CATALÀ: La cetogènesi és un procés mitocondrial a partir del qual es sintetitzen els cossos cetònics: acetona, acetoacetat i 3-hidroxibutirat, que són emprats com a font d'energia en el mitocondri dels teixits extrahepàtics a través de l'acció de la Succinil-CoA:3-cetoàcid-CoA transferasa (SCOT). Alternativament, en el citosol dels teixits lipogènics, l'acetoacetat pot ser activat a acetoacetil-CoA, a través de l'enzim Acetoacetil-CoA sintetasa (AACS), proporcionant unitats acetil-CoA de manera independent i anàloga al citrat produït en el mitocondri, transferit al citosol i escindit per l'ATP-citrat liasa.1. Estudi de la funcionalitat de la seqüència del cDNA del gen AACS humà predit. Hem demostrat que la seqüència predita del cDNA del gen AACS humà codifica per una proteïna funcional. Els valors de les constants de Michaellis-Menten (Km) de la proteïna GST-AACS son de 37.6M, 155.24M i 2.3M per l'acetoacetat, l'ATP i el CoA, respectivament. A més, l'enzim AACS humà és inhibit a 15 M de CoA. 2. Estudi de les modificacions posttraduccionals de la proteïna AACS humana.L'anàlisi de la seqüència aminoacídica de la proteïna AACS humana revela la presència de diversos residus de lisina com a putatius llocs d'acetilació. La substitució de la Lys634 per Arg provoca una disminució de l'estat d'acetilació de la proteïna però no l'aboleix totalment. Mitjançant la deleció de l'extrem COOH-terminal hem pogut concloure que aquesta regió és determinant per a l'estat d'acetilació, encara que no es pot descartar la possibilitat d'altres residus de lisina acetilables en l'extrem NH2-terminal.3. Aportació al procés de la colesterogènesi del gen AACS humà.S'ha analitzat l'efecte de la sobreexpressió de la proteïna AACS humana en el procés de la colesterogènesi, mitjançant la generació d'un sistema induïble BDTMTet-On Gene Expression system en cèl·lules HeLa. L'acetoacetil-CoA, fruit de la reacció catalitzada per l'AACS, és incorporat de manera preferencial cap a la síntesi de colesterol, implicant que l'esquelet de quatre carbonis de l'acetoacetat o bé la seva forma activa, l'acetoacetil-CoA, no s'equilibra completament amb el pool de dos carbonis representat per l'acetat i l'acetil-CoA. Una de les hipòtesis que explicarien aquest fet és la possible existència d'interaccions (channeling) entre els primers enzims de la via de la colesterogènesi, és a dir, entre l'AACS i l'HMGCS1. No obstant això, els nostres experiments mostren que ambdues proteïnes no interaccionen ni de manera directa ni indirecta.4. Estudi dels mecanismes de regulació transcripcional del gen AACS humà.Hem caracteritzat els elements necessaris per a que es produeixi l'activitat basal del gen AACS humà i hem estudiar la seva regulació transcripcional per factors de transcripció implicats en l'homeòstasi lipídica: LXR, SREBPs i PPAR. Els nostres resultats mostren que l'Inr és funcional, i que les caixes GC presents en el promotor proximal del gen AACS uneixen el factor de transcripció Sp1, important en la mediació de l'activitat basal d'aquest promotor. Els putatius LXRE i SRE, localitzants en el promotor in silico, no són funcionals. En canvi, PPARregula l'expressió del gen AACS d'una manera no canònica a través de la proteïna Sp1 i mitjançant la interacció amb les caixes GC. 5. Regulació de l'expressió del gen AACS de rata en diferents situacions fisiològiques: ritme circadiari.L'expressió del gen AACS està sotmesa a regulació circadiària, produint-se el zenit d'expressió en fetge i en TAB a l'inici de la fase fosca, coincidint amb el període de màxima activitat dels rosegadors. El patró d'expressió del factor de transcripció SREBP-1 i de l'AACS en fetge és paral·lel, suggerint que SREBP-1c podria ser responsable de mitjançar la regulació de l'expressió de l'AACS en aquest òrgan en les situacions fisiològiques estudiades: dejuni/realimentació en les fases diürna i nocturna, i administració d'insulina. / Acetoacetyl-CoA synthetase (AACS, acetoacetate-CoA