Cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas. Em plantas, as fitocistatinas, constituem uma família independente, caracterizada pela presença do motivo conservado LARFAV. Elas podem estar envolvidas em uma grande variedade de processos fisiológicos, desde o controle da proteólise endógena em órgãos reprodutivos e vegetativos, até a inibição de proteases extracelulares de herbívoros, parasitas e patógenos. Algumas fitocistatinas possuem uma extensão carboxi-terminal em sua sequência, com um motivo consenso SNSL importante para a inibição de legumaínas. Em arroz, existem doze genes distintos de fitocistatinas, sendo a fitocistatina XII (OcXII) a única com um domínio extra carboxi-terminal. Considera-se esta extensão extremamente importante, pois permitiria a atuação bifuncional deste inibidor de proteinase, simultaneamente inibindo dois tipos de proteases, papaínas e legumaínas. O objetivo principal que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi identificar as doze fitocistatinas de arroz (Oryza sativa), caracterizando, principalmente, o gene da OcXII, de forma a analisar as prováveis implicações funcionais deste gene na planta. A caracterização da expressão dos doze genes codificadores das fitocistatinas revelou que os genes comumente mais expressos são OcI, OcIII e OcXII, sendo que OcXII destaca-se nas plantas em estádio final de maturação das sementes, em tecidos específicos de endosperma e células em cultura. Para germinação e crescimento de plântulas, é necessária uma redução da expressão de OcXII. O padrão evolutivo das fitocistatinas, em diversas plantas, sugere uma origem comum para estes genes, seguida de divergências e duplicações específicas em cada espécie. A OcXII é mantida em um grupo monofilético com as demais fitocistatinas com extensão C-terminal. Nos estudos funcionais sobre a fitocistatina XII de arroz, nove linhagens de plantas RNAi para o gene OcXII foram obtidas via transformação de calos de arroz (ssp. japonica, cv. Nipponbare). Quatro destas linhagens apresentaram nível de pelo menos 90% de silenciamento de OcXII, sem alteração na expressão gênica das demais fitocistatinas e legumaínas. Duas destas linhagens tiveram alterações fenotípicas com redução da viabilidade das sementes geradas. O silenciamento de OcXII e expressão de demais fitocistatinas manteve-se inalterado na geração T1, enquanto as legumaínas 1 e 3 sofreram alterações em pelo menos uma das linhagens. A transformação de plantas para estudos de localização celular com o promotor do gene OcXII, resultou em quatro linhagens transformadas, sendo que em uma delas a expressão do gene repórter gus, controlado pelo promotor OcXII, foi significativamente detectada nos calos em vias de regeneração de plantas. Também, pode ser verificado que a OcXII responde ao tratamento com ABA (ácido abscísico), tendo um aumento de expressão significativo após 4 horas, tanto em tecidos de folha quanto de raiz. Desta forma, a fitocistatina XII é um dos genes de fitocistatinas mais expressos durante todo o desenvolvimento das plantas de arroz, sendo o único gene com provável capacidade de inibir proteases cisteínicas do tipo legumaínas. / Cystatins are cysteine proteases competitive inhibitors. Phytocystatins (PhyCys), in plants, constitute an independent family due to the presence of the LARFAV conserved domain. PhyCys are involved in a wide variety of physiological processes, since the control of the endogenous proteolysis in vegetative and reproductive organs, by inhibition of extracellular proteases from herbivores, pathogens and parasites. Some phytocystatins have an extension in their carboxy terminal sequence with a SNSL consensus domain, important for inhibiting legumains. In rice, there are twelve distinct phytocystatins genes and the phytocystatin XII (OcXII) are the only one with a carboxy-terminal additional domain. This extension would be extremely important, allowing the bifunctional performance of this proteinase inhibitor, simultaneously inhibiting two types of proteases: papains and legumains. A main goal of this work is to identify the twelve phytocystatins in rice (Oryza sativa), focusing at the OcXII gene in order to analyze the functional implications of this gene in the hole plant. Characterization of the gene expression pattern of the twelve phytocystatins revealed that the genes more ubiquously expressed are OCI, OcIII and OcXII. OcXII stands out in plants in final stage of seed maturation, in endosperm specific tissues and in culture cells. For germination and seedling growth OcXII undergoes a reduction in its genic expression. The phytocystatins evolution patterns in various plants, suggests a common origin for these genes, followed by divergences and duplications, specific to each species. The OcXII, is kept in a monophyletic group with all the other phytocystatins with C-terminal extension. In the functional studies on phytocystatin XII from rice, nine lines of RNAi plants were obtained by transformation of rice’s callus (japonica ssp. cv. Nipponbare). Four of these strains had low levels of OcXII mRNA, revealing that this gene were at least 90% silenced, any changes in gene expression for other phytocystatins or legumains were detected. Two of these transgenic lines showed phenotypic changes with reduced seed viability. The OcXII gene silencing and other phytocystatins expression remained unchanged in the T1 generation, while the first and third legumains varied in at least one of the strains. The plants transformation, for cellular localization studies with OcXII gene promoter resulted in four transgenic strains, and in one of them expression of the gus reporter gene, controlled by the promoter OcXII, was significantly detected in the calli undergoing the plant regeneration process. Also, it can be noticed that the OcXII gene expression responds to the treatment with ABA (abscisic acid), with a significant increase, in both tissues as leaf root, after 4 hours of treatment. Thus, phytocystatin XII is one of the most expressed genes troughout the development of rice plants, being the only gene with the probable ability to inhibit cysteine proteases of legumain type, in addition to papain proteases.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2001. / Härtill 4 uppsatser.

Cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas. Em plantas, as fitocistatinas, constituem uma família independente, caracterizada pela presença do motivo conservado LARFAV. Elas podem estar envolvidas em uma grande variedade de processos fisiológicos, desde o controle da proteólise endógena em órgãos reprodutivos e vegetativos, até a inibição de proteases extracelulares de herbívoros, parasitas e patógenos. Algumas fitocistatinas possuem uma extensão carboxi-terminal em sua sequência, com um motivo consenso SNSL importante para a inibição de legumaínas. Em arroz, existem doze genes distintos de fitocistatinas, sendo a fitocistatina XII (OcXII) a única com um domínio extra carboxi-terminal. Considera-se esta extensão extremamente importante, pois permitiria a atuação bifuncional deste inibidor de proteinase, simultaneamente inibindo dois tipos de proteases, papaínas e legumaínas. O objetivo principal que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi identificar as doze fitocistatinas de arroz (Oryza sativa), caracterizando, principalmente, o gene da OcXII, de forma a analisar as prováveis implicações funcionais deste gene na planta. A caracterização da expressão dos doze genes codificadores das fitocistatinas revelou que os genes comumente mais expressos são OcI, OcIII e OcXII, sendo que OcXII destaca-se nas plantas em estádio final de maturação das sementes, em tecidos específicos de endosperma e células em cultura. Para germinação e crescimento de plântulas, é necessária uma redução da expressão de OcXII. O padrão evolutivo das fitocistatinas, em diversas plantas, sugere uma origem comum para estes genes, seguida de divergências e duplicações específicas em cada espécie. A OcXII é mantida em um grupo monofilético com as demais fitocistatinas com extensão C-terminal. Nos estudos funcionais sobre a fitocistatina XII de arroz, nove linhagens de plantas RNAi para o gene OcXII foram obtidas via transformação de calos de arroz (ssp. japonica, cv. Nipponbare). Quatro destas linhagens apresentaram nível de pelo menos 90% de silenciamento de OcXII, sem alteração na expressão gênica das demais fitocistatinas e legumaínas. Duas destas linhagens tiveram alterações fenotípicas com redução da viabilidade das sementes geradas. O silenciamento de OcXII e expressão de demais fitocistatinas manteve-se inalterado na geração T1, enquanto as legumaínas 1 e 3 sofreram alterações em pelo menos uma das linhagens. A transformação de plantas para estudos de localização celular com o promotor do gene OcXII, resultou em quatro linhagens transformadas, sendo que em uma delas a expressão do gene repórter gus, controlado pelo promotor OcXII, foi significativamente detectada nos calos em vias de regeneração de plantas. Também, pode ser verificado que a OcXII responde ao tratamento com ABA (ácido abscísico), tendo um aumento de expressão significativo após 4 horas, tanto em tecidos de folha quanto de raiz. Desta forma, a fitocistatina XII é um dos genes de fitocistatinas mais expressos durante todo o desenvolvimento das plantas de arroz, sendo o único gene com provável capacidade de inibir proteases cisteínicas do tipo legumaínas. / Cystatins are cysteine proteases competitive inhibitors. Phytocystatins (PhyCys), in plants, constitute an independent family due to the presence of the LARFAV conserved domain. PhyCys are involved in a wide variety of physiological processes, since the control of the endogenous proteolysis in vegetative and reproductive organs, by inhibition of extracellular proteases from herbivores, pathogens and parasites. Some phytocystatins have an extension in their carboxy terminal sequence with a SNSL consensus domain, important for inhibiting legumains. In rice, there are twelve distinct phytocystatins genes and the phytocystatin XII (OcXII) are the only one with a carboxy-terminal additional domain. This extension would be extremely important, allowing the bifunctional performance of this proteinase inhibitor, simultaneously inhibiting two types of proteases: papains and legumains. A main goal of this work is to identify the twelve phytocystatins in rice (Oryza