Der renale Ischämie-/Reperfusionsschaden (IRI) stellt in der Transplantationsmedizin ein grosses Problem dar. Fucoidin, ein potenter Antagonist der Selektin-vermittelten Leukozytenaggregation, verbesserte an der Rattenleber (in einer Konzentration von 360mg/l) das Ausmass der leukozytären Gewebeinfiltration in der frühen Phase nach Ischämie und Reperfusion. In einem Modell der isoliert hämoperfundierten Schweineniere sollte die Wirkung von Fucoidin auf die postischämische Organfunktion untersucht werden. Hierzu wurden 24 Versuche durchgeführt. Dem Blut der Versuchsgruppen wurde vor Beginn der Reperfusion Fucoidin in einer Konzentration von 100 mg/l zugesetzt. Es zeigte sich unter Fucoidin ein signifikanter Abfall des renalen Blutflusses (55 ( 28 vs. 143 ( 97 ml*min-1*100g-1, p / Renal postischemic reperfusion injury constitutes a significant problem after kidney transplantation. The polysaccharide fucoidin (360 mg/l) improves postischemic function in Ratliver, presumably by blocking selectin-mediated leukocyte adhesion. Twelve pairs of ischemic pig kidneys were reperfused in an ex vivo model with autologous blood with or without fucoidin (100 mg/L). Fucoidin resulted in a significant decrease of renal blood flow (55 ( 28 vs. 143 ( 97 mL*min-1*100g-1, p < 0.001) and increased vascular resistance (2.9 ( 2.8 vs. 1.1 ( 1.5 mmHg*mL-1*min-1*100g-1, p < 0.001). Compared to untreated control kidneys significantly more interstitial and intravascular leucocytes were found in fucoidin treated kidneys. Intraglomerular fibrinogen and thrombocytic aggregates were also increased significantly. Granulocytic emboli were present in afferent glomerular arteries of 10/12 fucoidin-treated kidneys and in 2/12 controls (p < 0.001). L-selectin-dependent granulocytic aggregation under shear stress in vitro was prevented by fucoidin in a dose-dependent fashion. However similar concentrations used in reperfused kidneys caused large granulocytic aggregates. The observed formation of embolizing granulocytic aggregates indicates limited effectiveness of fucoidin as an inhibitor of selectin-mediated leukocyte adhesion.

Cell adhesion plays an important role in inflammation and immunological responses. Adhesion molecules (e.g., selectins and integrins) are key modulators in mediating these cellular responses, such as leukocyte trafficking under shear stress. In this thesis, we use a bio-membrane force probe (BFP) to study force regulation on kinetics and conformations of selectin and LFA-1 integrin. A new BFP was built up, and a new assay, using thermal fluctuation of the BFP, was developed and used to monitoring selectins and their ligands association and dissociations. The new BFP was also used to investigate the force and force history dependence of selectin-ligand interactions. We found tri-phasic transition of force-dependent off-rates and force-history dependence of selectin/ligaind interactions. The BFP was also used to characterize force-dependent lifetimes of the LFA-1-ICAM-1 interaction. We found that LFA-1/ICAM-1 bonds behaved as catch bond and that LFA-1-ICAM-1's catch bonds were abolished blocking the downward movement of αA domain α7 helix. Finally, the BFP was applied to dynamically probe the global conformational changes of LFA-1 and to characterize force-regulated transitions among different conformational states on a living cell. We observed dynamic transitions of LFA-1 between extended and bent conformations on living cells. The observed average distance change of LFA-1's extensions was about 18nm, while that of the bending was only about 14nm. We also found that forces could facilitate extension but they slow down the bending of LFA-1. The observed transition time of extension was less than 0.1s, while that of contraction was longer than 0.2s. Our observations here are the first in-situ evidence to demonstrate how integrins dynamically transit different conformations and how force regulates these transitions.

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L’accumulation excessive de leucocytes conduisant à un dysfonctionnement de la réponse immunitaire est caractéristique de plusieurs maladies inflammatoires. La première étape du recrutement des leucocytes aux sites d’inflammation est tributaire de l’interaction entre le tétrasaccharide sialyl LewisX (sLeX) et les protéines d’adhésion sélectines P et E, qui sont exprimés sur les cellules endothéliales des parois vasculaires. Par conséquent, les sélectines sont des cibles thérapeutiques importantes. Ainsi, la conception d’antagonistes des sélectines est une stratégie prometteuse pour traiter l'inflammation aiguë. Par exemple, l’administration d’analogues du sLeX chez les patients hospitalisés souffrant de crises vaso-occlusives ou de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) peut atténuer les enjeux d'accumulation de cellules immunitaires. Tout en se basant sur la première génération d'antagonistes des sélectines développées par notre laboratoire, l’objectif de ce travail était de synthétiser et d'évaluer l’activité biologique d’une nouvelle série d’analogues du sLeX ciblant l'inflammation aiguë. Ce travail établit deux nouvelles stratégies qui permettent d'accéder à des analogues du sLeX incorporant un motif galactopyranoside bicyclique avec une fonctionnalité carboxylate ayant une conformation restreinte. Dans la première approche, l’intermédiaire bicyclique clé est formé en 13 étapes à partir du D-galactose pentaacétate avec un rendement global de 19 %. Indépendamment de la stéréochimie des précurseurs, une réaction de cyclisation intramoléculaire a permis de générer l’intermédiaire clé avec le carboxylate en position axiale. Un contrôle cinétique Curtin-Hammett serait à l'origine de la stéréosélectivité, une hypothèse supportée par une étude expérimentale et par calculs théoriques DFT. La série des carboxylates équatoriales a également été préparée par une stratégie de désilylation basée sur la migration d'un ester β,γ-insaturé. La deuxième approche implique une stratégie de double glycosidation orthogonale qui est influencée par la conformation restreinte du bicycle. L'intermédiaire bicyclique, portant un groupement nitrile en C9 (alpha), a