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Produção e caracterização de células multipotentes e pluripotentes induzidas em Blastocerus dichotomus / Production and characterization of multipotent and induced pluripotent cells in Blastocerus dichotomus

Rola, Luciana Diniz [UNESP] 03 February 2017 (has links)
Submitted by LUCIANA DINIZ ROLA Rola (lanakauz@gmail.com) on 2017-02-20T21:28:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_Rola, L.D..pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida (“induced pluripotent stem cells” - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, condrócitos e osteócitos) para avaliar sua plasticidade in vitro. Ainda, foi caracterizada a expressão de marcadores moleculares por meio da imunocitoquímica (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) e RT-qPCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). A segunda meta teve como enfoque a derivação de células iPSC a partir das linhagens tronco multipotentes obtidas anteriormente. A derivação das linhagens iPSC foi testada pelo uso de integração gênica que exprimem quatro fatores de transcrição (c-Myc, Klf4, Oct4 e Sox2) pelos métodos de nucleofecção, lipofecção ou lentiviral. As colônias do tipo iPSC foram obtidas somente pelo método de nucleofecção e foram repicadas isoladamente. Porém, falharam em estabelecer linhagens clonais para posterior caracterização. A terceira meta deste trabalho visou estabelecer linhagens de células semelhantes as germinativas primordiais (“Primordial germ cell-like” PGCLs). Devido a falha em reprogramar as células-tronco adultas em iPSC, foram estabelecidas as linhagens de PGCLs por diferenciação de células de chifre, gordura e pele, passando pela fase de células semelhantes as epiblásticas (“epiblast-like cells” EpiLCs) e posteriormente sendo diferenciadas nas PGCLs. Após diferenciação, as PGCLs foram submetidas a testes de imunocitoquímica (DDX4 e DAZL) e RT-qPCR (DDX4, Stra8, Stella, Fragilis, OCT4). Ainda, foi testada a influência do ácido retinoico e do BMP4, bem como os sistemas de cultivo em adesão e em suspensão para a diferenciação das células multipotentes em PGCLs. / FAPESP: 13/13972-0
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Estudo de marcadores genéticos associados a inflamação em pacientes com anemia falciforme

Souza, Cyntia Cajado de January 2013 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T14:30:43Z No. of bitstreams: 1 Cyntia Cajado de Souza.pdf: 4771962 bytes, checksum: bdc7d5b7181b8a72749dc6d7de91f2f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T14:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cyntia Cajado de Souza.pdf: 4771962 bytes, checksum: bdc7d5b7181b8a72749dc6d7de91f2f3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A anemia falciforme (HbSS) é uma doença genética com prevalência mundial elevada, caracterizada pela heterogeneidade clinica apresentando manifestações agudas e crônicas de caráter multifatorial, sendo caracterizada pela presença do estado inflamatório sistêmico. As alterações no sistema imune têm sido relacionadas a predisposição a infecções em pacientes HbSS, com produção exacerbada de anticorpos, alterações na função de leucócitos e na imunidade celular, entre outros. Estão inclusos nesta tese o conjunto de três manuscritos com o objetivo de investigar marcadores genéticos relacionados a inflamação em pacientes com HbSS, com ênfase para os polimorfismo e níveis séricos das citocinas TNFα -308G>A e IL-8 251A>T, para a provável influência dos polimorfismos gênicos TNFα-308G>A, FcRIIAH/R131, MPO-463G>A, TLR4 896A>G, e TLR9- 1237T>C na gravidade de infecções e complicações inflamatórias na HbSS, e ainda a expressão gênica dos receptores TLR2, TLR4, TLR5 e TLR9 em células dendríticas de pacientes HbSS. Nossos resultados mostraram que os níveis séricos elevados das citocinas TNFα e IL-8, bem como a presença do alelo mutante dos polimorfismos de TNFα e da IL-8 estudados estão associados com a gravidade clínica da doença. O estudo dos polimorfismos TLR9 -1237T>C e TLR4 896A>G mostraram associação com a ocorrência de infecção respiratória e acidente vascular encefálico (AVE), respectivamente, e o polimorfismo MPO-463G>A esteve associado com a ocorrência de infecções. Além disso, a presença concomitante do polimorfismo FcRIIA H/R131 com o MPO-463G>A, com o TLR4 896A>G, ou com o TNF-α influenciou a ocorrência de internações hospitalares, de sequestro esplênico, de AVE e do número de crises vaso-oclusivas. O estudo de novos marcadores de inflamação na anemia falciforme pode ajudar no entendimento da complexidade da fisiopatologia desta doença. Nossos dados enfatizam a identificação de novos biomarcadores genéticos e sua associação marcadores clássicos podem ser uma ferramenta importante para elucidar a diversidade fenotípica da HbSS. / Sickle cell anemia (HbSS) is a genetic disease with elevated worldwide distribution characterized by clinical heterogeneity and acute and chronic complication presenting systemic inflammatory state. The immune system changes are related to infection predisposition in HbSS, exacerbated antibody production, changes in leucocytes function and innate immunity. It was included in this thesis a set of three manuscripts that aim to investigate genetic markers related to inflammation in HbSS emphasizing polymorphisms and cytokine serum levels of TNFα -308G>A and IL-8 251A>T, to the influence of genetic polymorphisms of TNFα-308G>A, FcRIIAH/R131, MPO-463G>A, TLR4 896A>G and TLR9- 1237T>C in infection and inflammatory complication in HbSS and the gene expression of dendritic cell TLR2, TLR4, TLR5 and TLR9 receptors. Our results shows high serum levels and the presence of TNFα and IL-8 mutant allele were related to disease clinical severity. The study of TLR9 -1237T>C and TLR4 896A>G polymorphisms were associated to respiratory infection and encephalic vascular accident (EVA), respectively, and the polymorphism MPO-463G>A was associated to infection. The double presence of polymorphism FcRIIA H/R131 with MPO-463G>A or with TLR4 896A>G or with TNF-α influence the presence of hospitalization, spleen sequestration, EVA and vasooclusive crisis. The new sickle cell anemia inflammation markers study may help to highlight the disease physiopathology complexity. Our finds emphasizes new genetic and immunological biomarkers identification and its association with classical markers may be important to elucidate phenotypic HbSS diversity.
