Este trabalho teve três objetivos principais: a) Estabelecer valores de referência para os parâmetros bioquímicos e hematológicos do jundiá cultivado em açude; b) Determinar a CL50 da cipermetrina ao jundiá, bem como verificar o efeito nos parâmetros sangüíneos; c) Determinar as características físicas e químicas do sêmen do jundiá. Os animais foram obtidos de açudes de um Produtor de Peixes em Rolante, RS e conduzidos ao Laboratório do ICBS, UFRGS, onde permaneceram em tanques de 500l. O sangue era obtido por punção do vaso caudal através de seringa descartável, transferidos a tubos com e sem EDTA 10%, e os testes bioquímicos e hematológicos realizados no HCPA. Para a avaliação da CL50 da cipermetrina no jundiá grupos (n ≥10) de animais foram tratados com a exposição a 8 diferentes concentrações de cipermetrina (ppm) (0:controle; 0,08; 0.1; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; 0,36). Os peixes foram observados após 24, 48, 72 e 96h do início do tratamento para avaliar o percentual de mortalidade. No estudo do estresse metabólico, grupos (n ≥6) receberam os tratamentos: ausência de exposição ao pesticida (controle) e duas doses (0.08 e 0.12 ppm) de cipermetrina. Foram feitas coletas de sangue antes, após 2, 4 e 8 dias da aplicação do pesticida para análise no HCPA. Para o estudo do sêmen, este foi obtido em diferentes períodos durante as 4 estações. A densidade espermática foi medida pela técnica do espermatócrito e pela contagem microscópica. A duração da motilidade espermática foi observada num microscópio, usando para interpretação uma escala arbitrária variando de 0 a 5. Parte do sêmen foi centrifugado para a obtenção do fluido seminal, o qual foi imediatamente congelado a –200C até análise no HCPA Com a concentração 0,12 ppm as variações bioquímicas foram incrementadas e já se observaram alterações nos movimentos e no equilíbrio. Em estações de aqüicultura, produtores podem realizar avaliação periódica em uma pequena população de seus peixes, quantificando o grau de estresse metabólico. Esses indicadores de estresse podem ser precocemente detectados apesar da aparência exterior e comportamentos normais dos peixes. A técnica para a medida da densidade espermática através do espermatócrito apresentou correlação com a contagem celular por microscópio, com a vantagem de ser mais simples, rápida e econômica. As características que foram encontradas no sêmen parecem ser bons indicadores da qualidade espermática e podem auxiliar na seleção de machos doadores de gametas de alta qualidade em sistemas de cultivo deste peixe.

Resumo: A perda da prenhez é uma das principais causas de prejuízo econômico em uma criação de equinos. As causas de aborto podem ser de origem não infecciosa ou infecciosa. A disseminação de bactérias, vírus e protozoários pode ocorrer através do sêmen e o garanhão pode ser um portador assintomático de agentes patogênicos que causam perdas reprodutivas em éguas. Entre as causas infecciosas, o aborto causado por protozoários, principalmente por Neospora sp. raramente é incluído no diagnóstico diferencial das perdas reprodutivas. O presente estudo contém uma revisão de literatura sobre as principais causas de aborto por protozoário e vírus na égua, e dois capítulos com as pesquisas realizadas. No capítulo 1 está o estudo sobre a ocorrência de anticorpos contra Neospora sp. e contra Toxoplasma gondii em éguas com e sem histórico de falhas reprodutivas e a presença de cães e bovinos como fatores de risco para a soroprevalência de Neospora sp. em éguas. As soroprevalências de Neospora sp. foram 25,71% (9/35), nas éguas com histórico de falhas reprodutivas, e 6,49% (5/77), nas éguas sem histórico de falhas reprodutivas. Através do teste qui-quadrado, com um nível de significância de alpha=0,05, verificou-se diferença estatisticamente significativa entre as éguas com e sem histórico de falhas reprodutivas e a soroprevalência de Neospora sp. As soroprevalências de T. gondii foram de 2,85% (1/35), nas éguas com histórico de falhas reprodutivas e de 1,29% (1/77) nas éguas sem histórico de falhas reprodutivas. Não foi observada diferença estatística significativa entre a presença de cães e a soroprevalência de Neospora sp. nas éguas. A presença de bovinos foi considerada como fator de risco para Neospora sp. nas éguas, com diferença estatística significativa em relação à presença destes animais e a soropositividade ao parasita nas éguas (X²= 9,3414; p = 0,00224). No capítulo dois, um estudo inédito foi realizado sobre a investigação dos protozoários Neospora sp. e