cellulosic and hemicellulosic hydrolysates (ISHCF)\". In the first, it was observed that the detoxification of the hydrolyzate with laccase (1U / ml) improved the ethanol production, particularly for conversion time. The saccharification of non-washed solid was hampered by the presence of soluble compounds and its conditioning treatment with laccase did not influence the saccharification yield. The maximum conversion efficiency in SHF + FHH configuration was 28.4% due to not washing the pretreated solid (13.7%) and detoxification of hemicellulosic hydrolysate (14.7%). In the second process design, it was observed that the conversion efficiency of whole slurry, with laccase detoxification, was higher (38.9%) than in the separate configuration, with a lower conversion time.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a fermentabilidade do hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino, visando a produção de etanol por leveduras. Inicialmente, o bagaço de cana foi pré-tratado com sulfito alcalino para remover parcialmente a lignina e alterar a estrutura da celulose e hemicelulose. Os efeitos deste pré-tratamento foram avaliados em termos da composição química dos materiais obtidos: um material lavado (BPL) e outro não lavado (BPNL) após tratamento. A digestibilidade enzimática dos materiais obtidos foi testada empregando dois extratos enzimáticos comercias e 3 cargas de enzimas, de acordo com um planejamento experimental 22. A partir destes resultados foi selecionado o extrato Cellubrix suplementado com ?-glicosidase na carga de 18 FPU/g de biomassa, e nesta condição os rendimentos de conversão de celulose e xilana foram cerca de 70% e 65%, respectivamente. Os hidrolisados enzimáticos do BPL e BPNL porém suplementados com nutrientes (2,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4, 0,3 g/L de MgSO4.7H2O, 5,0 g/L de extrato de levedura), e avaliados quanto a produção de etanol por K. marxianus Y-6860 a 40°C. Os resultados mostraram que a levedura produziu etanol apenas a partir de glicose, e os parâmetros fermentativos obtidos com o hidrolisado BPNL QP = 3,7 g/L.h e YP/S = 0,40 g/g foram 20 e 5%, respectivamente superior ao BPL. O hidrolisado enzimático do BPNL foi então selecionado, para avaliar o efeito da suplementação nutricional nos parâmetros fermentativos da levedura K. marxianus Y-6860, em três temperaturas diferentes (30, 35 e 40°C) de acordo com um planejamento experimental 22. Para efeito de comparação, foi também avaliada a fermentabilidade do hidrolisado BPNL pelas leveduras S. cerevisiae PE-2 e S. stipitis Y-7124. Os resultados mostraram que para as três leveduras estudadas, os valores dos parâmetros fermentativos, foram favorecidos a 30 °C na presença nutrientes. Nesta condição, as leveduras apresentaram valores de YP/S similares (~ 0,48 g/g), em quanto que o QP foi de 3,25; 2,17 e 0,95 g/L.h para K. marxianus, S. cerevisiae e S. stipitis, respectivamente. Ressalta-se ainda que nesta condição, a S. stipitis Y-7124 foi a única levedura, capaz de consumir completamente ambos os açúcares (glicose + xilose) e produzir uma concentração de etanol 46% maior comparado as outras leveduras. Foi avaliado também a fermentabilidade das três leveduras no hidrolisado enzimático BPNL com alta concentração de glicose (100 g/L), nas condições anteriormente selecionadas. Os resultados mostraram que, as três leveduras apresentaram potencial para produção de etanol a partir da glicose, com uma eficiência de conversão de etanol superior a 70%, no entanto deveriam se implementar estratégias para estimular o consumo de xilose. Com os resultados do presente trabalho se pode concluir que o hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino suplementado com nutrientes, é um meio com grande potencial para a produção de etanol com características favoráveis para ser eficientemente fermentado por diferentes espécies de leveduras. / The present work had the objective to evaluate the fermentability of the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pre-treated with alkali sulfite process, aiming the ethanol production by yeasts. Initially, sugarcane bagasse was pretreated with alkaline sulfite process to remove lignin partially. The effects of this pre-treatment, were evaluated in the chemical composition of the materials: one material washed after treatment (WB) and another unwashed material (UWB). The enzymatic digestibility of the obtained materials was tested using two commercial enzymatic extracts and three enzyme loads according to an experimental design 22. From these results, the Cellubrix extract supplemented with ?-glucosidase, was selected in the load of 18 FPU/g of biomass, in this condition the cellulose and xylan conversion yields were about 70% and 65%, respectively. The enzymatic hydrolysates of WB and UWB supplemented with nutrients (2,0 g/L (NH4)2 SO4, 1,0 g/L KH2 PO4, 0,3 g/L MgSO4 .7H2O, 5,0 g/L yeast extract), were evaluated for ethanol production by K. marxianus Y-6860 at 40°C. The results showed that the yeast produced ethanol only from glucose, and the fermentative parameters obtained with the UWB hydrolyzate QP= 3,7 g/L.h and YP/S= 0,40 g/g, were 20 and 5% respectively higher to WB. The UWB hydrolyzate, was selected to evaluate the effect of nutritional supplementation, in the fermentative parameters of K. marxianus, at three different temperatures (30, 35 and 40°C) according to an experimental design 22. For comparison, were also evaluated fermentability of S. cerevisiae PE-2 and S. stipitis Y-7124 in the hydrolyzate. In the three yeasts, the results showed that the values of the fermentative parameters, are favored when the hydrolyzate is supplemented with nutrients to 30°C. In this condition , yeasts showed similar YP/S value (~0,48 g/g), whereas the QP was of 3,25; 2,17 and 0,95 g/L.h for K. marxianus, S. cerevisiae and S. stipitis, respectively. It is also worth noting that in this condition S. stipitis was the only yeast able to completely consume both sugars (glucose+xylose) and produce a concentration of ethanol of 46% higher than other yeasts. In the previously selected condition, the fermentability of the hydrolyzate with high glucose concentration (100 g/L) was also evaluated. The results showed that the three yeasts presented potential for the production of ethanol from glucose, with an ethanol efficiency of over 70%, however strategies should be implemented to stimulate the consumption of xylose. With the results of the present work it can be concluded that the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pretreated with alkaline sulfite process supplemented with nutrients is a medium with great potential for the production of ethanol with characteristics favorable to be efficiently fermented by different species of yeasts.