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Caracterização dos mecanismos de ação de duas classes de proteínas indutoras de necrose (CPs e NLPs), presentes em fungos do gênero Moniliophthora, patogênicos do cacau / Characterization of the mechanisms of action of two classes of necrosis-inducing proteins (CPs and NLPs) present in Moniliophthora genus of fungi, pathogenic to cocoa

Zaparoli, Gustavo Henrique Alcalá, 1983- 08 January 2012 (has links)
Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Odalys Garcia Cabrera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:21:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaparoli_GustavoHenriqueAlcala_D.pdf: 22559337 bytes, checksum: f8c948505b53f1b1be80dd4146ce6a2b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Moniliophthora perniciosa e Moniliophthora roreri são dois fungos basidiomicetos hemibiotróficos que causam as doenças Vassoura-de-Bruxa e Monilíase, respectivamente, em cacaueiros da América Central e do Sul. M. perniciosa ataca meristemas de ramos e frutos em desenvolvimento enquanto M. roreri é capaz de infectar unicamente os frutos, sendo ambas as doenças devastadoras nas plantações afetadas. Nos genomas de M. perniciosa e M. roreri foram encontrados genes que codificam pequenas proteínas secretadas, descritas como efetores, com potencial importância nas interações patógenos- planta, entre eles estão membros das famílias de proteínas NEP-1 like proteins (NLPs) e Ceratoplataninas (CP). As NLPs causam necrose após contato com as células planta e em M. perniciosa identificamos uma cópia (MpNEP2) expressa simultaneamente com os sintomas de necrose da doença. MpNEP2 teve sua estrutura resolvida por cristalografia e apresenta semelhanças com citotoxinas. Identificamos aminoácidos essenciais à atividade de necrose de MpNEP2, e analisamos sua possível dependência de íons. As CPs são proteínas descritas como elicitores de resposta de defesa em plantas, e nas espécies de Moniliophthora parecem ter uma função relacionada à proteção estrutural durante a doença. Análises de expressão mostraram grande diferença entre as cópias identificadas em M. perniciosa. Através da obtenção e análises das estruturas cristalográficas de quatro cópias de MpCPs sugerimos possíveis funções a essa família durante ambas as doenças. O objetivo principal deste estudo foi a compreensão dos mecanismos de ação destas duas classes de elicitores e sua relação no desenvolvimento de cada uma das doenças / Abstract: Moniliophthora perniciosa and Moniliophthora roreri are two hemibiotrophic fungi that cause Witches' Broom and Frosty Pod Rod Diseases, respectively, in cocoa trees of Central and South America. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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Classificação automatizada do relevo a partir de parâmetros morfométricos / Automated classification of landform patterns based on morphometric parameters

Tinós, Thaís Minatel [UNESP] 31 March 2016 (has links)
Submitted by THAÍS MINATEL TINÓS null (thaistinos@gmail.com) on 2016-05-24T20:11:44Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Final - Thaís M. Tinós.pdf: 20587275 bytes, checksum: 02a7f25385f749a23fc7a27864bda7a5 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-25T19:56:11Z (GMT) / Submitted by THAÍS MINATEL TINÓS null (thaistinos@gmail.com) on 2016-05-26T00:22:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado - Thaís M. Tinós.pdf: 20648358 bytes, checksum: 60c3ed48a4ac076d5e5673de366b68c6 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 6 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 6 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-30T19:22:18Z (GMT) / Submitted by THAÍS MINATEL TINÓS null (thaistinos@gmail.com) on 2016-05-30T20:27:22Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado - Thaís M. Tinós.pdf: 20648358 bytes, checksum: 60c3ed48a4ac076d5e5673de366b68c6 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-01T13:36:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tinos_tm_dr_rcla.pdf: 20648358 bytes, checksum: 60c3ed48a4ac076d5e5673de366b68c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T13:36:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tinos_tm_dr_rcla.pdf: 20648358 bytes, checksum: 60c3ed48a4ac076d5e5673de366b68c6 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Representar cartograficamente o relevo de maneira sistemática não é uma tarefa simples devido à complexidade das informações que devem ser necessariamente relatadas. O uso de processos interpretativos e subjetivos dificulta ainda mais a comparação e aplicação das metodologias por diferentes pesquisadores. Uma das formas de mudar esse quadro é substituir alguns desses processos por uma