sativa), focusing at the OcXII gene in order to analyze the functional implications of this gene in the hole plant. Characterization of the gene expression pattern of the twelve phytocystatins revealed that the genes more ubiquously expressed are OCI, OcIII and OcXII. OcXII stands out in plants in final stage of seed maturation, in endosperm specific tissues and in culture cells. For germination and seedling growth OcXII undergoes a reduction in its genic expression. The phytocystatins evolution patterns in various plants, suggests a common origin for these genes, followed by divergences and duplications, specific to each species. The OcXII, is kept in a monophyletic group with all the other phytocystatins with C-terminal extension. In the functional studies on phytocystatin XII from rice, nine lines of RNAi plants were obtained by transformation of rice’s callus (japonica ssp. cv. Nipponbare). Four of these strains had low levels of OcXII mRNA, revealing that this gene were at least 90% silenced, any changes in gene expression for other phytocystatins or legumains were detected. Two of these transgenic lines showed phenotypic changes with reduced seed viability. The OcXII gene silencing and other phytocystatins expression remained unchanged in the T1 generation, while the first and third legumains varied in at least one of the strains. The plants transformation, for cellular localization studies with OcXII gene promoter resulted in four transgenic strains, and in one of them expression of the gus reporter gene, controlled by the promoter OcXII, was significantly detected in the calli undergoing the plant regeneration process. Also, it can be noticed that the OcXII gene expression responds to the treatment with ABA (abscisic acid), with a significant increase, in both tissues as leaf root, after 4 hours of treatment. Thus, phytocystatin XII is one of the most expressed genes troughout the development of rice plants, being the only gene with the probable ability to inhibit cysteine proteases of legumain type, in addition to papain proteases.

Cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas. Em plantas, as fitocistatinas, constituem uma família independente, caracterizada pela presença do motivo conservado LARFAV. Elas podem estar envolvidas em uma grande variedade de processos fisiológicos, desde o controle da proteólise endógena em órgãos reprodutivos e vegetativos, até a inibição de proteases extracelulares de herbívoros, parasitas e patógenos. Algumas fitocistatinas possuem uma extensão carboxi-terminal em sua sequência, com um motivo consenso SNSL importante para a inibição de legumaínas. Em arroz, existem doze genes distintos de fitocistatinas, sendo a fitocistatina XII (OcXII) a única com um domínio extra carboxi-terminal. Considera-se esta extensão extremamente importante, pois permitiria a atuação bifuncional deste inibidor de proteinase, simultaneamente inibindo dois tipos de proteases, papaínas e legumaínas. O objetivo principal que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi identificar as doze fitocistatinas de arroz (Oryza sativa), caracterizando, principalmente, o gene da OcXII, de forma a analisar as prováveis implicações funcionais deste gene na planta. A caracterização da expressão dos doze genes codificadores das fitocistatinas revelou que os genes comumente mais expressos são OcI, OcIII e OcXII, sendo que OcXII destaca-se nas plantas em estádio final de maturação das sementes, em tecidos específicos de endosperma e células em cultura. Para germinação e crescimento de plântulas, é necessária uma redução da expressão de OcXII. O padrão evolutivo das fitocistatinas, em diversas plantas, sugere uma origem comum para estes genes, seguida de divergências e duplicações específicas em cada espécie. A OcXII é mantida em um grupo monofilético com as demais fitocistatinas com extensão C-terminal. Nos estudos funcionais sobre a fitocistatina XII de arroz, nove linhagens de plantas RNAi para o gene OcXII foram obtidas via transformação de calos de arroz (ssp. japonica, cv. Nipponbare). Quatro destas linhagens apresentaram nível de pelo menos 90% de