T. gondii em amostras de sêmen de reprodutores equinos através do cultivo celular e da reação em cadeia da polimerase (PCR). As colheitas de sêmen foram realizadas de oito garanhões, clinicamente saudáveis, através da vagina artificial. Os ejaculados foram centrifugados e a porção contendo os espermatozóides foi recuperada, sendo uma parte inoculada no cultivo celular com células Vero, e a restante mantida a - 20ºC até o momento da extração de DNA, realizada pelo método de fenolclorofórmio. As amostras obtidas do cultivo celular do sêmen e do sêmen in natura foram submetidas à amplificação por PCR, utilizando iniciadores que delimitam o segmento de DNA da região Nc5 de N. caninum (Np6/Np21), da região ITS1 (ITS2/ITS5) e da região 18S (FE/RE; FE/RI). Não foi verificado o crescimento de protozoários no cultivo celular do sêmen. Apenas para a região 18S ocorreu amplificação de DNA das amostras obtidas do cultivo celular do sêmen e do sêmen in natura. As amostras foram sequenciadas e as sequências obtidas do cultivo celular do sêmen foram compatíveis com Acanthamoeba rhysodes e A. castellanii. Os protozoários Neospora sp. e T. gondii não foram encontrados no sêmen dos reprodutores avaliados. Os protozoários encontrados neste estudo podem ser provenientes do ambiente e estarem presentes no prepúcio, contaminando o sêmen. A presença destes agentes e suas consequências na reprodução em equinos até hoje é desconhecida.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:56:11Z : No. of bitstreams: 1 maziero_rrd_me_botfmvz.pdf: 928128 bytes, checksum: 359ec822b473e1e1a55462f120819df5 (MD5) / A criopreservação de sêmen equino mostra-se como importante instrumento no ganho genético de rebanhos pela maximização do uso de bons reprodutores. Porém, nos programas de inseminação artificial, a utilização de espermatozóides criopreservados apresenta índices de fertilidade inferiores aos obtidos com sêmen a fresco, constituindo um dos maiores entraves à plena difusão dessa biotecnologia. Assim, o experimento 1 teve como objetivo avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA) e a integridade da membrana plasmática por microscopia de epi-fluorescência de espermatozóides equino congelados em palhetas de 0,5 e 0,25 mL, em diferentes taxas de congelação na viabilidade espermática. Para desenvolver o projeto foram utilizadas três metodologias de congelação: o método convencional em caixa de isopor e dois equipamentos automatizados, um deles a máquina Mini Digitcool® (IMV - Technologies - França), que possibilita uma variação de -10ºC a -60ºC por minuto e o outro equipamento TK® 4000C (TK Equipamentos para Congelação) que possibilita uma variação de -10ºC a -40ºC por minuto. Para tanto foram utilizados 3 ejaculados de 4 garanhões de diferentes raças, para cada protocolo de congelação, sendo o protocolo 1: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -20ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -20ºC/min; protocolo 2: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -40ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -40ºC/min e protocolo 3: caixa de isopor x máquina TK® 4000C na taxa de -40ºC/min x máquina Mini Digitcool® na taxa de -60ºC/min. Para a análise pós-descongelação as palhetas de 0,5 mL foram descongeladas a 46ºC por 20 segundos e as palhetas de 0,25 mL a 46ºC por 15 segundos. A análise estatística das variáveis estudadas no sêmen congelado/descongelado foi realizada mediante o pacote... / Equine semen cryopreservation comes as an important tool to enhance the herd gene pool by maximizing the use of the top genetic merit stallions. However, the use of frozen semen in the artificial insemination programs presents reduced fertility rates in comparison to those obtained with fresh semen, being one of the biggest hindrances to spread this biotechnology. Thus, Experiment 1 aimed to evaluate the motility pattern using a computer-assisted sperm analysis (CASA) and plasma membrane integrity by epifluorescence microscopy of equine semen that were frozen in 0.5 and 0.25mL straws at different freezing rates and their relationship with sperm viability. Three different methodologies were used: conventional method with isothermic box and two automated systems: the Mini Digitcool® machine (IMV - Technologies - France), which allows a range from -10oC to -60oC per minute, and the TK® 4000C (TK Equipamentos para Congelação, Brazil), that provides a range from -10ºC to -45ºC per minute. Therefore 3 ejaculates for 4 animals were used for each freezing protocol. On protocol 1 we compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -20ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -20ºC/min rate; Protocol 2 compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -40ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -40ºC/min rate; and Protocol 3 compared isothermic box vs. TK® 4000C machine at a -40ºC/min rate vs. Mini Digitcool® at a -60ºC/min rate. The 0.5mL-straw samples were thawed at 46oC/20 sec whereas samples from the 0.25mL straws were thawed at 46oC/15 sec for post-thawing analysis. Statistical analysis from the frozen-thawed semen evaluated parameters was performed using the statistics software SAS 9.1. At first, it was used the descriptive analysis Box Plot R program. Then, data were analyzed using Proc. MIXED, a variance analysis to investigate the treatment effect (freezing rates and... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-25Bitstream added on 2014-06-13T18:58:51Z : No. of bitstreams: 1 sakashita_sm_me_botfmvz.pdf: 493745 bytes, checksum: b66b1a455367ff9bb2f050d0a9445f86 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivou-se determinar in vitro o efeito da adição de antioxidantes Trolox® e Catalase ao diluidor Glicina-Gema-Leite com 5% de gema de ovo, utilizado na refrigeração do sêmen caprino em sistema de Equitainer® por 24 ou 48 horas, avaliando-se a motilidade espermática determinada no sistema computadorizado (CASA), a integridade de membrana plasmática pela combinação dos corantes fluorescente iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína (IP+DIC), patologia espermática em câmara úmida em solução de gluteraldeído e após a refrigeração ao teste de exaustão em banho-maria (37ºC até 240 minutos). Para isso foi utilizado o sêmen em duplicata (12 amostras) de 6 caprinos Boer, coletados com vagina artificial e diluído na concentração final de 400x106 espermatozóides/mL em meio Glicose-Leite (GL) e nos diluidores Glicina-Gema-Leite com (GGLtc) e sem (GGL) antioxidantes Trolox® e Catalase. As análises foram realizadas no sêmen fresco, após diluição (pré-refrigeração), 24 e 48 horas pós-refrigeração no sistema Equitainer®, e durante o teste de exaustão nos tempos 30, 60, 120 e 240 minutos de incubação em banho-maria. Foi demonstrado que o diluidor GGLtc demonstrou melhor eficiência na proteção de acrossomo entre os diluidores. A adição de antioxidante ao diluidor GGL com 5% de gema de ovo foi capaz de manter baixo percentual de acrossomo lesado durante a refrigeração de até 48 horas e o sistema Equitainer® eficiente durante a refrigeração até 48 horas / The objetive was to determine in vitro the effect of adding antioxidant Trolox® and Catalase in the extender Glycine-Yolk-Milk with 5% of egg yolk, used in the goat semen cooling in Equitainer® system for 24 or 48 hours, evaluating sperm motility determined by the computerized semen analysis (CASA), the integrity of the plasma membrane by a combination of fluorescent carboxyfluorescein diacetato(DIC) and propidium iodide(IP), sperm pathology in the humid chamber in gluteraldehyde solution and after cooling to the exhaustion test in a water bath (37°C up to 240 minutes). For the semen that was used in duplicate (12 samples) for six Boer goats, collected with artificial vagina and diluted at a final concentration of 400x106 sperm/mL using extenders Glucose-Milk (GL) and Glycine-Yolk-Milk (GGLtc) and without (GGL) antioxidant Trolox® and Catalase. Analyses were performed in fresh semen, after diluition (pre-cooling) and 24 or 48 hours post cooling in Equitainer® system, and during the exhaustion test incubation in a water bath for 30, 60, 120 and 240 minutes. It has been shown that the extender GGLtc showed better efficiency in protection acrossome between the extenders. The addition of antioxidant in the GGL with 5% egg yolk (GGLtc) was able to maintain a low percentage of damaged acrossome during cooling up to 48 hours and the Equitainer® system during the cooling efficiency up to 48 hours