sequência de procedimentos quantitativos relativos à geomorfometria do terreno. Nesse contexto, o principal objetivo da pesquisa é propor um método de classificação automatizada do relevo a partir de um modelo digital de elevação, parâmetros e ferramentas que possibilitem uma abordagem quantitativa. Foram elaborados três experimentos que abrangem desde o desenvolvimento de produtos intermediários, obtidos através de técnicas de visualização de modelos digitais de elevação que auxiliam no reconhecimento prévio da área estudada até a proposição de uma metodologia de classificação de padrões de formas semelhantes do relevo a partir dos parâmetros de declividade, amplitude e perfil do relevo. O planalto de Poços de Caldas e a bacia do rio Corumbataí foram selecionados como áreas de estudo devido a seus relevos contrastantes, além da disponibilidade de dados e conhecimento prévio dos autores, item primordial para a realização de uma classificação automatizada do relevo. Os resultados finais englobaram mapas de classificação do relevo que retratam as unidades com padrões de formas semelhantes em escalas compatíveis a 1:100.000 (SRTM de 90 metros de resolução) e 1:50.000 (SRTM de 30 metros de resolução). Esses mapas fornecem uma visão geral da geomorfologia da área, podendo servir de base para diversos outros mapeamentos como geotécnico, geoógico, pedológico, zoneamento geoambiental e geomorfológico de detalhe. / The cartographic representation of the relief is not a simple task due to the complexity of information to be reported. Subjective and interpretative processes involved make it difficult to compare and to apply methodologies carried by different researchers. This scenario can be altered if a sequence of quantitative procedures related to terrain geomorphometry is applied. In this context, the main objective of this research is to propose a method for automated classification of relief from a digital elevation model, parameters and tools that enable a quantitative approach. Three experiments were elaborated. The first one aimed the development of intermediate products obtained from digital elevation models visualization techniques that assist in prior recognition of the studied area and the last two comprise the development of a landform patterns classification methodology from the parameters flatness, local relief and profile. The Poços de Caldas Plateau and the Corumbataí river basin were selected as study areas due to their contrasting reliefs, besides the availability of data and prior knowledge of the authors, primary item to perform an automated relief classification. The results include relief classification maps that depict landform patterns units in compatible scales with 1:100.000 (SRTM 90 meters resolution) and 1:50.000 (SRTM 30 meters resolution). These maps provide an overview of geomorphology and it can provide the basis for several other mappings as geotechnical, geological, geoenvironmental zoning and detailed geomorphological maps. / CNPq: 165931/2013-2
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Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G / Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G

Rocha, Margleice Marinho Vieira 01 July 2016 (has links)
INTRODUÇÃO: A forma clássica de encefalomiopatia mitocondrial associada à mutação do DNA mitocondrial m.3243A>G é a Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (síndrome de MELAS). Entretanto, o espectro de manifestações clínicas dos indivíduos que apresentam essa mutação é bastante amplo. OBJETIVO: Descrever o espectro clínico, laboratorial e de imagem de pacientes com doença mitocondrial decorrente da mutação m.3243A>G. MÉTODOS: Estudo descritivo retrospectivo de uma série de casos de pacientes com a mutação m.3243A>G em seguimento no ANEM/HCFMRP-USP. Os dados clínicos e informações sobre exames complementares foram coletados através de revisão sistemática dos prontuários médicos dos pacientes selecionados. Os exames de neuroimagem foram revisados juntamente com neurorradiologista experiente para descrição das lesões encontradas. RESULTADOS: No período compreendido entre maio de 2000 e maio de 2015, a mutação m.3243A>G foi pesquisada em um total de 817 pacientes, em DNA extraído de células do sangue periférico (n= 441), de fragmentos de biópsia de músculo esquelético (n= 293), de ambos (n= 82) e mais raramente de células do sedimento urinário (n=1). Dentre esses, 16 indivíduos de 12 famílias apresentaram a referida mutação, resultando em uma taxa de detecção da mutação de 1,96% nessa população. Foram incluídos no estudo 12 indivíduos de 9 famílias que estavam em seguimento no nosso serviço. Os achados mais comuns nesta série foram em ordem de frequência: sinais de miopatia, transtornos