Uma tecnologia para o fracionamento de materiais lignocelulósicos, baseada no uso de solventes apropriados, foi proposta para separar os principais componentes (celulose, hemicelulose e lignina). De acordo com a técnica, é adicionado ao material um solvente para celulose (ácido fosfórico concentrado); então, acetona é adicionada para promover a precipitação da celulose na forma amorfa. As etapas subsequentes são as seguintes: uma primeira extração com acetona para remover a lignina; e uma segunda extração com água, para remover a hemicelulose. Estudos aplicando o fracionamento, denominado \"COSLIF\" (\"cellulose solvent and organic solvent based lignocellulose fractionation\"), em diferentes materiais demonstraram altas taxas e rendimentos de hidrólise da celulose em presença de baixas cargas enzimáticas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi definir condições apropriadas para fracionar o bagaço de cana-de-açúcar usando o fracionamento COSLIF, com vistas à produção de etanol de 2ª geração. Para otimização das condições de fracionamento, foi realizado um planejamento fatorial 25, com as seguintes variáveis: concentração de ácido fosfórico (81-85 %), temperatura (40-60 ºC), tempo (30-120 min), volume de acetona (80-120 mL) e volume de água (120-160 mL), determinando, a partir da composição das frações geradas, parâmetros relacionados à recuperação e seletividade do fracionamento. Apesar de grande variabilidade experimental, conseguiu-se definir a condição ótima por meio de análise estatística, para o fracionamento de 1 g de bagaço (massa seca): ácido fosfórico (83,8 %), temperatura (45,8 ºC), tempo (56,1 min), volume de acetona (91,6 mL) e volume de água (131,6 mL). Esta condição, reproduzida em escala ampliada, foi eficaz na amorfização da celulose e na separação da hemicelulose no extrato aquoso. O rendimento global (RG + X (S + L)) obtido foi de 87,1%; o rendimento de recuperação de glucana na fração sólida (RG(S)) foi de 84,6%; e o rendimento de recuperação de xilana na fração líquida (RX(L)) foi de 61,0%. Em relação à seletividade de recuperação de glucana na fração sólida (SG(S)) foi obtido 95,3%; e à seletividade de recuperação de xilana na fração líquida (SX(L)), foi obtido 72,7%. A análise estrutural da fração sólida, por meio de difração de raios-X e termoporometria, demonstrou que a tecnologia consegue romper a estrutura do material, diminuindo a cristalinidade e aumentando a porosidade. O índice de cristalinidade, que no bagaço \"in natura\" era de 44%, foi reduzido para 0; a área superficial cumulativa para moléculas com diâmetros de até 10 nm, que no bagaço \"in natura\", era de 43 m2/g, foi aumentada para 166 m2/g. Aliada à remoção de hemicelulose, tais alterações proporcionaram elevada eficiência de sacarificação da glucana em glicose; 93%, em 24 horas de hidrólise. O hidrolisado enzimático foi fermentado por Scheffersomyces stipitis, com produção de 10,5 g/L de etanol em 48 horas de fermentação; o rendimento de conversão de glicose em etanol (YP/S) foi de 0,36 g/g, com produtividade volumétrica (QP) de 0,22 g/Lh. / A technology for fractionating lignocellulosic materials, based on the use of suitable solvents, was proposed to separate the main components (cellulose, hemicellulose and lignin). According to the technique, a solvent for cellulose (concentrated phosphoric acid) is added to the material, then, acetone is added to promote precipitation of the cellulose in an amorphous form. The subsequent steps are as follows: a first extraction with acetone, to remove lignin, and a second extraction with water, to remove hemicellulose. Studies applying the fractionation, called \"COSLIF\" (\"cellulose solvent and organic solvent based lignocellulose fractionation\"), to different materials demonstrated the high rates and yields of cellulose hydrolysis in the presence of low enzymes loadings. In this context, the objective of the present study was to define appropriate conditions to fractionate the sugarcane bagasse of using the COSLIF procedure, aiming the production of 2nd generation ethanol. To optimize the conditions of fractionation, we performed a 25 factorial design, with the following variables: concentration of phosphoric acid (81-85%), temperature (40-60° C), time (30-120 min), volume of acetone (80-120 mL) and volume of water (120-160 mL), determining, from the composition of the generated fractions, the parameters of recovery and selectivity. Despite of high experimental variability, it was possible to define optimum condition, by means of statistical analysis, for the fractionation of 1 g of bagasse (dry weight): phosphoric acid (83,8%), temperature (45,8° C), time (56,1 min), volume of acetone (91,6 mL) and volume of water (131,6 mL). This condition, reproduced at a larger scale, was effective in the amorphization of cellulose and in the separation of hemicellulose in the aqueous extract. The overall yield (RG + X (S + L)) was 87,1%. The recovery yield of glucan in the solid fraction (GR (S)) was 84,6%, and the recovery yield of xylan in the liquid fraction (RX (L)) was 61,0%. The selectivity of glucan recovery in the solid fraction (SG (S)) was 95,3%, the selectivity of xylan recovery in the liquid fraction (SX (G)) was 72,7%. The structural analysis of the solid fraction, by means of X-ray diffraction and thermoporometry, demonstrated that the technology can disrupt the structure of the material, decreasing the crystallinity and increasing the porosity. The index of crystallinity, which in the \"in natura\" bagasse was 44%, was reduced to 0, the surface area cumulative to molecules with diameters up to 10 nm, which in the \"in natura\" bagasse was 43 m2/g, was increased to 166 m2/g. Coupled with the removal of hemicellulose, such changes provided high efficiency of saccharification of glucan into glucose, 93% in 24 hours of hydrolysis. The enzymatic hydrolyzate was fermented by Scheffersomyces stipitis, producing 10,5 g/L ethanol in 48 hours of fermentation, the conversion efficiency of glucose into ethanol (YP/S) was 0,36 g/g, and the volumetric productivity (QP) was 0,22 g/Lhr.