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:38:30Z : No. of bitstreams: 1 vita_b_me_botfmvz.pdf: 1310712 bytes, checksum: 968ab4386692666cb0cda1f45e9f5d04 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O presente estudo objetivou comparar diferentes curvas de congelação utilizando-se uma máquina com curvas programadas (TK3000®) com congelação em vapor de nitrogênio liquido, utilizando sêmen de garanhões de alta e baixa congelabilidade. Comparou-se a eficácia do período de estabilização do sêmen em diferentes sistemas de transporte refrigerado (Botutainer® e Equitainer®) em relação à estabilização feita em refrigerador Minitüb® previamente à congelação. No experimento I e II foram utilizados 4 garanhões com sêmen de alta congelabilidade. As amostras foram refrigeradas durante 20 minutos previamente à congelação em refrigerador Minitüb® (GM), Botutainer® (GB) e Equitainer® (GE). Não houve diferença entre os grupos quanto a motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP): GM (67,1;32,1%); GB (65,2;31,9%); GE (63,4;30,4%) demonstrando que os dispositivos podem ser utilizados como uma alternativa aos refrigeradores. Os valores de integridade de membrana plasmática (IMP%) foram GM(49,43a); GB(48,70a); GE(44,90b). No experimento II foram utilizadas 3 curvas programadas na TK3000® (C1, C2, C3) e a metodologia em caixa de isopor (GC). As comparações foram realizadas em relação ao GC e não apresentaram diferença significativa. Valores em porcentagem de MT, MP e IMP: GCxC1 (70 x 67,5; 35,7 x 32; 48,3 x 46); GCxC2 (63,3 x 67,66; 33,3 x 34,8; 45,4 x 48,3); GCxC3 (63,2 x 65; 32,2 x 32,4; 48,09 x 49,3). No teste de fertilidade, as inseminações foram realizadas com amostras congeladas com C2 e GC apresentando índices de prenhez de 65 e 60% respectivamente, sem diferença significativa. A TK3000® foi tão eficaz quanto à metodologia de congelação em caixa de isopor em relação à congelabilidade e fertilidade. Todas as curvas testadas foram eficientes na manutenção da viabilidade... / This present study compared freezing ratios in a programmable freezer (TK3000) performed by usual methodology, using good freezers and poor freezers stallions. The semen stabilization period efficiency was compared in cooled semen transport systems (Botutainer® e Equitainer®) in relation with Minitüb® fridge before the cryopreservation. Four good freezers stallions was used in experiments I and II. Samples were cooled during 20 minutes before the cryopreservation in a Minitüb® fridge (GM), Botutainer® (GB) and Equitainer® (GE). There was not difference between groups in relation with total motility (TM) and progressive motility (PM): CM (67,1;32,1%); GB (65,2;31,9%); GE (63,4;30,4%) showing that transport systems can be used as an alternative instead of fridges. Plasma membrane integrity (MPI%) values were CM (49,43a); GB (48,70a); GE (44,90b). Three frozen rations were used in experiment II in the TK3000® (C1, C2, C3) and the isothermic box (CG). Results from each freezing ratio were compared to the control group and no difference was observed. Percentage values from TM, PM and MPI were the following: CGxC1(70x67,5; 35,7x32; 48,3x46); CGxC2 (63,3x67,66; 33,3x34,8; 45,4x48,3); CGxC3 (63,2x65; 32,2x32,4; 48,09x49,3). In the fertility test, artificial inseminations were performed with C2 and GC frozen samples showing pregnancy rates of 65 and 60%, respectively, without significant difference. The TK3000® was as efficient as the isothermic box frozen methodology in relation to freezability and fertility. All freezing ratios were efficient in semen viability maintenance. Ten Mangalarga Marchador breed stallions were used in the experiment III. The samples were shared and frozen simultaneously in two programmable freezers with different ratios (G2 e G3) and in an isothermic box (CG). For the statistical analisys, semen ...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador : Maria Denise Lopes / Resumo: Com o objetivo de se avaliar dois meios diluidores - Tris/Glicerol e MP50 - para a congelação do sêmen de cães, foram utilizados ejaculados de 10 cães adultos, colhidos por meio de manipulação digital. As características morfofuncionais foram analisadas no sêmen in natura (T1), refrigerado (T2) e descongelado (T3). As amostras foram avaliadas para: motilidade e vigor espermático, teste hiposmótico, integridade de membrana espermática, morfologia espermática e análise ultra-estrutural, além da mensuração do pH. Após a diluição com os diferentes meios, o sêmen foi envasado em palhetas francesas de 0,5mL, contendo 40 x 106 espermatozóides móveis/palheta, e mantidas por 60 minutos à 5ºC (T2); logo após, foram transferidos para o vapor de nitrogênio durante 20 minutos, e por fim, mergulhadas em nitrogênio. O armazenamento das palhetas foi em botijão criogênico. As palhetas foram descongeladas a 70ºC por 8 segundos. A análise de variância mostrou influência do efeito animal nas variáveis analisadas, com exceção da motilidade espermática e integridade de membrana espermática. O teste hiposmótico, a integridade de membrana espermática e o pH, nas amostras refrigeradas (T2), apresentaram