neurocomportamentais, epilepsia, endocrinopatias, ataxia cerebelar, migrânea, episódios semelhantes a AVC, vômitos recorrentes, distúrbios de condução cardíaca, neuropatia periférica e sinais de disautonomia, mioclonias, surdez neurossensorial, cegueira cortical, comprometimento ocular, e proteinúria. Em nossa série, identificamos que cinco pacientes foram classificados com a forma clássica de MELAS, dois apresentaram CPEO associada a outros sintomas como transtornos psiquiátricos e diabetes mellitus. Os demais pacientes apresentavam características clínicas que não configuravam uma síndrome clinica definida. Além das lesões semelhantes a AVC, as lesões reveladas por neuroimagem mais frequentes nessa população foram alteração de sinal dos núcleos da base, atrofia encefálica e alteração de sinal da substância branca, sendo igualmente prevalentes entre os pacientes com a síndrome clássica de MELAS e os pacientes que não apresentaram lesões semelhantes a AVC. Dos pacientes com MELAS, 100% apresentaram pico anômalo de lactado e 60% redução do NAA à espectroscopia de prótons; enquanto que entre os pacientes sem lesões semelhantes a AVC essas alterações foram encontradas em dois e em um paciente Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G 8 respectivamente. Nós identificamos o achado inédito de azoospermia associada à mutação m.3243A>G. Essa é a maior série de casos de pacientes brasileiros com a mutação m.3243A>G até o momento. CONCLUSÃO: O amplo espectro de apresentação clínica e de neuroimagem é uma característica notável entre os pacientes com a mutação m.3243A>G do DNAmt. Essa desordem deve ser considerada em pacientes com evidência de sinais e sintomas que sugiram acometimento multissistêmico. / INTRODUCTION: The classic form of mitochondrial encephalomyopathy associated with m.3243A>G mutation is the Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS syndrome). However, the spectrum of clinical manifestations of patients with this mutation is quite wide. OBJECTIVE: To describe the clinical, laboratory and imaging spectrum of patients with mitochondrial disease due to m.3243A>G mutation METHODS: A retrospective descriptive study of a series of cases of patients with the m.3243A>G mutation in follow-up in ANEM/HCFMRP-USP. Clinical data and information about additional tests were collected through systematic review of medical records of selected patients. Neuroimaging studies were reviewed with supervision of experienced neuroradiologist and the lesions were described. RESULTS: Between May 2000 and May 2015, the mutation m.3243A>G was evaluated in a total of 817 patients, on DNA extracted from peripheral blood (n = 441), skeletal muscle biopsy samples (n = 293), both (n = 82) and more rarely urinary sediment cells (n = 1). We founded 16 individuals 12 families with the mutation, resulting in a mutation detection rate of 1.96 % that population. 12 individuals from nine families, who were following at our service, were included in this study. The most common findings in this series were in order of frequency: myopathy signs, neurobehavioral disorders, epilepsy, endocrine disorders, cerebellar ataxia, migraine, stroke-like episodes, recurrent vomiting, cardiac conduction disorders, peripheral neuropathy and signs of dysautonomia, myoclonus, sensorineural deafness, cortical blindness, uveitis, and proteinuria. In our series, we found that five of the patients were classified with the classical MELAS syndrome, two patients had CPEO associated with other symptoms such as psychiatric disorders and diabetes mellitus. The remaining patients had other features of mitochondrial disease not consistent with another recognised syndrome. In addition to stroke-like lesions, the more frequent lesions revealed in neuroimaging studies were deep gray matter changes, brain atrophy and white matter changes. These changes had similar prevalences between the patients with the classic syndrome of MELAS and patients who did not have stroke-like lesions. All patients with classical MELAS have lactate peak and 60% of them have reduction of NAA at spectroscpopy; while these changes were found in two and one patient respectively, in the group of patients without stroke-like lesions. We identified azoospermia in one paciente with classic MELAS, a finding not previously associated with m.3243A>G. At moment, this is the largest Brazilian case series of patients with the m.3243A>G mutation. Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G 10 CONCLUSION: The wide spectrum of clinical presentation and neuroimaging is a notable feature among patients with the mutation m.3243A> G mtDNA. This disorder should be considered in patients with evidence of signs and symptoms suggestive of multisystem involvement.
