La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare disease of unknown etiology that affects people that have a genetic predisposition to autoimmunity. Despite the latest advancement and development in the field, the mechanisms underlying disease development remain poorly understood. The lack of animal model that encompasses the cardinal features of human systemic sclerosis is a major cause of the slowdown in the understanding of this disease. In fact, some mouse models such as the bleomycin induced-SSc and TSK-1 mouse are widely used in preclinical studies of scleroderma. However, these models have several shortcomings since these mice do not display all the cardinal features of the disease found in humans. To contribute to the research of SSc, postdoctoral fellow Dre Heena Mehta has developed in Dre Sarfati’s laboratory in collaboration with Dr Senécal, an experimental murine model of SSc induced by dendritic cells loaded with topoisomerase I peptide. In order to characterise the model and establish an immune profile of our experimental mice, my analysis focused mainly on the cardinal features of scleroderma such as fibrosis, inflammation and polyclonal hyper-γ-globulinemia, vasculopathy and cytokines gene expression. Hence, immunization with dendritic cells loaded topoisomerase I peptides (TOPOIA and TOPOIB) induced pulmonary and dermal inflammation together with diffuse form of fibrosis. The mice also showed symptoms of vasculopathy and high levels of polyclonal antibodies. These results showed that TOPOIA peptides are effective in inducing fibrosis and inflammatory response while TOPOIB peptides are involved in skin fibrosis. Together with the results, the preliminary data on cytokine profile in tissue suggested that our mouse model could possibly replace/complement other current animal models of scleroderma.

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés. / Scleroderma (Systemic sclerosis, SSc) is an autoimmune disease of the connective tissue featuring skin thickening, spontaneous scarring, and blood vessel disease, varying degrees of inflammation, associated with an overactive immune system. The exact pathogenesis of this disease is unknown and there is no appropriate treatment available. Fibrosis is a hallmark of SSc disease and is considered to arise due to an inability to appropriately terminate the normal wound repair response. Histological analysis of the initial stage of SSc reveals perivascular infiltrates of mononuclear cells in the dermis, which is associated with increased collagen synthesis in the surrounding fibroblasts. Thus understanding how to control the inflammatory stage of SSc may be of benefit in controlling the progression of early onset disease. mPGES-1 is an inducible enzyme that acts downstream of cyclooxygenase (COX) to specifically catalyze the conversion of prostaglandin (PG) H2 to PGE2. mPGES-1 plays a key role in inflammation, pain and arthritis; however, the role of mPGES-1 in fibrotic mechanisms especially with respect to human SSc is unknown. My laboratory has previously shown that mPGES-1-null mice are resistant to bleomycin-induced skin fibrosis, inflammation, cutaneous thickening, collagen production and myofibroblast formation. Based on these results I hypothesized that pharmacological inhibition of mPGES-1 will downregulate the production of pro-inflammatory and pro-fibrotic mediators during SSc disease. To explore the role of mPGES-1 in inflammation and fibrosis associated with SSc disease, I first investigated the expression of mPGES-1 in normal skin compared to skin biopsies extracted from SSc patients. My results showed that mPGES-1 is markedly elevated in SSc skin compared to normal human skin. In addition, the levels of mPGES-1- derived PGE2 were also significantly higher in skin fibroblasts isolated from SSc patients compared to fibroblasts isolated from healthy controls. I further investigated the effect of pharmacological inhibition of mPGES-1 on the expression of pro-fibrotic markers. My studies showed the expression of key pro-fibrotic mediators (α-SMA, endothelin-1, collagen type 1 and connective tissue growth factor) are elevated in SSc skin fibroblasts compared to normal skin fibroblasts. Treatment with mPGES-1 inhibitor resulted in significant reduction in the expression of α-SMA, endothelin-1, collagen type 1 but not CTGF in SSc and normal fibroblasts. Further, I investigated the effect of mPGES-1 inhibition on key pro-inflammatory cytokines implicated in SSc pathology including IL-6, IL-8 and MCP-1. Pharmacological inhibition of mPGES-1 resulted in significant reduction in the production levels of pro-inflammatory cytokines, IL6, IL8 and MCP-1 in SSc-lesioned fibroblasts compared to untreated fibroblasts. In addition, SSc patients exhibited higher levels of p-AKT, p-FAK and p-SMAD3 compared to normal skin fibroblasts. mPGES-1 inhibitor was able to down regulate this increased expression of p-AKT, p-FAK but not p-SMAD3 in SSc fibroblasts. These results suggested that inhibition of mPGES-1 may be a viable method to alleviate the development of cutaneous sclerosis and is a potential therapeutic target to control fibrotic and inflammatory mechanisms associated with the pathophysiology of SSc disease. One of the other critical processes associated with the evolution of fibrotic response associated with SSc disease is the differentiation of fibroblasts into specialized activated cells called myofibroblasts responsible for triggering excessive adhesive signaling and deposition of excessive extracellular matrix (ECM) leading to the destruction of organ architecture. Thus identifying endogenous factors which initiate/promote fibroblast-myofibroblast differentiation can lead to promising therapeutic strategies to control excessive adhesive signaling and fibrosis associated with SSc disease. Previous studies in cancer biology have suggested that ephrin