Generalitat Valenciana (GV-3117-95); Ministerio de Sanidad (FIS 94/0014-01, FIS 96/1994-01); Unión Europea (ERBSC1-CT920833)

"R. solanacearum" is a devastating bacterial pathogen that infects "Solanaceae" spp. such as tomato, eggplant or banana. A functional T3SS is required for virulence and more than 70 putative effectors have been described, although only few have been studied. This thesis focuses on a five-member gene family of effectors named "awr". We demonstrated that awr gene family is extremely conserved among R. solanacearum strains but also present in other plant pathogens such as Acidovorax or Burkholderia spp. and even present in the human pathogen B. pseudomallei. Virulence of a Ralstonia mutant strain devoid of all awr genes was tested on tomato, eggplant and Aradidopsis. Plant growth of quintuple mutant strain was considerably reduced in natural hosts, indicating a role in virulence, but remained unchanged in Arabidopsis. Col-0 infection with Pseudomonas syringae DC3000 heterologously expressing each AWR was also performed. While presence of some AWRs in Pseudomonas did not have an effect on plant growth, others (like AWR5) dramatically reduced the pathogen multiplication, pointing out a possible plant detection. In order to unravel the functions of AWR proteins, they were transiently expressed by means of Agrobacterium in non-host Nicotiana spp. Upon AWR expression, necroses took place to different extents on the plant leaves. AWR5 induced the strongest necrosis, resembling an HR phenotype which was later confirmed by TB/DAB staining and by RT-PCR of specific HR marker genes. Furthermore, a strong reduction in yeast cells was experimented upon several AWR protein expressions which indicate that the mechanisms that might be altered by these effector proteins is conserved among eukaryotes and hence reinforces their role in virulence. AWR4 appeared not to be toxic in this model organism and for that reason we sought to decipher some of the plant targets of this AWR protein as a start point. Out of more than 60 interacting clones were sequenced after a yeast-two hybrid screening with Arabidopsis root cDNA from R. solanacearum challenged plants. Among them, several defense-related proteins were found: phenylalanine ammonia-lyase, MPK6, DMR6 or KIN10. In order to find other key genes for AWR activity, the AWRs that displayed a strong yeast toxicity were heterologously produced in both E. coli and R. solanacearum to be ready to be employed as a bait for plant protein complexes that will be analysed by mass spectrometry. In summary, AWR are highly conserved effectors that play an important role in both pathogenesis and plant recognition as they reduce P. syringae virulence and trigger an HR-like phenotype in non-host plants. Deciphering effector function will open promising avenues towards the design of new strategies to control R. solanacearum. / R. solanacearum és un patogen bacterià capaç d’infectar diferents solanàcies com ara la tomaquera, la patatera, l’alberginiera o el plataner. Aquest fitopatogen injecta més de 70 proteïnes efectores en la cèl•lula vegetal hoste, tot i que només algunes han sigut ja estudiades. Aquesta tesi es centra en una família multigènica d’efectors: els AWRs. Els estudis científics duts a terme durant aquesta tesi van demostrar que la família de AWR no només estava altament conservada en el llinatge de R. solanacearum sinó que també es trobava present en altres fitopatògens o inclús en el patogen humà Burkholderia pseudomallei. A més a més, diferents assajos de patogenicitat en tomaquera i alberginiera van provar que els gens awr presentaven un paper clar en virulència per aquests hostes. Contràriament, la presència d’aquestes proteïnes en la planta model Arabidopsis thaliana produïen una disminució en la capacitat infectiva/multiplicativa. Això indicaria una dualitat dels efectors AWR depenent del context que ens trobem, ja sigui contribuint a la patogenicitat del bacteri o bé éssent reconeguts per la planta i així disminuint la patogenicitat bacteriana. Per tal de desentranyar les funcions de les proteïnes AWR, es van expressar de forma transitòria a la planta model no-hoste Nicotiana spp. L’expressió d’algunes proteïnes AWR va provocar una forta necrosi de les fulles que s’assemblaria a una resposta hipersensible. Mitjançant diferents tincions i assajos de PCR en temps real es va corroborar que l’AWR5 presentava aquest tipus de mort cel•lular programada. L’elevada toxicitat d’algunes AWRs es va demostrar també en llevat. En el transcurs d’aquesta tesi també s’ha realitzat un crivellatge en doble híbrid per tal de buscar proteïnes dianes de la planta per a l’AWR4 (la menys tòxica). A més a més, es va posar a punt l’expressió dels AWRs a E. coli o bé a R. solanacearum per tal d’abordar altres tècniques que permetin una millor cerca d’interactors en el futur.

[EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays. / [ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens / [CAT] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues / Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634 / TESIS