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Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G / Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G

Margleice Marinho Vieira Rocha 01 July 2016 (has links)
INTRODUÇÃO: A forma clássica de encefalomiopatia mitocondrial associada à mutação do DNA mitocondrial m.3243A>G é a Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (síndrome de MELAS). Entretanto, o espectro de manifestações clínicas dos indivíduos que apresentam essa mutação é bastante amplo. OBJETIVO: Descrever o espectro clínico, laboratorial e de imagem de pacientes com doença mitocondrial decorrente da mutação m.3243A>G. MÉTODOS: Estudo descritivo retrospectivo de uma série de casos de pacientes com a mutação m.3243A>G em seguimento no ANEM/HCFMRP-USP. Os dados clínicos e informações sobre exames complementares foram coletados através de revisão sistemática dos prontuários médicos dos pacientes selecionados. Os exames de neuroimagem foram revisados juntamente com neurorradiologista experiente para descrição das lesões encontradas. RESULTADOS: No período compreendido entre maio de 2000 e maio de 2015, a mutação m.3243A>G foi pesquisada em um total de 817 pacientes, em DNA extraído de células do sangue periférico (n= 441), de fragmentos de biópsia de músculo esquelético (n= 293), de ambos (n= 82) e mais raramente de células do sedimento urinário (n=1). Dentre esses, 16 indivíduos de 12 famílias apresentaram a referida mutação, resultando em uma taxa de detecção da mutação de 1,96% nessa população. Foram incluídos no estudo 12 indivíduos de 9 famílias que estavam em seguimento no nosso serviço. Os achados mais comuns nesta série foram em ordem de frequência: sinais de miopatia, transtornos neurocomportamentais, epilepsia, endocrinopatias, ataxia cerebelar, migrânea, episódios semelhantes a AVC, vômitos recorrentes, distúrbios de condução cardíaca, neuropatia periférica e sinais de disautonomia, mioclonias, surdez neurossensorial, cegueira cortical, comprometimento ocular, e proteinúria. Em nossa série, identificamos que cinco pacientes foram classificados com a forma clássica de MELAS, dois apresentaram CPEO associada a outros sintomas como transtornos psiquiátricos e diabetes mellitus. Os demais pacientes apresentavam características clínicas que não configuravam uma síndrome clinica definida. Além das lesões semelhantes a AVC, as lesões reveladas por neuroimagem mais frequentes nessa população foram alteração de sinal dos núcleos da base, atrofia encefálica e alteração de sinal da substância branca, sendo igualmente prevalentes entre os pacientes com a síndrome clássica de MELAS e os pacientes que não apresentaram lesões semelhantes a AVC. Dos pacientes com MELAS, 100% apresentaram pico anômalo de lactado e 60% redução do NAA à espectroscopia de prótons; enquanto que entre os pacientes sem lesões semelhantes a AVC essas alterações foram encontradas em dois e em um paciente Caracterização clínica, laboratorial e de neuroimagem de pacientes com doença mitocondrial associada à mutação m.3243A>G 8 respectivamente. Nós identificamos o achado inédito de azoospermia associada à mutação m.3243A>G. Essa é a maior série de casos de pacientes brasileiros com a mutação m.3243A>G até o momento. CONCLUSÃO: O amplo espectro de apresentação clínica e de neuroimagem é uma característica notável entre os pacientes com a mutação m.3243A>G do DNAmt. Essa desordem deve ser considerada em pacientes com evidência de sinais e sintomas que sugiram acometimento multissistêmico. / INTRODUCTION: The classic form of mitochondrial encephalomyopathy associated with m.3243A>G mutation is the Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS syndrome). However, the spectrum of clinical manifestations of patients with this mutation is quite wide. OBJECTIVE: To describe the clinical, laboratory and imaging spectrum of patients with mitochondrial disease due to m.3243A>G mutation METHODS: A retrospective descriptive study of a series of cases of patients with the m.3243A>G mutation in follow-up in ANEM/HCFMRP-USP. Clinical data and information about additional tests were collected through systematic review of medical records of selected patients. Neuroimaging studies were reviewed with supervision of experienced neuroradiologist and the lesions were described. RESULTS: Between May 2000 and May 2015, the mutation m.3243A>G was evaluated in a total of 817 patients, on DNA extracted from peripheral blood (n = 441), skeletal muscle biopsy samples (n = 293), both (n = 82) and more rarely urinary sediment cells (n = 1). We founded 16 individuals 12 families with the mutation, resulting in a mutation detection rate of 1.96 % that population. 12 individuals from nine families, who were following at our service, were included in this study. The most common findings in this series were in order of frequency: myopathy signs, neurobehavioral disorders, epilepsy, endocrine disorders, cerebellar ataxia, migraine, stroke-like episodes, recurrent vomiting, cardiac conduction disorders, peripheral neuropathy and signs of dysautonomia, myoclonus, sensorineural deafness, cortical blindness, uveitis, and proteinuria. In our series, we found that five of the patients were classified with the classical MELAS syndrome, two patients had CPEO associated with other symptoms such as psychiatric disorders and diabetes mellitus. The remaining patients had other features of mitochondrial disease not consistent with another recognised syndrome. In addition to stroke-like lesions, the more frequent lesions revealed in neuroimaging studies were deep gray matter changes, brain atrophy and white matter changes. These changes had similar prevalences between the patients with the classic syndrome of MELAS and patients who did not have stroke-like lesions. All patients with classical MELAS have lactate peak and 60% of them have reduction of NAA at spectroscpopy; while these changes were found in two and one patient respectively, in the group of patients without stroke-like lesions. We identified azoospermia in one paciente with classic MELAS, a finding not previously associated with m.3243A>G. At moment, this is the largest Brazilian case series of patients with the m.3243A>G mutation. Clinical, laboratory and neuroimaging features of patients with mitochondrial disease associated with mutation m.3243A > G 10 CONCLUSION: The wide spectrum of clinical presentation and neuroimaging is a notable feature among patients with the mutation m.3243A> G mtDNA. This disorder should be considered in patients with evidence of signs and symptoms suggestive of multisystem involvement.