B2, a transmembrane protein belonging to the family of ephrins, is involved in adhesive signaling and extracellular remodeling. However its role in fibrosis has never been explored. Therefore, in second part of my study, I investigated the role of ephrin B2 in fibrosis. My studies show ephrin v vi B2 expression is significantly enhanced in human SSc skin versus normal skin. Most importantly, in vitro treatment of normal human skin fibroblasts with recombinant ephrin B2 is able to transform fibroblasts into myofibroblastic cells exhibiting all typical myofibroblastic- characteristics including increased stress fibre formation, focal adhesions, increased activation of FAK, increased expression of and enhanced fibroblast migration and adhesion to fibronectin in both normal and SSc skin fibroblasts. Further, I treated mice with recombinant ephrin B2 and showed that these mice developed significant skin fibrosis associated with enhanced dermal thickness and collagen synthesis, increased hydroxyproline content (collagen content) and increased number of α-SMA-expressing myofibroblasts, enhanced activation of FAK and pro- fibrotic markers including type-I collagen and CTGF. Overall, my studies have identified two crucial endogenous mediators involved in propagating inflammation and fibrosis associated with SSc disease. mPGES-1 inhibition may present a good alternative strategy to counteract inflammation and fibrosis at least during early stages of SSc disease. Further, excessive ephrin B2 signaling promotes adhesive and fibrotic signaling by triggering fibroblast to myofibroblast differentiation via activation of the FAK signaling pathway. Thus, inhibition of ephrin B2 will block fibroblast-myofibroblast formation and downregulate fibrosis associated with SSc disease. Overall, both mPGES-1 and ephrin B2 seems to be attractive targets for treatment of SSc and related fibrotic disorders.

La sclérose systémique (SSc) est une maladie auto-immune chronique incurable caractérisée par une présentation clinique complexe et hétérogène. Notre laboratoire a développé un modèle murin de fibrose pulmonaire et cutanée qui est induit par l’immunisation répétitive avec des cellules dendritiques chargées avec des peptides de la topoisomérase I, et qui partage de nombreuses caractéristiques avec la SSc humaine. Premièrement, nous avons caractérisé la maladie expérimentale quant à sa persistance à long terme (objectif 1) et son caractère progressif (objectif 2). Une cascade de coagulation dérégulée est impliquée dans le développement de la fibrose dans la SSc. La thrombine, un médiateur clé de la coagulation, semble contribuer à ce processus. Deuxièmement, nous avons étudié l’efficacité d’un inhibiteur de la thrombine, i.e. dabigatran, dans ce modèle (objectif 3). Le microbiote intestinal semble jouer un rôle déterminant dans plusieurs pathologies, y compris les maladies auto-immunes. Troisièmement, nous avons évalué l’effet de la manipulation du microbiote des souris par l’administration de streptomycine (objectif 4). Les souris immunisées développent une maladie persistante et la fibrose observée est précédée d’une phase inflammatoire. Le dabigatran aggrave la fibrose pulmonaire et cutanée lorsqu’administré durant la période inflammatoire et n’a aucun effet protecteur durant la phase fibrotique. La manipulation du microbiote par la streptomycine aggrave l’atteinte pulmonaire lorsque l’antibiothérapie est donnée en début de vie et exacerbe l’atteinte cutanée lorsqu’administrée à l’âge adulte. Notre modèle expérimental représente donc un outil important pour évaluer différentes approches thérapeutiques pour la SSc de par sa persistance et son caractère progressif. En se basant sur nos résultats, le dabigatran ne semble pas constituer un choix thérapeutique adéquat pour traiter la fibrose chez les patients atteints de SSc. L’exposition à la streptomycine à certaines périodes de la vie affecte différentiellement le développement et les manifestations cliniques de la maladie expérimentale. / Systemic sclerosis (SSc) is an incurable and chronic autoimmune disease characterized by a complex and heterogeneous clinical presentation. Our laboratory has developed a mouse model of lung and skin fibrosis that shares many features with human SSc, and is induced by repeated immunization with dendritic cells loaded with peptides of topoisomerase I. First, the long term persistence (objective 1) and progressive nature (objective 2) of this experimental disease model was characterized. A dysregulated coagulation cascade is implicated in the development of fibrosis in SSc. Thrombin, a key mediator of coagulation, appears to contribute to this process. Next, the efficacy of dabigatran, a thrombin inhibitor, to ameliorate lung and skin fibrosis was studied in this model (objective 3). Intestinal microbiota appears to play a key role in several diseases including autoimmune diseases. Finally, the effect of manipulating gut microbiota by administration of streptomycin on disease pathogenesis was evaluated in this model (objective 4). Immunized mice developed persistent fibrosis that was preceded by an inflammatory phase. Dabigatran aggravated pulmonary and skin fibrosis when administered during the inflammatory period and was not protective when given during the fibrotic phase. Manipulation of intestinal microbiota by streptomycin aggravated lung fibrosis when it was given early in life and exacerbated skin disease when administered in adulthood. Our model of experimental SSc with progressive and persistent disease represents an important tool to evaluate different therapeutic approaches for SSc. Furthermore, our results caution against the use of dabigatran as a therapeutic option to treat fibrosis in patients with SSc. Exposure to streptomycin for certain periods of life differentially affects the development and clinical manifestations of experimental SSc.