silenciamento de OcXII, sem alteração na expressão gênica das demais fitocistatinas e legumaínas. Duas destas linhagens tiveram alterações fenotípicas com redução da viabilidade das sementes geradas. O silenciamento de OcXII e expressão de demais fitocistatinas manteve-se inalterado na geração T1, enquanto as legumaínas 1 e 3 sofreram alterações em pelo menos uma das linhagens. A transformação de plantas para estudos de localização celular com o promotor do gene OcXII, resultou em quatro linhagens transformadas, sendo que em uma delas a expressão do gene repórter gus, controlado pelo promotor OcXII, foi significativamente detectada nos calos em vias de regeneração de plantas. Também, pode ser verificado que a OcXII responde ao tratamento com ABA (ácido abscísico), tendo um aumento de expressão significativo após 4 horas, tanto em tecidos de folha quanto de raiz. Desta forma, a fitocistatina XII é um dos genes de fitocistatinas mais expressos durante todo o desenvolvimento das plantas de arroz, sendo o único gene com provável capacidade de inibir proteases cisteínicas do tipo legumaínas. / Cystatins are cysteine proteases competitive inhibitors. Phytocystatins (PhyCys), in plants, constitute an independent family due to the presence of the LARFAV conserved domain. PhyCys are involved in a wide variety of physiological processes, since the control of the endogenous proteolysis in vegetative and reproductive organs, by inhibition of extracellular proteases from herbivores, pathogens and parasites. Some phytocystatins have an extension in their carboxy terminal sequence with a SNSL consensus domain, important for inhibiting legumains. In rice, there are twelve distinct phytocystatins genes and the phytocystatin XII (OcXII) are the only one with a carboxy-terminal additional domain. This extension would be extremely important, allowing the bifunctional performance of this proteinase inhibitor, simultaneously inhibiting two types of proteases: papains and legumains. A main goal of this work is to identify the twelve phytocystatins in rice (Oryza sativa), focusing at the OcXII gene in order to analyze the functional implications of this gene in the hole plant. Characterization of the gene expression pattern of the twelve phytocystatins revealed that the genes more ubiquously expressed are OCI, OcIII and OcXII. OcXII stands out in plants in final stage of seed maturation, in endosperm specific tissues and in culture cells. For germination and seedling growth OcXII undergoes a reduction in its genic expression. The phytocystatins evolution patterns in various plants, suggests a common origin for these genes, followed by divergences and duplications, specific to each species. The OcXII, is kept in a monophyletic group with all the other phytocystatins with C-terminal extension. In the functional studies on phytocystatin XII from rice, nine lines of RNAi plants were obtained by transformation of rice’s callus (japonica ssp. cv. Nipponbare). Four of these strains had low levels of OcXII mRNA, revealing that this gene were at least 90% silenced, any changes in gene expression for other phytocystatins or legumains were detected. Two of these transgenic lines showed phenotypic changes with reduced seed viability. The OcXII gene silencing and other phytocystatins expression remained unchanged in the T1 generation, while the first and third legumains varied in at least one of the strains. The plants transformation, for cellular localization studies with OcXII gene promoter resulted in four transgenic strains, and in one of them expression of the gus reporter gene, controlled by the promoter OcXII, was significantly detected in the calli undergoing the plant regeneration process. Also, it can be noticed that the OcXII gene expression responds to the treatment with ABA (abscisic acid), with a significant increase, in both tissues as leaf root, after 4 hours of treatment. Thus, phytocystatin XII is one of the most expressed genes troughout the development of rice plants, being the only gene with the probable ability to inhibit cysteine proteases of legumain type, in addition to papain proteases.