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Análise imunocitoquímica e de expressão gênica de efeitos do bevacizumabe em explantes de retina de ratos lister e em linhagem celular de glia de Müller humana / Immunocytochemistry and gene expression effects of bevacizumab on retinal explants of rats lister and glial cell line of human Müller analysis

Krempel, Paloma Gava 09 June 2015 (has links)
INTRODUÇÃO: As doenças retinianas associadas à neovascularização, tais como a degeneração macular relacionada à idade e as retinopatias diabética e da prematuridade são as principais e mais importantes causas da cegueira em todo o mundo. Nos últimos anos, injeções intravítreas de fármacos com ação antiangiogênica, como o bevacizumabe (BVZ), têm sido de grande valia tanto em pacientes na fase adulta quanto nos recém-natos. Todavia, estudos experimentais in vitro e in vivo sugerem que essas drogas promovam efeitos adversos sobre alguns processos celulares, interferindo diretamente em mecanismos fisiológicos que mantém a homeostase do tecido retiniano, incluindo os mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular. OBJETIVO: investigar o efeito do BVZ nos processos de transcrição e tradução de marcadores da gliose: GFAP e vimentina, de morte celular, caspase-3 e beclina-1, e dos proteoglicanos relacionados à manutenção e desenvolvimento de tecido retiniano: neurocam, fosfacam e sindecam-3. MÉTODOS: Dois modelos experimentais foram usados nesse estudo: 1) linhagem celular de Müller de Glia humana adulta (MIO-M1), cultivada em meio de cultura D-MEM na presença e ausência de BVZ por 12 e 24 horas nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL e 2) explantes de retinas de ratos 2 dias pós-nascidos submetidos à 0,50 mg/mL da droga por 48 horas. Durante este período foram mantidos a 5% de dióxido de carbono à temperatura de 37°C. A análise de proteínas foi realizada por imunocitohistoquímica e Western Blotting e a expressão de RNAm, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time). Foi utilizado o Teste de ANOVA - fator único para a comparação entre os grupos controle e tratados com BVZ de um mesmo período (12h ou 24h) e o teste t de Student para a comparação entre as mesmas concentrações de 12h e 24h, e para a comparação entre os grupos controle e tratado com BVZ dos explantes (p < 0,05). RESULTADOS: Nas células MIO-M1, o BVZ, aumentou a expressão gênica e diminui a tradução de VEGF na concentração de 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h. Para o GFAP, houve um aumento da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e aos outros grupos em 24h. Entretanto, houve diminuição da tradução para estes mesmos períodos e condições. Para a vimentina, houve aumento na transcrição em 0,50 mg/mL após 24h. Os achados de beclina-1 revelaram uma diminuição da transcrição e tradução em 0,25 mg/mL em 24h comparado a 12h. A transcrição entre os grupos do mesmo período aumentou nos grupos tratados com BVZ tanto em 12h quanto em 24h. A tradução da beclina-1 diminuiu em 0,25 mg/mL, mas aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação à 12h. A comparação entre os grupos de 24h revelou aumento da tradução em 0,50 mg/mL. Para a caspase-3, houve diminuição da transcrição em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h e entre nos grupos tratados com BVZ em 24h. A tradução revelou um aumento em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h. No fosfacam, houve diminuição da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles para 12h e 24h. A transcrição de neurocam diminuiu em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles em 12h e 24h. A tradução aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h, mas diminuiu entre os grupos em 24h. Nos explantes, a transcrição e tradução de VEGF diminuiram no grupo tratado com BVZ após 48h. CONCLUSÃO: Nossos resultados relacionados às células MIO-M1 e ao explante de ratos, in vitro, nos permitem aventar o possível comprometimento ocasionado pela depleção do VEGF pelo BVZ na homeostase do tecido retiniano, in vivo, interferindo nas moléculas envolvidas na morte e diferenciação celular e na neuroproteção em indivíduos em fase adulta e recém-nato / Backgraound: Vasoproliferative retinal disorders such as age-related macular, degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity are major causes of blindness in the world. In recent years, intravitreal injections of drugs with antiangiogenic action, as bevacizumab, have been very useful for both patients in adulthood and in newborns. However, experimental studies, in vivo and in vitro, suggest that antiangiogenic drugs may promote side effects in cellular proceedings, interfering directly in physiological mechanisms of cellular proliferation, differentiation and death. POURPOSE: Investigate the bevacizumab effects in transcription and translation processes of gliosis, GFAP and vimentin, cellular death markers, caspase-3 and beclin-1, and proteoglycans involved in retinal tissue maintenance and development, neurocan, phosphacan and syndecan-3. METHODS: Two experimental models were used on this research: cellular lineage of adult and human Müller glial cell(MIO-M1) were cultivated on D-MEM medium with 0,25 and 0,50 