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a conversão dos açúcares do bagaço de cana em etanol, com foco na integração entre o pré-tratamento com H2SO4 diluído, sacarificação com celulases comerciais e fermentação com Scheffersomyces stipitis DSM- 3651, buscando-se uma configuração simplificada. Previamente aos ensaios de integração, o bagaço foi moído para a redução de sua heterogeneidade granulométrica. Após a moagem, o bagaço foi submetido a fracionamento, por fluxo de ar, separando frações de fibras e finos. Estas frações foram submetidas a analise composicional e observou-se que a fração de finos possui elevados teores de cinzas e extrativos, além de baixo teor de lignina em relação à fração de fibras, entretanto a estratégia de fracionamento do bagaço não foi seletiva. Os experimentos de definição da condição de pré-tratamento mais adequada para a avaliação entre integração entre sacarificação e fermentação foram conduzidos em reator Parr (2 gal) com 2Kg de mistura reacional, incluindo bagaço (10%), água e ácido. Três condições operacionais de pré-tratamento foram avaliadas: 140°C/1%H2SO4/20 min, 150°C/2% H2SO4/30 min e 160°C/3% H2SO4/40 min. Após o pré-tratamento, o slurry foi separado em sólido pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico, por filtração. Em seguida o bagaço pré-tratado foi lavado exaustivamente com água destilada e submetido à hidrólise enzimática com celulases (10 FPU/g bagaço) por 72h. Paralelamente, o hidrolisado foi submetido à fermentação com S. stipitis (3 g/L) por 120h. As composições das frações geradas após o pré-tratamento (bagaço pré-tratado, hidrolisado e água de lavagem), quanto aos teores de açúcares e sólidos (solúveis e insolúveis) foram determinadas. As três condições de pré-tratamento levaram a remoção completa de hemicelulose do bagaço, e o aumento da severidade do pré-tratamento acarretou em aumento da eficiência de sacarificação dos sólidos pré-tratados, porém em menor recuperação de glicose após hidrólise enzimática. Por outro lado, o aumento da severidade do pré-tratamento prejudicou a recuperação de açúcares no hidrolisado hemicelulósico, elevando concentrações de ácido acético, furfural e HMF, resultando em inibição completa de fermentação daqueles obtidos nas condições de 150°C e 160°C. A conversão do sólido prétratado (lavado ou não-lavado) + hidrolisado (destoxificado ou não), e do slurry completo (destoxificado ou não) ambos obtidos após pré-tratamento à 140°C, foi avaliada em duas configurações, respectivamente: \"Fermentação do hidrolisado hemicelulósico (FHH), em separado da sacarificação do sólido pré-tratado e da fermentação do hidrolisado celulósico, separadas (SHF)\" e \"Sacarificação do sólido pré-tratado, em separado da co-fermentação dos hidrolisados celulósico e hemicelulósico, integradas (ISHCF)\". Na primeira, observouse que a destoxificação do hidrolisado com lacase (1U/mL) aumentou a produção de etanol, e possibilitou a redução do tempo de conversão em 48h. A sacarificação de sólidos não-lavados foi prejudicada pela presença de compostos solúveis e o condicionamento com lacase não influenciou a eficiência de sacarificação. A eficiência máxima de conversão em configuração de SHF+FHH foi de 28,4%, devido a não lavagem do sólido pré-tratado (13,7%) e destoxificação do HH (14,7%). Em ISHCF, observou-se que a eficiência de conversão de slurry integral destoxificado com lacase é mais alta (38,9%) do que em SHF+FHH, devido a não separação sólido-líquido e maior disponibilidade de açúcares. / This study aimed to evaluate the conversion of sugarcane bagasse into ethanol, focusing on integration between pretreatment with dilute H2SO4, saccharification with commercial cellulases and fermentation with Scheffersomyces stipitis DSM-3651, in a simplified design process. Prior to integration assays, the bagasse was milled to reduce its granulometric heterogeneity. After milling, the fractions of bagasse (fiber and pith) were separated by air flow. These fractions had their chemical composition determined and it was observed that pith fraction has higher content of ash, soluble extractives and low lignin content than fiber fraction; however the separation method was not selective. The experiments to define the most suitable pretreatment condition for evaluating the integration between saccharification and fermentation were conducted in a Parr reactor (2 gal) with 2 kg of reaction mixture, including bagasse (10%), water and acid. Three operational conditions of pretreatment were evaluated: 140°C/1% H2SO4/20min, 150°C/ 2% H2SO4/30 min and 160°C/3% H2SO4/40min. After pretreatment, the slurry was separated in pretreated solid and hemicellulosic hydrolyzate, by filtration. The pretreated solid was thoroughly washed with distilled water and submitted to enzymatic hydrolysis with cellulases (10 FPU / g residue) for 72h. In parallel, the hemicelullosic hydrolyzate was submitted to fermentation with S. stipitis (3 g / L) for 120h. The compositions of the fractions generated after pretreatment (pretreated bagasse, hemicellulosic hydrolyzate and washing water), regarding sugars and solids (soluble and insoluble) contents were determined. All pretreatment conditions led to complete removal of hemicellulose from the bagasse, and the increase of pretreatment severity improved the saccharification yield of pretreated solid, but, leaded to low recovery of glucose after enzymatic hydrolysis. On the other hand, the increase of pretreatement severity impaired the recovery of sugars in hemicellulosic hydrolysate besides increasing the concentrations of acetic acid, furfural and HMF, resulting in complete inhibition of fermentation of those obtained under the pretreatement conditions of 150°C and 160°C. The conversion of pretreated solid (washed and non-washed) + hemicellulosic hydrolyzate (with or without detoxification) and of the whole slurry, both obtained at 140°C was evaluated in two process designs, respectively: \"Fermentation