La cameline, Camelina sativa (Brassicaceae), fait aujourd'hui l'objet d'un regain d'intérêt. Il s'agit d'une plante aux vocations multiples (bioénergétique, industrielle, alimentaire), aux exigences agronomiques faibles et qui semble peu sujette aux attaques de ravageurs phytophages.Trois objectifs visant à appréhender la complexité des interactions multitrophiques autour de la cameline ont été définis au cours de ce travail de thèse. Le premier visait à déterminer le rôle de la cameline en tant que réservoir à pucerons ravageurs. Les deux autres reposaient sur les études des impacts des pratiques culturales (fertilisation azotée, culture en association) et des virus de plantes, sur les interactions tritrophiques cameline/pucerons/parasitoïdes. Les premiers résultats ont permis de montrer que la cameline pouvait être considérée comme plante réservoir pour différentes espèces de pucerons ravageurs présents dans les paysages agricoles du nord de la France, qu'il s'agisse d'espèces inféodées aux Brassicaceae (Brevicoryne brassicae), d'espèces polyphages (Myzus persicae, Aphis fabae) ou encore d'espèces spécialistes des Poaceae (Rhopalosiphum padi). En ce qui concerne les deux pratiques culturales étudiées, l'association de la cameline avec la fèverole a engendré des effets délétères sur le contrôle biologique du puceron Aphis fabae par le parasitoïde Aphidius matricariae. Le comportement des femelles A. matricariae ne semble pas satisfaire à la théorie de "l’optimal foraging". En parallèle, des effets de la fertilisation azotée ont été observés sur les trois niveaux trophiques et ont varié en fonction de la dose apportée à la plante et du degré de spécialisation du puceron. Ainsi, notre étude montre que les pratiques culturales peuvent avoir des répercussions importantes de type "bottom-up" sur les niveaux trophiques supérieurs. Enfin, nous avons montré un impact des deux virus de plantes étudiés qui s'est révélé variable non seulement en fonction du mode mais aussi de l'efficacité de la transmission par le puceron-vecteur. Ce dernier travail a également permis de mettre en évidence des effets "bottom-up" d'un virus sur le comportement de sélection de l'hôte par un parasitoïde de puceron mais aussi sur la physiologie des partenaires appartenant aux trois niveaux trophiques. En effet, les performances du puceron-vecteur sur la plante infectée semblent améliorées alors que celles du parasitoïde sont altérées, ce qui pourrait se traduire par une meilleure propagation du virus. Ces travaux soulignent l'importance de la prise en compte des relations multitrophiques avant la (ré-) introduction d’une espèce de plante dans les agro-écosystèmes, et en particulier l'intérêt d'identifier les risques associés en termes de pression de ravageurs et de pathogènes / Camelina (Camelina sativa, Brassicaceae) has recently received great attention as an alternative oil-seed crop presenting various (bioenergetic, industrial, alimentary) advantages, requiring low agronomic inputs and exhibiting few attacks by phytophagous insects.In this thesis, three objectives have been defined to understand the complexity of the multi-trophic interactions involving camelina. The first one was to determine the role of camelina as a reservoir of aphid pests. The other two were based on the study of the effects of cultural practices (nitrogen fertilization, mixed crops) and plant viruses on the tritrophic interactions involving camelina, aphids and parasitoids.Results have shown that camelina could be considered as a plant reservoir for various aphid pest species occurring in the agricultural landscape of northern France, among which were found not only species usually restricted to Brassicaceae (Brevicoryne brassicae), but also polyphagous species (Myzus persicae, Aphis fabae) and specialists of Poaceae (Rhopalosiphum padi). Regarding the two studied agricultural practices, the association of camelina with faba bean induced deleterious effects on the biological control of the aphid Aphis fabae by the parasitoid Aphidius matricariae. The behavior of parasitoid females did not seem in line with the "optimal foraging" theory. In addition, several effects of nitrogen fertilization have been observed on the three trophic levels depending on both the dose given to the plant and the degree of specialization of the aphid. Thus, our study has shown that cultural practices could have significant "bottom-up" impacts on higher trophic levels. Finally, we have shown the two studied plant viruses had an impact which not only varied depending on the virus mode of transmission by the vector but also according to its transmission efficiency. This work also revealed the existence of "bottom-up" effects of a virus on the host selection behavior by an aphid parasitoid as well as on the physiology of the partners belonging to three trophic levels. Indeed, the performance of the aphid vector was improved on the infected plant whereas that of the parasitoid was impaired, which could lead to a better spread of the virus.This work highlights not only the importance of taking into account the associated multi-trophic relations before the (re-) introduction of a plant species within agro-ecosystems but also the importance of identifying the risks in terms of pests and pathogens pressure