mg/mL bevacizumab for 12 and 24 hours, and two days old rat retinal explants submitted to 0,50 mg/mL for 48 hours. During this period were stored in laboratory ovens at 5% carbon dioxide pressure and 37 °C average temperature. Molecular techniques were used to evaluate gene expression and protein content. Protein assessments were performed by immunocytochemistry and western blotting analysis, while Real Time PCR was used to measure mRNA content. ANOVA tests one factor were applied to compare the control and BVZ groups of the same period (12h or 24h) and t test from Student to compare the same conditions of 12h and 24h, and to compare the control and BVZ retinal explants groups (p<0.05). RESULTS: At MIO-M1 cells, BVZ increased the gene expression and reduced the translation of VEGF at concentration of 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours. For GFAP, there was an increase of transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and to the other groups at 24 hours. However, there was a decrease in translation for these same periods and conditions. For vimentin, there was an increase in transcription at 0.50 mg / mL after 24 hours. The beclin-1 findings revealed a decrease of transcription and translation at 0.25 mg / ml compared at 24 h compared to 12h. Transcription among groups increased in BVZ treated groups at 12h and 24h. The translation of beclin-1 decreased at 0.25 mg / ml, but increased at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. The comparison between the groups at 24h revealed an increased in translation at 0.50 mg / mL. For caspase-3, there was a decrease in transcription at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 compared to 12 hours and among BVZ treated groups at 24h. Translation revealed an increase at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. For fosfacam, there was a decreased in transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. The transcription of neurocam decreased at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. Translation increased at 0.50 mg / mL at 24 compared to 12 hours, but decreased among the groups at 24 hours. For explants, transcription and translation of VEGF decreased in the BVZ group treated after 48h. CONCLUSION: Our results related to the MIO-M1 cells and explants of rats,in vitro, allow us to suggest the possible impairment caused by depletion of VEGF by BVZ in the homeostasis of retinal tissue, in vivo, interfering in the molecules involved in cell death and cell differentiation and neuroprotection in individuals in adulthood and newborns
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Análise imunocitoquímica e de expressão gênica de efeitos do bevacizumabe em explantes de retina de ratos lister e em linhagem celular de glia de Müller humana / Immunocytochemistry and gene expression effects of bevacizumab on retinal explants of rats lister and glial cell line of human Müller analysis

Paloma Gava Krempel 09 June 2015 (has links)
INTRODUÇÃO: As doenças retinianas associadas à neovascularização, tais como a degeneração macular relacionada à idade e as retinopatias diabética e da prematuridade são as principais e mais importantes causas da cegueira em todo o mundo. Nos últimos anos, injeções intravítreas de fármacos com ação antiangiogênica, como o bevacizumabe (BVZ), têm sido de grande valia tanto em pacientes na fase adulta quanto nos recém-natos. Todavia, estudos experimentais in vitro e in vivo sugerem que essas drogas promovam efeitos adversos sobre alguns processos celulares, interferindo diretamente em mecanismos fisiológicos que mantém a homeostase do tecido retiniano, incluindo os mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular. OBJETIVO: investigar o efeito do BVZ nos processos de transcrição e tradução de marcadores da gliose: GFAP e vimentina, de morte celular, caspase-3 e beclina-1, e dos proteoglicanos relacionados à manutenção e desenvolvimento de tecido retiniano: neurocam, fosfacam e sindecam-3. MÉTODOS: Dois modelos experimentais foram usados nesse estudo: 1) linhagem celular de Müller de Glia humana adulta (MIO-M1), cultivada em meio de cultura D-MEM na presença e ausência de BVZ por 12 e 24 horas nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL e 2) explantes de retinas de ratos 2 dias pós-nascidos submetidos à 0,50 mg/mL da droga por 48 horas. Durante este período foram mantidos a 5% de dióxido de carbono à temperatura de 37°C. A análise de proteínas foi realizada por imunocitohistoquímica e Western Blotting e a expressão de RNAm, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time). Foi utilizado o Teste de ANOVA - fator único para a comparação entre os grupos controle e tratados com BVZ de um mesmo período (12h ou 24h) e o teste t de Student para a comparação entre as mesmas concentrações de 12h e 24h, e para a comparação entre os grupos controle e tratado com BVZ dos explantes (p < 0,05). RESULTADOS: Nas células MIO-M1, o BVZ, aumentou a expressão gênica e diminui a tradução de VEGF na concentração de 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h. Para o GFAP, houve um aumento da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e aos outros grupos em 24h. Entretanto, houve diminuição