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La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS. / CENP-B is a highly conserved, centromere associated protein and is a major autoantigen in systemic sclerosis (SSc). Anti-CENP-B autoantibodies are associated with prominent vascular manifestations such as pulmonary arterial hypertension (PAH) in the limited cutaneous subset of SSc. PAH occurs as a consequence of progressive obliteration of small arteries due to vascular smooth muscle cell dysfunction, migration and proliferation. However, the factors driving this obliteration are unknown. Earlier in vitro studies have demonstrated that some autoantigens have an additional role when they are released in the extracellular environment during the course of injurious insults resulting in cell death. Indeed, it was previously suggested that extracellular autoantigens participate in normal wound repair processes by acting like cytokines and/or chemokines and subsequently displaying pathogenic activities that contribute to the development of autoimmune diseases. Our present findings suggest that the nuclear autoantigen CENP-B can be added to this set of bifunctional molecules. The present study clearly indicates that exogenous CENP-B bound specifically to the surface of human pulmonary artery SMCs. Binding of CENP-B to SMC stimulated their migration during in vitro wound healing assays, as well as their secretion of interleukins 6 and 8. The mechanism by which CENP-B mediated these effects involved the focal adhesion kinase, Src, ERK1/2, and p38 MAPK pathways. Moreover, CENP-B released from apoptotic endothelial cells was found to bind to SMC, thus indicating a plausible in vivo source of extracellular CENP-B. Here, we also report several lines of evidence indicating that CENP-B, which has no obvious primary or secondary structural homology to chemokines, induced SMC activation by interacting with CCR3. Moreover, the present study clearly demonstrates the involvement of EGFR in CENP-B signaling leading to IL-8 secretion. Finally, anti-CENP-B autoantibodies were found to abolish this signaling pathway, thus preventing CENP-B from transactivating EGFR and exerting its cytokine-like activities toward vascular SMCs. The present study sheds new light on the possible role of extracellular CENP-B and its potent biological effects on human pulmonary artery SMCs. The identification of CENP-B as a CCR3 ligand opens up new perspectives for the study of the pathogenic role of anti-CENP-B autoantibodies.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

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La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS. / CENP-B is a highly conserved, centromere associated protein and is a major autoantigen in systemic sclerosis (SSc). Anti-CENP-B autoantibodies are associated with prominent vascular manifestations such as pulmonary arterial hypertension (PAH) in the limited cutaneous subset of SSc. PAH occurs as a consequence of progressive obliteration of small arteries due to vascular smooth muscle cell dysfunction, migration and proliferation. However, the factors driving this obliteration are unknown. Earlier in vitro studies have demonstrated that some autoantigens have an additional role when they are released in the extracellular environment during the course of injurious insults resulting in cell death. Indeed, it was previously suggested that extracellular autoantigens participate in normal wound repair processes by acting like cytokines and/or chemokines and subsequently displaying pathogenic activities that contribute to the development of autoimmune diseases. Our present findings suggest that the nuclear autoantigen CENP-B can be added to this set of bifunctional molecules. The present study clearly indicates that exogenous CENP-B bound specifically to the surface of human pulmonary artery SMCs. Binding of CENP-B to SMC stimulated their migration during in vitro wound healing assays, as well as their secretion of interleukins 6 and 8. The mechanism by which CENP-B mediated these effects involved the focal adhesion kinase, Src, ERK1/2, and p38 MAPK pathways. Moreover, CENP-B released from apoptotic endothelial cells was found to bind to SMC, thus indicating a plausible in vivo source of extracellular CENP-B. Here, we also report several lines of evidence indicating that CENP-B, which has no obvious primary or secondary structural homology to chemokines, induced SMC activation by interacting with CCR3. Moreover, the present study clearly demonstrates the involvement of EGFR in CENP-B signaling leading to IL-8 secretion. Finally, anti-CENP-B autoantibodies were found to abolish this signaling pathway, thus preventing CENP-B from transactivating EGFR and exerting its cytokine-like activities toward vascular SMCs. The present study sheds new light on the possible role of extracellular CENP-B and its potent biological effects on human pulmonary artery SMCs. The identification of CENP-B as a CCR3 ligand opens up new perspectives for the study of the pathogenic role of anti-CENP-B autoantibodies.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.