of hemicellulosic hydrolyzate (FHH), separated from hydrolysis of pretreated solid and fermentation of cellulosic hydrolyzate, separately (SHF)\" and \"Integrated hydrolysis of pretreated solid separated from co-fermentation of cellulosic and hemicellulosic hydrolysates (ISHCF)\". In the first, it was observed that the detoxification of the hydrolyzate with laccase (1U / ml) improved the ethanol production, particularly for conversion time. The saccharification of non-washed solid was hampered by the presence of soluble compounds and its conditioning treatment with laccase did not influence the saccharification yield. The maximum conversion efficiency in SHF + FHH configuration was 28.4% due to not washing the pretreated solid (13.7%) and detoxification of hemicellulosic hydrolysate (14.7%). In the second process design, it was observed that the conversion efficiency of whole slurry, with laccase detoxification, was higher (38.9%) than in the separate configuration, with a lower conversion time.

A fim de garantir a viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração é necessário o desenvolvimento de tecnologias eficientes para a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos. Além disso, o elevado consumo de água pelas biorrefinarias tem despertado grande atenção para a utilização de recursos hídricos não-potáveis, como a água do mar. Assim, atualmente busca-se por enzimas tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos gerados e/ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a purificação e caracterização cinética e bioquímica de uma ß-xilosidase produzida por uma linhagem do fungo mesófilo Colletotrichum graminicola. A enzima purificada (Bxcg) apresentou conteúdo de carboidratos totais de 54% (m/m), ponto isoelétrico de 4,2 e uma massa molecular aparente de cerca de 130 kDa, que foi reduzida para cerca de 92 kDa após deglicosilação. A enzima mostrou boa tolerância a elevadas concentrações de sal e manteve cerca de 90% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol L-1 (concentração média de NaCl na água do mar). A temperatura e pH ótimos de reação foram 65 ºC e 4,5, respectivamente, tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 mol L-1. Já na presença de NaCl 2,5 mol L-1 o pH ótimo de atividade foi alterado para 5,0. Bxcg permaneceu estável numa ampla faixa pH (4,0 - 7,5) tanto na ausência quanto na presença de sal. A enzima mostrou ótima estabilidade térmica e manteve completamente estável à 50 ºC após 24 horas de incubação. A presença de elevada concentração de NaCl (2,5 mol L-1) resultou num aumento na termoestabilidade da enzima. A atividade enzimática foi tolerante aos íons Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn 2+, Mg2+, K+ e Na+. Na ausência de sal, Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-D-xilopiranosídeo (pNP-XIL) com Vmáx de 348,8 ± 11,5 U mg-1, KM de 0,52 ± 0,02 mmol L-1 e alta eficiência catalítica (kcat/KM = 1432,7 ± 47,3 L mmol-1 s-1). Em presença de sal, a afinidade aparente de Bxcg pelo substrato foi levemente menor e a hidrólise ocorreu com Vmáx menor, resultando em eficiência catalítica cerca de 1,5 de vezes menor, se comparadas as condição de ausência de sal. A enzima apresentou atividade bifuncional de ?-xilosidase/?-L-arabinofuranosidase. Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-L-arabinopiranosídeo com afinidade aparente cerca de 18 vezes menor (KM = 9,6 ± 0,5 mmol L-1) que a estimada para pNP-XIL e a hidrólise do substrato ocorreu com Vmáx de 148,4 ± 4,4 U mg-1 e eficiência catalítica de 33,1 ± 1,6 L mmol-1 s-1. A enzima foi fortemente inibida por xilose com KI de 3,3 mmol L-1. Bxcg foi capaz de hidrolisar xilooligossacarídeos até xilohexaose, inclusive aqueles com ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. Bxcg e uma endo-xilanase purificada do mesmo microrganismo apresentaram um forte efeito sinérgico (3,1 vezes) para hidrólise de xilana beechwood. A enzima mostrou-se tolerante aos solventes butanol, glicerol, tolueno e acetona, bem como aos surfactantes Triton X-100, Tween 80 e Tween 20, enquanto que o líquido iônico acetato de 1-etil-3-metilimidazólio inibiu fortemente a atividade enzimática. De uma maneira geral, Bxcg apresenta propriedades atraentes para a aplicação em processos de sacarificação da biomassa lignocelulósica, incluindo aqueles conduzidos em elevada salinidade e/ou em presença de compostos residuais gerados ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa / In order to ensure the economic viability of the production of second-generation ethanol, it is necessary the development of efficient technologies for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials. In addition, the large consumption of water by biorefineries has attracted great attention for the use of non-potable water resources, such as seawater. Therefore, enzymes tolerant to high salt concentrations and the by-products generated and/or accumulated in the biomass pretreatment steps are widely studied. In this context, the objective of this study was the purification and kinetic and biochemical characterization of a ?-xylosidase produced by a strain of the mesophilic fungus Colletotrichum graminicola. The pure enzyme (Bxcg) showed a total carbohydrate content of 54% (w/w), isoelectric point of 4.2 and an apparent molecular weight of 130 kDa, which was reduced to 92 kDa after deglucosylation. The enzyme showed good tolerance to high salt concentrations and retained aproximately 90% of the control activity in the presence of 0.5 mol L-1 NaCl (NaCl concentration in seawater). The optimum reaction temperature and pH were 65 °C and 4.5, respectively, both in the absence and presence of 0.5 mol L-1 NaCl. In the presence of 2.5 mol L-1 NaCl, the optimum pH was altered to 5.0. Bxcg retained stable over a wide pH range (4.0 - 7.5) both in the absence and presence of salt. The enzyme showed excellent thermal stability and retained completely stable at 50 °C after 24 hours of incubation. The presence of high NaCl concentration (2.5 mol L-1) resulted in an increase in the thermostability of the enzyme. The enzymatic activity was tolerant to Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn2+, Mg2+, K+ and Na+. In the absence of salt, Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-D-xylopyranoside (pNP-XIL) with Vmax of 348.8 ± 11.5 U mg-1, KM of 0.52 ± 0.02 mmol L-1 and high catalytic efficiency (kcat/KM = 1432.7 ± 47.3 L mmol-1 s-1). In the presence of salt, the apparent affinity for the substrate was slightly lower and the hydrolysis occurred with smaller Vmax, resulting in catalytic efficiency 1.5 fold lower, when compared to the salt. The enzyme showed bifunctional ?