da tradução para estes mesmos períodos e condições. Para a vimentina, houve aumento na transcrição em 0,50 mg/mL após 24h. Os achados de beclina-1 revelaram uma diminuição da transcrição e tradução em 0,25 mg/mL em 24h comparado a 12h. A transcrição entre os grupos do mesmo período aumentou nos grupos tratados com BVZ tanto em 12h quanto em 24h. A tradução da beclina-1 diminuiu em 0,25 mg/mL, mas aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação à 12h. A comparação entre os grupos de 24h revelou aumento da tradução em 0,50 mg/mL. Para a caspase-3, houve diminuição da transcrição em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h e entre nos grupos tratados com BVZ em 24h. A tradução revelou um aumento em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h. No fosfacam, houve diminuição da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles para 12h e 24h. A transcrição de neurocam diminuiu em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles em 12h e 24h. A tradução aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h, mas diminuiu entre os grupos em 24h. Nos explantes, a transcrição e tradução de VEGF diminuiram no grupo tratado com BVZ após 48h. CONCLUSÃO: Nossos resultados relacionados às células MIO-M1 e ao explante de ratos, in vitro, nos permitem aventar o possível comprometimento ocasionado pela depleção do VEGF pelo BVZ na homeostase do tecido retiniano, in vivo, interferindo nas moléculas envolvidas na morte e diferenciação celular e na neuroproteção em indivíduos em fase adulta e recém-nato / Backgraound: Vasoproliferative retinal disorders such as age-related macular, degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity are major causes of blindness in the world. In recent years, intravitreal injections of drugs with antiangiogenic action, as bevacizumab, have been very useful for both patients in adulthood and in newborns. However, experimental studies, in vivo and in vitro, suggest that antiangiogenic drugs may promote side effects in cellular proceedings, interfering directly in physiological mechanisms of cellular proliferation, differentiation and death. POURPOSE: Investigate the bevacizumab effects in transcription and translation processes of gliosis, GFAP and vimentin, cellular death markers, caspase-3 and beclin-1, and proteoglycans involved in retinal tissue maintenance and development, neurocan, phosphacan and syndecan-3. METHODS: Two experimental models were used on this research: cellular lineage of adult and human Müller glial cell(MIO-M1) were cultivated on D-MEM medium with 0,25 and 0,50 mg/mL bevacizumab for 12 and 24 hours, and two days old rat retinal explants submitted to 0,50 mg/mL for 48 hours. During this period were stored in laboratory ovens at 5% carbon dioxide pressure and 37 °C average temperature. Molecular techniques were used to evaluate gene expression and protein content. Protein assessments were performed by immunocytochemistry and western blotting analysis, while Real Time PCR was used to measure mRNA content. ANOVA tests one factor were applied to compare the control and BVZ groups of the same period (12h or 24h) and t test from Student to compare the same conditions of 12h and 24h, and to compare the control and BVZ retinal explants groups (p<0.05). RESULTS: At MIO-M1 cells, BVZ increased the gene expression and reduced the translation of VEGF at concentration of 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours. For GFAP, there was an increase of transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and to the other groups at 24 hours. However, there was a decrease in translation for these same periods and conditions. For vimentin, there was an increase in transcription at 0.50 mg / mL after 24 hours. The beclin-1 findings revealed a decrease of transcription and translation at 0.25 mg / ml compared at 24 h compared to 12h. Transcription among groups increased in BVZ treated groups at 12h and 24h. The translation of beclin-1 decreased at 0.25 mg / ml, but increased at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. The comparison between the groups at 24h revealed an increased in translation at 0.50 mg / mL. For caspase-3, there was a decrease in transcription at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 compared to 12 hours and among BVZ treated groups at 24h. Translation revealed an increase at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. For fosfacam, there was a decreased in transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. The transcription of neurocam decreased at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. Translation increased at 0.50 mg / mL at 24 compared to 12 hours, but decreased among the groups at 24 hours. For explants, transcription and translation of VEGF decreased in the BVZ group treated after 48h. CONCLUSION: Our results related to the MIO-M1 cells and explants of rats,in vitro, allow us to suggest the possible impairment caused by depletion of VEGF by BVZ in the homeostasis of retinal tissue, in vivo, interfering in the molecules involved in cell death and cell differentiation and neuroprotection in individuals in adulthood and newborns

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