O florescimento exerce um grande efeito no sucesso reprodutivo e adaptativo das plantas. A resposta a sinais ambientais, tais como fotoperíodo e vernalização, representa uma estratégia reprodutiva importante utilizada pela aveia (Avena sativa L.) e outros cereais. Esta estratégia visa garantir que o florescimento ocorra na época mais favorável dentro da estação de crescimento. Os objetivos deste estudo foram avaliar a variação fenotípica em uma população de linhagens recombinantes de aveia derivada do cruzamento entre genitores contrastantes para o florescimento e caracterizar sequências de nucleotídeos de aveia associadas com genes de vernalização. Uma população de 108 linhagens, derivada do cruzamento entre ‘UFRGS 8’ (insensível ao fotoperíodo e à vernalização) e ‘UFRGS 930605’ (sensível ao fotoperíodo e à vernalização) foi utilizada. Os experimentos foram conduzidos em duas épocas de semeadura, nos anos de 2013 e 2014. O número de dias ao florescimento e a resposta à semeadura no cedo foram avaliados. Pares de primers específicos para o gene Vrn1 desenvolvidos a partir do alinhamento de sequências de trigo, cevada e azevém foram utilizados para amplificar e clonar sequências de aveia. A partir dos resultados do número de dias ao florescimento, as linhagens recombinantes foram classificadas como insensíveis, intermediárias e sensíveis a ambos sinais de fotoperíodo e vernalização. As linhagens recombinantes exibiram relação similar no número de dias ao florescimento, nas diferentes épocas de semeadura e anos avaliados. A resposta à semeadura no cedo apresentou valores negativos nos dois anos de avaliação para todas as linhagens e, associação negativa com o número de dias ao florescimento. A variação fenotípica do florescimento observada entre as linhagens recombinantes demonstrou a existência de diferentes mecanismos genéticos que controlam a resposta ao fotoperíodo e à vernalização. A análise molecular revelou a presença de pelo menos duas variações alélicas para o gene Vrn1 nos genitores UFRGS 8 e UFRGS 930605. Entretanto, estas variações alélicas precisam ser validadas quanto ao seu potencial de uso em estudos que visam o mapeamento molecular do gene Vrn1 em aveia. / Flowering time exerts a great effect in the reproductive and adaptive success of plants. The response to environmental cues, such as photoperiod and vernalization, represents an important reproductive strategy used by oat (Avena sativa L.) and other small grain cereals. This strategy aims to ensure that flowering occurs at the most favorable time within the growing season. The objectives of this study were to assess the phenotypic variation in a population of oat recombinant inbred lines derived from the cross between contrasting parental lines for flowering time and to characterize oat nucleotide sequences associated with vernalization genes. A population with 108 lines, derived from the cross between ‘UFRGS 8’ (insensitive to photoperiod and vernalization) and ‘UFRGS 930605’ (sensitive to photoperiod and vernalization) was used. The experiments were carried out in two growing seasons, over the years of 2013 and 2014. The number of days to flowering and the response to early sowing were evaluated. Specific primer pairs for the Vrn1 gene developed from sequence alignments of wheat, barley and ryegrass were used to amplify and clone oat sequences. Considering the number of days to flowering, recombinant inbred lines were classified as insensitive, intermediate, and sensitive to both photoperiod and vernalization cues. The recombinant lines exhibited a similar relation in the number of days to flowering in different sowing dates and years evaluated. The response to early sowing showed negative values in the two years of evaluation for all the lines and, negative association with the number of days to flowering. Flowering phenotypic variation observed among the recombinant lines demonstrated the existence of different genetic mechanisms controlling the response to photoperiod and vernalization. The molecular analysis revealed the presence of at least two allelic variations for the Vrn1 gene in the parental lines UFRGS 8 and UFRGS 930605. However, these allelic variations need to be validated as to its potential use in studies that aim the molecular mapping of the Vrn1 gene in oat.

O arroz é considerado o cereal mais tolerante ao alumínio (Al). Entretanto, a variabilidade entre os genótipos leva a uma considerável diferença quanto ao grau de tolerância para cultivares distintas. Diversos estudos mostram que plantas de arroz toleram o Al por intermédio de mecanismos internos e externos. Neste trabalho foi analisada a modulação da expressão da família gênica ASR (Aba, Stress and Ripening) em função do tratamento com Al. O gene ASR5 foi diferencialmente expresso em raízes de arroz tolerante ao Al (ssp Japonica cv Nipponbare). Entretanto, ASR5 não respondeu a exposição ao Al em raízes de arroz sensíveis ao Al (ssp Indica cv Taim). Plantas transgênicas silenciadas para os genes ASR apresentaram um aumento da sensibilidade ao Al. Calos embriogênicos de arroz transformados com a fusão ASR5-GFP revelaram que a proteína ASR5 localiza-se no núcelo e no citoplasma. Em protoplastos transformados, ASR5 localizou-se nos cloroplastos. Usando uma abordagem proteômica, comparando plantas não-transformadas e plantas ASR5_RNAi, um total de 41 proteínas com padrões contrastantes foi identificado. No intuito de identificar genes