-xylosidase/?-L-arabinofuranosidase activity. Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-L-arabinopyranoside with apparent affinity 18-fold lower (KM = 9.6 ± 0.5 mmol L-1) than that estimated for pNP-XIL and substrate hydrolysis occurred with Vmax of 148.4 ± 4.4 U mg-1 and catalytic efficiency of 33.1 ± 1.6 L mmol-1 s-1. The enzyme was strongly inhibited by xylose with KI of 3.3 mmol L-1. Bxcg was able to hydrolyze xylooligosaccharides from xylohexaose, including those with 4-O-methyl-glucuronic acid branch. Bxcg and a pure endo-xylanase from the same microorganism had a strong synergistic effect (3.1 fold) for hydrolysis of xylan beechwood. The enzyme was tolerant to the butanol, glycerol, toluene and acetone solvents, as well as the Triton X-100, Tween 80 and Tween 20 surfactants, whereas the 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ionic liquid strongly inhibited the enzymatic activity. In summary, Bxcg has attractive properties for application in saccharification processes of the lignocellulosic biomass, particularly under high salinity and/or in the presence of residues of biomass pretreatment steps

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1568529 bytes, checksum: 147a0674e2727bd463b090587ba885b5 (MD5) Previous issue date: 2010-07-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A model of an international energy matrix, ideally based on renewable and cleaner energy regarded to petrol, is justified because of the increasing awareness on the global warming issue. Moreover, researches on biofuel, as an alternative source of energy, are essential to guarantee the current ranking of the Brazilian energy autonomy, in addition to the interest in production of surplus so to guarantee exportation and generation of foreign exchange. Cellulose is the most abundant renewable biomass in the planet, therefore a good energetic alternative to petrol. Sugarcane has 2/3 of its mass in lingocellulosic material, an abundant energetic resource which is not efficiently used by the current technologies, therefore, representing an enormous potential for the production of lingocellulosic ethanol. Cellulose can be hydrolyzed in glucose residuals by enzymatic treatment as well as base of acids. Technically, there are some barriers associated to acid and /or enzymatic hydrolysis which need to be overcome. Considering enzymatic hydrolyses, the reaction takes place in a non-aggressive medium, however it takes a long waiting time (from 60 to 72 hours) to occur and the lignin compound is one of the main obstacles for the enzyme access to the cellulose. Thus, the present work aimed at obtaining progress for researches on cellulosic ethanol from the bagasse and, potentially, from other sugarcane by-products through selection of clones that shows high potential bioconvertibility fibers. The experiment was made up of 286 clones and 2 witnesses (RB867515 and SP80-1842) in 25 blocks. They were selected from 13 families of half-siblings and they were vegetative propagation first generation clones. Accordingly, it was carried out correlations among desirable biochemical and agronomical traits, evaluating the cause and effect relationship on fibers and lignin of the stem. It was also estimated the possibility on defining characters which have to be used to carry out a recurrent selection program on sugarcane aiming at alcohol production. It was selected 10 clones with highest lignin content and 10 clones with the lowest lignin content in the bagasse. Those 20 clones were evaluated for the possibility in obtaining a higher glucose content after enzymatic hydrolysis process for cellulosic alcohol production. It could be observed that the higher the content of lignin in the bagasse, the lower the content of glucose produced at the end of hydrolyzesprocess. It was also observed that hemicellulose is more efficient on the conversion than saccharification. Hemicellulose functions as a positive factor on fermentable sugar production for fermentation, because it breaks down cellulose structure allowing access of the enzymes and because of its rupture it supplies glucose molecules for fermentation. Therefore, selected clones show a high potential use on sugar cane genetic breeding, even though it is still needed phenotypic and gene expression analysis studies, enzymatic quantification and syntheses of metabolic, correlating them to syntheses of lignin. / Um modelo de matriz energética mundial, idealmente baseado em fontes mais limpas e renováveis de energia em relação ao petróleo, se justifica pela crescente preocupação com a questão do aquecimento global. Além disso, pesquisas em biocombustíveis como fontes alternativas de energia são essenciais para garantir a atual posição de autonomia energética brasileira, além do interesse pela produção de excedentes para garantir a exportação e geração de divisas. Celulose é a biomassa renovável mais abundante na face da terra e por isso, uma boa alternativa energética em relação ao petróleo. Cana de açúcar apresenta na sua massa 2/3 de sua massa em material ligno-celulósico, um recurso energético abundante não utilizado eficientemente por meio das tecnologias atuais, representando portanto, um enorme potencial para a produção de etanol ligno-celulósico. A celulose pode ser hidrolisada em resíduos de glicose tanto por tratamento enzimático ou a base de ácidos. Há inconvenientes associados à hidrólise ácida e/ou enzimática do ponto de vista técnico e que precisam ser superados. No caso da hidrólise enzimática, a reação ocorre em meio não agressivo, porém, requer um longo tempo de espera (60 a 72 horas) e a componente lignina apresenta-se como um dos principais barreiras para o acesso da enzima a celulose. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo obter avanços nas pesquisas em etanol celulósico a partir do bagaço e, potencialmente, outros resíduos provenientes do processamento da cana-de-açúcar, por meio da seleção de clones que apresentem fibra com elevado potencial de bioconversibilidade. O experimento foi composto por 286 clones e 2 testemunhas (RB867515 e SP80-1842) em 25 blocos. Tais clones foram selecionados de 13 famílias de meios-irmãos e constituíram clones de primeira geração de propagação vegetativa. Para isso efetuou correlações entre características agronômicas e bioquímicas desejáveis, avaliando a relação causa e efeito sobre o fibras e lignina dos colmos. Também estimou-se a possibilidade de definir os caracteres que deverem ser empregados para conduzir um programa de seleção recorrente em cana-de-açúcar visando à produção de álcool celulósico. Dos clones foram selecionas os 10 que apresentaram maior teor de lignina e os 10 que apresentaram menor teor de lignina no bagaço de cana. Os 20 clones foram avaliados quanta a possibilidade de se obter um maior teor de glicose após o processo de hidrólise enzimática para produção de álcool celulósico. Foi possível observar que quanto maior o teor de lignina no bagaço menor o teor de glicose produzida ao final do processo de hidrólise. Também foi observado que o caráter hemicelulose teve maior correlação com a sacarificação. A hemicelulose funciona como um fator positivo na produção de açúcares fermentáveis para a fermentação, pois abre a estrutura da celulose permitindo acesso enzimático e pela sua quebra fornece moléculas de glicose para a fermentação. Portanto os clones selecionados apresentam potencial para aplicação no melhoramento genético da cana de-açúcar, mesmo que ainda sejam necessários estudos complementares fenotípicos e de análise expressão gênica, quantificação enzimática e síntese de metabólicos, correlacionando-os com a síntese de lignina.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a fermentabilidade do hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino, visando a produção de etanol por leveduras. Inicialmente, o bagaço de cana foi pré-tratado com sulfito alcalino para remover parcialmente a lignina e alterar a estrutura da celulose e hemicelulose. Os efeitos deste pré-tratamento foram avaliados em termos da composição química dos materiais obtidos: um material lavado (BPL) e outro não lavado (BPNL) após tratamento. A digestibilidade enzimática dos materiais obtidos foi testada empregando dois extratos enzimáticos comercias e 3 cargas de enzimas, de acordo com um planejamento experimental 22. A partir destes resultados foi selecionado o extrato Cellubrix suplementado com ?-glicosidase na carga de 18 FPU/g de biomassa, e nesta condição os rendimentos de conversão de celulose e xilana foram cerca de 70% e 65%, respectivamente. Os hidrolisados enzimáticos do BPL e BPNL porém suplementados com nutrientes (2,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4, 0,3 g/L de MgSO4.7H2O, 5,0 g/L de extrato de levedura), e avaliados quanto a produção de etanol por K. marxianus Y-6860 a 40°C. Os resultados mostraram que a levedura produziu etanol apenas a partir de glicose, e os parâmetros fermentativos obtidos com o hidrolisado BPNL QP = 3,7 g/L.h e YP/S = 0,40 g/g foram 20 e 5%, respectivamente superior ao BPL. O hidrolisado enzimático do BPNL foi então selecionado, para avaliar o efeito da suplementação nutricional nos parâmetros fermentativos da levedura K. marxianus Y-6860, em três temperaturas diferentes (30, 35 e 40°C) de acordo com um planejamento experimental 22. Para efeito de comparação, foi também avaliada a fermentabilidade do hidrolisado BPNL pelas leveduras S. cerevisiae PE-2 e S. stipitis Y-7124. Os resultados mostraram que para as três leveduras estudadas, os valores dos parâmetros fermentativos, foram favorecidos a 30 °C na presença nutrientes. Nesta condição, as leveduras apresentaram valores de YP/S similares (~ 0,48 g/g), em quanto que o QP foi de 3,25; 2,17 e 0,95 g/L.h para K. marxianus, S. cerevisiae e S. stipitis, respectivamente. Ressalta-se ainda que nesta condição, a S. stipitis Y-7124 foi a única levedura, capaz de consumir completamente ambos os açúcares (glicose + xilose) e produzir uma concentração de etanol 46% maior comparado as outras leveduras. Foi avaliado também a fermentabilidade das três leveduras no hidrolisado enzimático BPNL com alta concentração de glicose (100 g/L), nas condições anteriormente selecionadas. Os resultados mostraram que, as três leveduras apresentaram potencial para produção de etanol a partir da glicose, com uma eficiência de conversão de etanol superior a 70%, no entanto deveriam se implementar estratégias para estimular o consumo de xilose. Com os resultados do presente trabalho se pode concluir que o hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino suplementado com nutrientes, é um meio com grande potencial para a produção de etanol com características favoráveis para ser eficientemente fermentado por diferentes espécies de leveduras. / The present work had the objective to evaluate the fermentability of the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pre-treated with alkali sulfite process, aiming the ethanol production by yeasts. Initially, sugarcane bagasse was pretreated with alkaline sulfite process to remove lignin partially. The effects of this pre-treatment, were evaluated in the chemical composition of the materials: one material washed after treatment (WB) and another unwashed material (UWB). The enzymatic digestibility of the obtained materials was tested using two commercial enzymatic extracts and three enzyme loads according to an experimental design 22. From these results, the Cellubrix extract supplemented with ?