diferença estatística significativa (p<0,05) entre os meios, com superioridade do MP50. Nas análises pós-descongelação (T3), não foram observadas diferenças significativas entre as variáveis estudadas para os dois meios. A análise ultra-estrutural, mostrou edema de membrana plasmática e acrossomal, nas diferentes etapas do processo de congelação. Em conclusão, considerando-se as características morfofuncionais do sêmen canino pós-descongelação, os meios diluidores demonstraram igualdade. / Abstract: The objective of this study was to verify the efficiency of two different extenders for freezing dog semen: Tris/Glycerol and MP50. Ten ejaculates from different adult dogs were collected by digital manipulation. Seminal characteristics were evaluated in three different moments, fresh (T1), cooled (T2) and thawed (T3) semen for sperm motility and vigor, hypo-osmotic swelling test, sperm membrane integrity, sperm morphology, ultrastructural analysis and seminal pH. The samples were divided into two equal parts and each part was mixed with one extender type. After mixing, samples were packaged in 0,5mL French straws with 40 x 106 spermatozoa/straw. Semen samples were kept at 50C for 60 minutes (T2); then frozen in static vapor of nitrogen for the following 20 minutes and immersed in liquid nitrogen until being thawed in 700 C water for 8 seconds (T3). By analysis of variance, it would be possible to verify the animal effect on almost all variables observed in this study, except for sperm motility and membrane integrity. For cooled semen (T2), MP50 were significantly better for hypo-osmotic swelling test, sperm membrane integrity and pH (p<0,05) than Tris/Glycerol. For thawed semen (T3), there was no significant difference between extenders. By ultrastructural analysis, it was possible to verify swelling plasma and acrosomal sperm membranes in the different stages of freezing process. In conclusion, the extenders showed the same results as to morphofunctional characteristics the semen canine thawed. / Mestre

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Daniel Bartoli de Sousa / Banca: Cezinande Meira / Resumo: Objetivou-se determinar in vitro o efeito da adição de antioxidantes Trolox® e Catalase ao diluidor Glicina-Gema-Leite com 5% de gema de ovo, utilizado na refrigeração do sêmen caprino em sistema de Equitainer® por 24 ou 48 horas, avaliando-se a motilidade espermática determinada no sistema computadorizado (CASA), a integridade de membrana plasmática pela combinação dos corantes fluorescente iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína (IP+DIC), patologia espermática em câmara úmida em solução de gluteraldeído e após a refrigeração ao teste de exaustão em banho-maria (37ºC até 240 minutos). Para isso foi utilizado o sêmen em duplicata (12 amostras) de 6 caprinos Boer, coletados com vagina artificial e diluído na concentração final de 400x106 espermatozóides/mL em meio Glicose-Leite (GL) e nos diluidores Glicina-Gema-Leite com (GGLtc) e sem (GGL) antioxidantes Trolox® e Catalase. As análises foram realizadas no sêmen fresco, após diluição (pré-refrigeração), 24 e 48 horas pós-refrigeração no sistema Equitainer®, e durante o teste de exaustão nos tempos 30, 60, 120 e 240 minutos de incubação em banho-maria. Foi demonstrado que o diluidor GGLtc demonstrou melhor eficiência na proteção de acrossomo entre os diluidores. A adição de antioxidante ao diluidor GGL com 5% de gema de ovo foi capaz de manter baixo percentual de acrossomo lesado durante a refrigeração de até 48 horas e o sistema Equitainer® eficiente durante a refrigeração até 48 horas / Abstract: The objetive was to determine in vitro the effect of adding antioxidant Trolox® and Catalase in the extender Glycine-Yolk-Milk with 5% of egg yolk, used in the goat semen cooling in Equitainer® system for 24 or 48 hours, evaluating sperm motility determined by the computerized semen analysis (CASA), the integrity of the plasma membrane by a combination of fluorescent carboxyfluorescein diacetato(DIC) and propidium iodide(IP), sperm pathology in the humid chamber in gluteraldehyde solution and after cooling to the exhaustion test in a water bath (37°C up to 240 minutes). For the semen that was used in duplicate (12 samples) for six Boer goats, collected with artificial vagina and diluted at a final concentration of 400x106 sperm/mL using extenders Glucose-Milk (GL) and Glycine-Yolk-Milk (GGLtc) and without (GGL) antioxidant Trolox® and Catalase. Analyses were performed in fresh semen, after diluition (pre-cooling) and 24 or 48 hours post cooling in Equitainer® system, and during the exhaustion test incubation in a water bath for 30, 60, 120 and 240 minutes. It has been shown that the extender GGLtc showed better efficiency in protection acrossome between the extenders. The addition of antioxidant in the GGL with 5% egg yolk (GGLtc) was able to maintain a low percentage of damaged acrossome during cooling up to 48 hours and the Equitainer® system during the cooling efficiency up to 48 hours / Mestre