com expressão alterada pelo Al em arroz, e buscar genes afetados pelo silenciamento de ASR5, foi realizado o sequenciamento total dos transcritos utilizando plantas de arroz não transformadas e ASR5_RNAi em duas condições: controle e tratamento com Al. Essas análises transcriptômicas revelaram que 961 genes responderam ao Al em raízes de plantas de arroz não transgênicas submetidas ao Al. Nas plantas ASR5_RNAi, apenas 309 genes responderam ao tratamento com Al. Entretanto, apenas 52 desses genes se sobrepuseram quando comparados ao grupo de genes modulados em plantas não transformadas, sugerindo que a planta ASR5_RNAi perdeu a capacidade de regular um conjunto de genes. Além disso, análises de imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento em massa, revelaram que ASR5 liga-se ao promotor do gene STAR1, entre outros, regulando sua expressão em resposta ao Al. Os resultados mostram pela primeira vez que ASR5 atua como fator de transcrição em arroz e que está envolvido na regulação de genes responsivos ao Al conferindo tolerância frente à toxicidade do Al. / Among cereal crops, rice is considered the most aluminium (Al) tolerant species. However, variability among rice genotypes leads to remarkable differences in the degree of Al tolerance for distinct cultivars. A number of studies have demonstrated that rice plants achieve Al tolerance through internal and external mechanisms. We have analyzed expression changes of the rice ASR (Aba, Stress and Ripening) gene family as a function of Al treatment. The gene ASR5 was differentially regulated in the Al-tolerant rice ssp Japonica cv Nipponbare. However, ASR5 expression did not respond to Al exposure in Indica cv Taim rice roots, which are highly Al-sensitive. Transgenic plants carrying RNAi constructs that targeted the ASR genes displayed increased Al susceptibility in T1 plants. Rice embryogenic calli expressing an ASR5-GFP fusion revealed that ASR5 was localized in both the nucleus and cytoplasm. In transformed protoplasts, ASR5-GFP appears in chloroplast cells. Using a proteomic approach to compare non-transformed and ASR5_RNAi plants, a total of 41 proteins with contrasting expression patterns were identified. In order to identify genes with differential modulation under Al stress in rice, and search for genes affected by ASR5 silencing, RNA-seq was made in non-transformed plants and ASR5_RNAi plants in control conditions and after Al treatment. These analyses revealed that 961 genes responded to Al in non-transformed rice roots under Al stress. A total of 309 genes responded to Al in ASR5_RNAi plants. Only 52 genes overlapped between non transformed and ASR5_RNAi plants when comparing genes modulated by Al, showing that ASR-silenced plants lost the ability to modulate a set of genes in response to Al treatment. Furthermore, ChIP-Seq analysis revealed that ASR5 can bind to the promoter of STAR1, among other genes, regulating its expression under Al stress. These results show for the first time that ASR5 act as a transcription factor in rice and that it regulates Al-responsive genes conferring tolerance in rice against Al toxicity.

O número de genes atualmente identificados no genoma do arroz (Oryza sativa ssp japonica) é de cerca de 32.000. Graças aos esforços de diferentes grupos ao redor do globo, o papel de muitos desses genes é melhor compreendido no momento. A função de um gene pode ser inferida principalmente pela análise de seu padrão de expressão, da estrutura da proteína codificada e pela análise de mutantes nos quais o gene se encontre interrompido, silenciado ou super-expresso. Para esse propósito, nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo linhagens transgênicas pela inserção de uma construção de T-DNA baseada no sistema de transposons de dois componentes iAc/Ds. Uma dessas linhagens (Ds72) apresenta estatura reduzida e sua inserção de T-DNA interrompe um locus, cuja função gênica ainda é desconhecida. O objetivo desse trabalho é a identificação e caracterização desse gene, que denominamos de OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). Para tal, analisamos a linhagem mutante, a estrutura da proteína prevista, as possíveis relações filogenéticas com outros genes e o padrão de expressão desse gene. Em paralelo, induzimos a mobilização do elemento Ds da sua inserção original no T-DNA da linhagem original para gerar novas linhagens mutantes. A proteína codificada por esse gene contém um motivo de associação a metais pesados e um sítio de prenilação. Identificamos esse gene como um membro de um ramo até agora desconhecido da família das Proteinas Farnesiladas (FP), proteínas preniladas que se ligam a íons metálicos. Nossas análises mostram que a expressão de OsPMBP1 é semelhante em raízes e na porção aérea de plântulas, porém, em condições de excesso de alumínio, a expressão nesses órgãos se altera, sendo induzida em folhas e caules enquanto que em raízes é reprimida. Outros genes da família FP também respondem à estresses por excesso de íons metálicos, e foram caracterizados como diretamente envolvidos no transporte e/ou detoxicação de metais pesados. Em condições normais, esse gene parece ser regulado pelo relógio circadiano, sendo um gene de expressão tardia, com pico de expressão próximo ao entardecer. A análise detalhada da linhagem Ds72 indicou que não há ligação entre o fenótipo observado e a