-glucosidase, was selected in the load of 18 FPU/g of biomass, in this condition the cellulose and xylan conversion yields were about 70% and 65%, respectively. The enzymatic hydrolysates of WB and UWB supplemented with nutrients (2,0 g/L (NH4)2 SO4, 1,0 g/L KH2 PO4, 0,3 g/L MgSO4 .7H2O, 5,0 g/L yeast extract), were evaluated for ethanol production by K. marxianus Y-6860 at 40°C. The results showed that the yeast produced ethanol only from glucose, and the fermentative parameters obtained with the UWB hydrolyzate QP= 3,7 g/L.h and YP/S= 0,40 g/g, were 20 and 5% respectively higher to WB. The UWB hydrolyzate, was selected to evaluate the effect of nutritional supplementation, in the fermentative parameters of K. marxianus, at three different temperatures (30, 35 and 40°C) according to an experimental design 22. For comparison, were also evaluated fermentability of S. cerevisiae PE-2 and S. stipitis Y-7124 in the hydrolyzate. In the three yeasts, the results showed that the values of the fermentative parameters, are favored when the hydrolyzate is supplemented with nutrients to 30°C. In this condition , yeasts showed similar YP/S value (~0,48 g/g), whereas the QP was of 3,25; 2,17 and 0,95 g/L.h for K. marxianus, S. cerevisiae and S. stipitis, respectively. It is also worth noting that in this condition S. stipitis was the only yeast able to completely consume both sugars (glucose+xylose) and produce a concentration of ethanol of 46% higher than other yeasts. In the previously selected condition, the fermentability of the hydrolyzate with high glucose concentration (100 g/L) was also evaluated. The results showed that the three yeasts presented potential for the production of ethanol from glucose, with an ethanol efficiency of over 70%, however strategies should be implemented to stimulate the consumption of xylose. With the results of the present work it can be concluded that the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pretreated with alkaline sulfite process supplemented with nutrients is a medium with great potential for the production of ethanol with characteristics favorable to be efficiently fermented by different species of yeasts.

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Awan_AlmasTaj_D.pdf: 4796874 bytes, checksum: 185a66c389aae68c266f385689030ef0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os biocombustíveis de segunda geração surgiram como fontes energéticas promissoras, podendo ser obtidos a partir de vários tipos de biomassa que não seja utilizada para alimentos. Um tipo de biomassa que apresenta baixo custo além de apresentar níveis elevados de carboidratos, é a biomassa obtida após o processamento da laranja (Citrus processing waste from oranges, CPWO). Há um grande interesse na exploração desta biomassa em termos da produção do bioetanol (etanol da 2G). Nosso trabalho visa melhorar os processos de hidrólise do CPWO comparando o rendimento do processo clássico de hidrólise ácida com aplicação de enzimas comerciais ou provenientes do microrganismo Xanthomonas axonopodis pv. citri, cepa 306 (um fitopatógeno). Os resultados obtidos com a presente investigação evidenciam que ocorreu a conversão bem-sucedida do CPWO em uma mistura de açúcares. A posteriori, os açúcares redutores que foram obtidos foram convertidos em bioetanol por meio da fermentação em mono- e co-cultura. Para tanto, foi empregada a espécie Saccharomyces cerevisiae e duas cepas de Candida parapsilosis IFM 48375 e NRRL Y-12969, sendo que as duas últimas foram isoladas a partir do bagaço da laranja. Os rendimentos em termos de bioetanol obtido nas fermentações aplicando co-culturas estavam ao redor de 50 a 62%, constituindo valores muito maiores comparados com os obtidos por cepas usadas individualmente. Além disso, os açúcares foram consumidos mais rapidamente (6 h), tornando tais processos atraentes em termos de custo e aplicações comerciais / Abstract: Second generation biofuels from renewable resources have come forth as a result of energy security coupled with diminishing fossil fuel resources. Lignocellulosic biomass is a renewable resource, which can be converted in to liquid transportation fuels. Utilization of agro-industrial waste for the generation of biofuels makes it a cleaner production (Green Chemistry). Brazil is the world¿s largest producer of oranges. The current project deals with Citrus Processing Waste from Oranges (CPWO), and obtaining valuable products such as bioethanol, hesperidin, and essential oil. The process of hydrolyzing CPWO was improved and the classical way of biomass saccharification, i.e. acid hydrolysis, was compared with the enzyme hydrolysis. In enzyme hydrolysis, apart from applying commercial enzymes, saccharification was also investigated with protein extracts of Xanthomonas axonopodis pv. citri strain 306 (Xac 306), a potent pathogen that causes Citrus canker disease. Later, the obtained reducing sugars were converted into bioethanol by submerged mono- and co-culture fermentations that involved three yeast strains: Saccharomyces cerevisiae, Candida parapsilosis IFM 48375 and NRRL Y-12969, the last two being isolated from bagasse. Results demonstrated successful hydrolyses by Xac enzymes that released high levels of fermentable sugars. Also during co-culture fermentation processes, it was noticed that ethanol yield was improved from 50% to 62% w/w (calculated on the basis of total dry matter contents) and sugars were consumed faster. Thus by employing co-culture fermentation strategy, apart from getting better bioethanol yields, fermentation time is also reduced that makes it a cost effective technique / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