The use of AI in dogs has been limited by the lack of effective and reliable means of cryopreservation of semen and by the poor correlation between traditional methods of post-thaw assessment of semen quality and fertility. In order to address these problems, the present study focuses upon methods of cold storage and cryopreservation of dog spermatozoa by undertaking comparative evaluations of post-thaw motility and in vitro induction of acrosome reaction. Split-ejaculate protocols were used to compare the effect of storage at +4°C and cryopreservation upon (i) the maintenance of spermatozoa motility and (ii) spontaneous or A23187-induced acrosome reactions during incubation at 39°C (in 5% CO2 in the humidified air) for 60 or 120 min. The assessments of samples were made by Bright-Field, Phase Contrast (PC), Differential Interference Contrast (DIC), Scanning (SEM) and Transmission (TEM) Electron Microscopy. The interaction between the process of glycerolisation and the presence of seminal plasma is one of the key limitors for success in cryopreservation of dog spermatozoa. Interactions between the effects of removal of seminal plasma (by centrifugation), dilution rate, the temperature at which glycerolisation took place and the concentration of glycerol upon survival of spermatozoa at +4°C were studied in a series of split-ejaculate experiments. Spermatozoa were suspended in Tris-fructose-citric acid extender containing 20% (v/v) egg yolk and 8% (v/v) glycerol at +4°C for 48 h. Survival was assessed as the percentage of spermatozoa displaying progressive motility. Survival of spermatozoa was higher (P < 0.05) after glycerolisation at +4°C than at the room temperature. At dilution rates of 1:1 and 1:2 (semen: extender), the survival was higher (P < 0.05) in samples that were centrifuged and glycerolised at +4°C than the samples that were neat and glycerolised at the room temperature. While at the dilution rate of 1:16 it was higher (P < 0.05) in samples that were neat plus glycerolised at +4°C than all samples that were glycerolised at the room temperature. Concentrations of glycerol that were > 2% (v/v) resulted in lower (P < 0.05) survival than at lower concentrations. Following the initial stage of the investigations, the optimisation and validation of a method for in vitro induction of acrosome reactions were required. Suspensions of spermatozoa in TALP medium were incubated in the presence of a logarithmic. series of concentrations of the calcium ionophore, A23187. Induction of acrosome reactions was assessedb y bright-field (using naphthol yellow S/aniline blue stain, NA) and phase contrast (PC) microscopy. Using these methods, it was determined that incubation in the presence of 1 μM/1 A23187 for a period of 30-45 min was optimal for inducing acrosomer eactions in fresh semen. It was also noted that the assessments of acrosome reactions by using NA staining, were highly correlated with PC microscopy. In consequence, the simple procedure of NA staining might be an acceptable alternative to PC microscopy for use in the field. Subsequently, the effect of chilling and glycerolisation upon in vitro induction of acrosome reactions by A23187 was assessed. Acrosome reactions were studied as these have been described in the literature as providing accurate bioassay of spermatozoal functionality in vivo. Acrosome reactions were assessed by using DIC microscopy. The acrosomal integrity was impaired after chilling, which accelerated the A23187-induced acrosome reaction such that a lower concentration (0.1 μM/1) of A23187 was also effective to induce the reaction within 60 min of incubation. However, the presence of 2% glycerol (v/v, final) in standard Tris extender, containing 20% egg yolk, did not significantly affect the sequence of acrosome reaction. The optimal freezing regimen (from +4°C to -120°C) was determined by using a programmable biological freezer in a series of experiments, in which various cooling rates were combined in a Latin square design. Semen was diluted in standard Tris extender containing 