inserção de T-DNA. Os dados obtidos demonstram que OsPMBP1 pode estar envolvido na resposta a estresse por metal pesado ou no transporte desses íons, porém ainda são necessários mais estudos para melhor entender a função desse gene na planta. / The current number of identified genes in the rice genome (Oryza sativa ssp japonica) is about 32,000. Thanks to the efforts of different researchers around the world, the role of many of these genes is currently better understood. The gene function can be inferred mainly by the analysis of its expression pattern, the structure of the encoded protein and by the analysis of mutants where the gene is interrupted, silenced or over-expressed. For that purpose, our research group has developed transgenic lines by the insertion of a T-DNA construction that is based on the two-component iAc/Ds system of transposons. One of these lines shows reduced height and has the T-DNA tag interrupting a locus, whose gene function is yet unknown. The aim of the present study is the identification and characterization of this gene, which we named as OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). For that, we analyzed the mutant line, the predicted protein structure, the filogenetic relationship with others proteins, and its expression pattern. In parallel, we induced the mobilization of the Ds element from the original T-DNA insertion to generate new mutant lines. OsPMBP1coded protein has a heavy metal associated domain (HMA) and a prenylation site. We identified this gene as a member of an unknown branch of the Farnesylated Proteins family (FP), composed mostly of prenylated metal binding proteins. Ours analyses showed that the OsPMBP1 expression is equivalent in seedling roots and shoots, but, under aluminum excess, its expression change in these organs, it was inducted in the shoots and repressed in the roots. Others genes of the FP family also respond to metallic ion stresses and have been characterized as directly involved in heavy metal transport and detoxification. In normal conditions, this gene is apparently regulated by the circadian clock, with expression apices close to the evening/dusk interface. The detailed analysis of the Ds72 line indicated that there isn’t a relationship between the observed phenotype and the T-DNA insertion. The data showed that OsPMBP1 may be involved in the response to heavy metal stress or in its transport, but more analyses are required to a better understanding of the role of this gene in the plant.

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

Cannabis is widely consumed medically and recreationally due to the presence of cannabinoids, but the phytochemical complexity of different varieties and preparations is a major knowledge gap. This thesis investigated the phytochemicals present in thirteen different cannabis strains using untargeted and targeted phytochemical analysis to determine “strain” differences in cannabis tinctures and oils. In addition, the phytochemical differences between different oil products, namely oils extracted by ethanol and CO2 supercritical fluid, were also determined to evaluate different processing methods. It was found that inter-strain variability was more significant than the preparation methods due to the strain-specific presence of major cannabinoids, specifically THCA and CBDA. Furthermore, a processing step like drying removed phytochemicals contributing to strain differences, most notably terpenes. The results suggested that consumers can expect different strains and products to have different chemical profiles, as CO2 oils were found to be more chemically consistent across products than tinctures. Cannabis can be consumed in many different ways, and one popular mode of delivery is vaporization. Vaporization extracts active principles of cannabis with heated gas and could lead to a different phytochemical profile compared to the original flower counterpart. Consequently, the product label based on the raw material may not be representative of what is phytochemically available during consumption. The results of this study showed a reduction in available chemicals after vaporizing flower and oils, and little new chemical formation through this process. Decarboxylated cannabinoids were the most significant contributors to differences between pre and post-vaporized samples, and different phytochemistry composition was observed after vaporization. The results also demonstrated that vaporization reduces inter-strain and inter-product chemical diversity, but the content of the vapor can still be affected by the strain used. Furthermore, it showed that vaporization could extract phytochemicals differently from oils than flower material. This thesis provides a new understanding of phytochemical differences, extraction and vaporization processes of cannabis, and provides novel insights into cannabis for producers and consumers. Understanding the differences in chemical content of different types of concentrates can better inform producers and consumers about the products they make, sell and use. In addition, this thesis supports the use of vaporization as a harm reduction method for the consumption of cannabis, and increases understanding of cannabis vaporization. The information from this thesis contributes novel insights into cannabis research and provides a foundation for further studies.