été préparé en 12 étapes avec un rendement global de 53 %. Cette approche a mené à une série d'antagonistes des sélectines incorporant des modifications d'amide, d'amine et de tétrazole, ainsi qu'un analogue incorporant un C6-benzamide. Cette approche modulaire peut être exploitée pour préparer d’autres isostères d'acide carboxylique. Un analogue hybride a été préparé en combinant le galactopyranoside bicyclique avec la fonctionnalisation de la chaîne latérale qui se retrouve sur l’espaceur à base de tartrate. Cette voie de synthèse a également été conçue afin d'accéder aux analogues du sLeX portant une sonde de photoaffinité. Cet analogue servira comme outil dans le marquage par photoaffinité des sélectines pour élucider les résidus clés du site actif. Les analogues de la deuxième génération ont été évalués pour leur capacité à se lier aux sélectines et d’empêcher les cellules immunitaires d’adhérer. Une méthode qualitative permettant de classer l’affinité de nos composés aux sélectines à l'aide de la spectroscopie SPR ainsi qu'une expérience préliminaire d'inhibition compétitive en solution ont été développées. Les principaux composés ont également été évalués à l'aide de tests in vitro d'adhésion de cellules HL-60 et de roulement par imagerie des cellules vivantes. Un essai de migration cellulaire par lavage péritonéal in vivo a été utilisé pour valider l’activité de nos composés principaux et leur capacité à inhiber le recrutement des neutrophiles dans un modèle d'inflammation aiguë. Nos résultats démontrent l’augmentation de la puissance et de l’activité de nos analogues de deuxième génération comparativement à la première. La série de galactopyranosides a démontré une spécificité pour l'inhibition de la P-sélectine, alors que la série des arabinopyranosides, incorporant un motif tétrazole, a démontré une activité remarquable vers la E-sélectine. La combinaison des deux modifications ont produit une activité pan-sélectines exceptionnelle qui justifie une enquête plus approfondie. / The first step for leukocyte adhesion and rolling along the vascular endothelium during the immune system inflammatory response involves the recognition of the tetrasaccharide sialyl LewisX (sLeX) by selectin glycoproteins. Dysfunction of the immune response, a consequence of several pathologies of inflammatory disease, leads to an excessive influx of leukocytes that necessitates therapeutic intervention. The development of glycomimetics, small molecule therapeutics that imitate complex glycans, is a promising strategy for treating inflammation. Specifically, a targeted approach amenable to severe acute inflammation, such as in hospitalized patients suffering from vaso-occlusive crises (VOC) or acute respiratory distress syndrome (ARDS). Building off the first generation of selectin antagonists developed by our laboratory, the aim of this work was to synthesize and evaluate the potency of a new class of sLeX glycomimetics for use as selectin antagonists targeting acute inflammation. This work describes the development of two novel strategies for sLeX glycomimetics incorporating a challenging trans-bicyclo[4.4.0] 3-O,4-C-fused galactopyranoside scaffold with a conformationally restricted carboxylate moiety. In the first approach, the key bicyclic galactopyranoside intermediate was accessed through a 13-step sequence with 19% overall yield from D-galactose pentaacetate. An unprecedented intramolecular cyclization reaction provided the desired axially configured bicyclic intermediate independent of the precursor stereochemistry. The origin of stereoselectivity was proposed to be under Curtin-Hammett kinetic control; a hypothesis supported by an experimental study and theoretical DFT calculations. The equatorial carboxylate series was also prepared using a desilylation strategy capitalizing on the migration of an β,γ-unsaturated ester. The second approach is highlighted by an orthogonal dual-glycosidation strategy that takes advantage of the conformationally restricted scaffold. The key bicyclic intermediate, bearing an α-configured C9 nitrile moiety, was prepared in 12 steps with a 53% overall yield. This approach led to a series of selectin antagonists incorporating axially-locked amide, amine, and tetrazole modifications at the C9 position, as well as an analogue incorporating a C6-benzamide. The modular galactopyranoside framework achieved using this approach can be exploited to prepare additional carboxylic acid bioisosteres for future SAR studies. A hybrid analogue was prepared, that combines the bicyclic galactopyranoside scaffold and a synthetic approach to selectin antagonists incorporating sidechain modifications to the first-generation tartrate diester. This synthetic route was also elaborated to access sLeX glycomimetics bearing a benzophenone-based photoaffinity probe. This analogue will serve as a valuable tool in the photoaffinity labeling of selectin proteins to elucidate key active site residues. The second-generation analogues were evaluated for their ability to inhibit selectin adhesion. A qualitative method to rank the binding strength towards recombinant P- and E-selectin proteins using SPR biosensor technology was developed, as well as a preliminary competitive inhibition in solution experiment with immobilized PSGL-1. Several compounds were also evaluated using an in vitro HL-60 cell adhesion assay, and a live-cell imaging experiment. An in vivo peritoneal lavage cellular migration assay was used to validate the potency of our lead compounds at inhibiting neutrophil recruitment in an acute inflammation model. Key results from the biological evaluations include an improvement in activity by restricting the conformation of the carboxylate moiety to the axial configuration, as well as an enhancement in potency over the lead compound from the first-generation series. Remarkably, specificity for P-selectin inhibition was observed with the galactopyranoside series, while the arabinopyranoside series, incorporating a tetrazole bioisostere, displayed significant activity towards E-selectin. The combination of the two modifications yielded remarkable pan-selectin activity that warrants further investigation.