20% egg yolk and 2% glycerol (v/v, final) and packed in 0.25 ml French paiettes (straws). The optimal cooling regimen was -0.5°C/min from +4°C to -9°C, -40°C/min to -20°C, -100°C/min to -120°C, followed by direct immersion of the straws in liquid nitrogen. Changes in temperatures within an individual straw were continuously measured and these data were found to be highly correlated with the eventual post-thaw motility of frozen-thawed spermatozoa. Although freezing and thawing resulted in major acrosomal deterioration, there were no significant differences between freezing regimens on the basis of in vitro induction of acrosome reactions, as assessed by DIC microscopy. Finally, ultrastructural studies, using SEM and TEM, upon chilled (as 'ready to freeze') and frozen-thawed spermatozoa subjected to A23187-induced acrosome reaction demonstrated that freeze-thawing provoked the acrosome reaction such that, with TEM (i) the plasma membrane was usually damaged or missing, (ii) the acrosomal changes (including the loss of acrosomal content, as seen by decondensation and swelling) except vesiculation of the acrosomal membranes, exceeded to the equatorial segment and (iii) a further damage occurred to the post-acrosomal region. In summary, these results show that semen should be; (i) centrifuged for dilutions of < 1:8, (ii) diluted at 1:8 in Trisfructose-citric acid extender containing 20% egg yolk, (iii) glycerolised at +4°C at a final concentration of 2% glycerol (v/v), (iv) cooled at -0.5°C/min from +4°C to -9°C, at -40°C/min to -20°C and at -100°C/min to -120°C, followed by direct immersion of the straws in liquid nitrogen for cryopreservation and (i) introduced to 1 μM/1 A23187 in TALP, (ii) incubated for at least 30-45 min for induction of acrosome reaction in vitro and, thereby, demonstrated that optimisation of cryopreservation and in vitro induction of acrosome reaction of dog spermatozoa are possible.

Este trabalho teve três objetivos principais: a) Estabelecer valores de referência para os parâmetros bioquímicos e hematológicos do jundiá cultivado em açude; b) Determinar a CL50 da cipermetrina ao jundiá, bem como verificar o efeito nos parâmetros sangüíneos; c) Determinar as características físicas e químicas do sêmen do jundiá. Os animais foram obtidos de açudes de um Produtor de Peixes em Rolante, RS e conduzidos ao Laboratório do ICBS, UFRGS, onde permaneceram em tanques de 500l. O sangue era obtido por punção do vaso caudal através de seringa descartável, transferidos a tubos com e sem EDTA 10%, e os testes bioquímicos e hematológicos realizados no HCPA. Para a avaliação da CL50 da cipermetrina no jundiá grupos (n ≥10) de animais foram tratados com a exposição a 8 diferentes concentrações de cipermetrina (ppm) (0:controle; 0,08; 0.1; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; 0,36). Os peixes foram observados após 24, 48, 72 e 96h do início do tratamento para avaliar o percentual de mortalidade. No estudo do estresse metabólico, grupos (n ≥6) receberam os tratamentos: ausência de exposição ao pesticida (controle) e duas doses (0.08 e 0.12 ppm) de cipermetrina. Foram feitas coletas de sangue antes, após 2, 4 e 8 dias da aplicação do pesticida para análise no HCPA. Para o estudo do sêmen, este foi obtido em diferentes períodos durante as 4 estações. A densidade espermática foi medida pela técnica do espermatócrito e pela contagem microscópica. A duração da motilidade espermática foi observada num microscópio, usando para interpretação uma escala arbitrária variando de 0 a 5. Parte do sêmen foi centrifugado para a obtenção do fluido seminal, o qual foi imediatamente congelado a –200C até análise no HCPA Com a concentração 0,12 ppm as variações bioquímicas foram incrementadas e já se observaram alterações nos movimentos e no equilíbrio. Em estações de aqüicultura, produtores podem realizar avaliação periódica em uma pequena população de seus peixes, quantificando o grau de estresse metabólico. Esses indicadores de estresse podem ser precocemente detectados apesar da aparência exterior e comportamentos normais dos peixes. A técnica para a medida da densidade espermática através do espermatócrito apresentou correlação com a contagem celular por microscópio, com a vantagem de ser mais simples, rápida e econômica. As características que foram encontradas no sêmen parecem ser bons indicadores da qualidade espermática e podem auxiliar na seleção de machos doadores de gametas de alta qualidade em sistemas de cultivo deste peixe.

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.