Xylanases have an important role as biocatalysts in different agroindustrial processes, such as saccharification of plant residues for the production of ethanol and bleaching of wood pulp for the production of pulp. On an industrial scale, these processes may require extreme pH or temperature, which require enzymes compatible with these conditions. Most enzymes available or showing commercial potential is synthesized by fungi or bacteria belonging to a few genera. Evaluation of rare isolation bacteria is an important strategy to expand the diversity of xylanases and their potential in terms of activity, stability and technological application. The aim of this study was to evaluate a collection of common and rare isolation soil bacteria regarding to xylanase activity and characterize the stability conditions of temperature and pH. The analyzed collection consists of 120 isolates with representatives from six phyla that were subjected to screening for xylanase activity in pure cultures and in the extracellular proteic extract (EPE). The ratio between the halos diameters of xylan hydrolysis and in the colonies on solid medium (ratio H:C), incubated at 30 ° C for up to 14 days, was used for the evaluation of cultures as a selection criteria. The effects of different sources of variation in the bacteria isolation stage (original soil, culture medium, solidifying agent, inoculum dilution and plating method and incubation time to colony appearance) and the group of bacterial isolation (rare or common) on the frequency of isolates with high xylanase activity were evaluated based on the ratio H:C. EPEs were obtained in liquid media containing xylan inoculated with the eleven isolates with highest ratios H:C. The extracts were evaluated for the specific xylanase activity at 50 °C for 1 h. Extracts of the three isolates with the highest potential for activity under this condition were evaluated for optimum activity, stability, activity at 60 oC and at pH 4.0, 5.5 and 8.0. Twenty-two isolates (25%), including eight from rare isolation, showed xylanase activity under the conditions evaluated, and found a high variability (> 230%) between these isolates. No isolation factor or rare or common isolation condition were associated with efficiency of xylanase activity in solid medium. High variability in specific xylanase activity in EPEs was also found among isolates (1500%), highlighting two rare isolates (TC119 and TC21), from Alfaproteobacteria class, and one common isolate (TC99), from Ralstoniaceae family. Extracellular xylanases from TC21 and TC119 showed high relative activity at temperatures up to 70 oC and were insensitive to pH in the range 4.0 to 8.0; however, TC99 isolate showed optimum temperature at 40 °C and low stability to temperature and pH. Extracellular xylanases from TC119 showed no cellulolytic activity. Rare isolation soil bacteria show high potential as a source of extracellular xylanases adapted to extreme pH and temperature conditions, which are required in agroindustrial processes. / As xilanases apresentam papel relevante como biocatalisadores de diferentes processos agroindustriais, como a sacarificação de resíduos vegetais para a produção de etanol e o clareamento de polpas de madeira para a produção de celulose. Em escala industrial, estes processos podem requerer pH e, ou, temperatura extremos, os quais demandam enzimas compatíveis com estas condições. A maioria das enzimas disponíveis ou com potencial comercial é sintetizada de fungos ou de bactérias pertencentes a poucos gêneros. A avaliação de bactérias de isolamento raro constitui-se em estratégia importante para ampliar a diversidade de xilanases e suas potencialidades em termos de atividade, estabilidade e aplicação tecnológica. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma coleção de bactérias do solo de isolamento comum e raro quanto à atividade de xilanases e caracterizar estas enzimas quanto à estabilidade a condições contrastantes de temperatura e pH. A coleção analisada é composta de 120 isolados com representantes de seis filos e foi submetida à seleção quanto à atividade de xilanases em culturas puras e no extrato proteico extracelular (EPE). Para a avaliação das culturas, utilizou-se como critério de seleção a relação entre os diâmetros de halos de hidrólise de xilana e das colônias em meio sólido (relação H:C), incubado a 30 oC por até 14 dias. Os efeitos de diferentes fontes de variação da fase de isolamento destas bactérias (solo de origem, meio de cultura, agente solidificante, diluição do inóculo e método de plaqueamento e tempo de incubação até surgimento de colônias) e do grupo de isolamento bacteriano (raro ou comum) sobre a frequência de isolados com alta atividade de xilanase foram avaliados com base na relação H:C. EPEs foram obtidos em meios líquidos contendo xilana inoculados com os onze isolados com maiores relações H:C. Os extratos foram avaliados quanto à atividade específica de xilanases a 50 oC, por 1 h. Os extratos dos três isolados com maior potencial de atividade sob esta condição foram avaliados quanto à temperatura ótima de atividade, estabilidade de atividade a 60 oC e a valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0. Vinte e dois isolados (25%), incluindo oito de isolamento raro, apresentaram atividade de xilanase nas condições avaliadas, sendo encontrada uma alta variabilidade (>230%) entre estes isolados. Nenhum fator de isolamento ou a condição de isolado raro ou comum foram associadas à eficiência de atividade de xilanases em meio sólido. Alta variabilidade de atividade específica de xilanases nos EPEs também foi encontrada entre os isolados (1500%), com destaque para dois de cultivo raro (TC119 e TC21), da classe Alfaproteobacteria, e um de cultivo comum (TC99), da família Ralstoniaceae. As xilanases extracelulares de TC119 e TC21 apresentaram elevada atividade relativa em temperaturas de até 70 oC e foram pouco sensíveis ao pH na faixa de 4,0 a 8,0; entretanto, as de TC99 apresentaram temperatura ótima de 40 oC, baixa estabilidade a temperatura e pH. Xilanases extracelulares de TC119 não apresentaram atividade celulolítica. Bactérias do solo de isolamento raro apresentam alto potencial como fonte de xilanases extracelulares adaptadas a condições extremas de pH e temperatura requeridas em processos agroindustriais.