ligase, EC 6.2.1.16) is a cytosolic ketone body (acetoacetate)-specific ligase found in several lipogenic tissues that might play an important role in the provision of Acetyl-CoA units for lipogenesis. Transfer of acetyl as acetoacetate, from the mitochondria to the cytosol, would operate in parallel with transfer via citrate and ATP-citrate lyase.1. Kinetic parameters of the human AACS.The KM values for acetoacetate, ATP and CoA were 37.6 M, 155.24 M, and 2.3 M respectively. CoA exerts an inhibitory effect when concentration raised over 15 M.2. Study of the posttranslational protein modification of human AACS.Sequence analysis of human AACS protein shows the presence of multiple lysine residues as a target of acetylation modification. The invariant lysine of the PX4GK domain, is not relevant for total levels of human AACS acetylation because the mutation of Lys-633 to arginine, did not abrogate the reactivity with the α-acetyl-lysine antibody. However the replacement of Lys-634 with arginine yielded a decrease in the acetylation status of human AACS protein. 3. Human AACS and cholesterogenesis.We studied the effect of human AACS overexpression in HeLa cells using the BDTMTet-On Gene Expression system. As previosly reported, acetoacetate is used preferentially for cholesterol biosynthesis although we couldn't observe a substrate channeling in the early steps of cholesterogenesis.4. Study of the mechanisms of transcriptional regulation of human AACS gene.We isolated the human AACS promoter, characterized the elements required to initiate transcription and analyzed the expression of the gene in response to LXR, SREBPs and PPAR, all known important factors for lipidic homeostasis. We show that the human AACS promoter contains an Inr sequence and several GC boxes that are determinant for its basal activity. We also show that PPAR transcriptionally induces the expression of the AACS gene by a non-canonical mechanism, since it is recruited to the AACS promoter by direct interaction with Sp1. 5. Circadian rhythm.AACS transcriptional regulation is under the control of circadian rhythm in liver and BAT but not in brain. Our results suggest that circadian expression in liver is driven by the rhytmic expression of SREBP-1c.

Els microsat el lits s on seq u encies d'ADN formades per repeticions en t andem de motius curts. Les curtes seq u encies repetides en t andem s on ubiq ues en els genomes dels eucariotes, tant en les regions codi cants com en les regions no codi cants. Aquestes seq u encies tenen un nivell molt elevat de polimor sme i de diverg encia interespec ca. Hem investigat si les dades obtingudes mitjan cant la seq uenciaci o de nova generaci o del Projecte Pilot dels 1000 Genomes s on utils per quanti car la variabilitat dels microsat el lits en les poblacions humanes i per descobrir nous loci hipot eticament implicats en malalties causades per l'expansi o de repeticions de trinucle otids. Hem analitzat la conservaci o ologen etica dels microsat el lits per entendre el rol que juga la selecci o en l'evoluci o dels microsat el lits. El primer estudi conclou que en els llinatges dels vertebrats, les repeticions en t andem d'amino acids estan m es conservades que altres seq u encies similars localitzades a les regions no codi cants. Aix o ens porta a concloure que l'evoluci o ha mantingut les repeticions a les regions codi cants de les prote nes. En una segona fase hem analitzat la conservaci o dels microsat el lits en diferents regions gen omiques, comparant-les amb la conservaci o dels microsat el lits a les regions interg eniques. Concloem que la selecci o no mant e nom es els microsat el lits als exons, sin o que tamb e a altres regions gen omiques. / Microsatellites are DNA sequences formed by tandem repetition of short motifs. Short sequence tandem repeats are ubiquitous in eukaryotic genomes both in coding and non-coding regions. They show a very high level of polymophism and interspeci c divergence. We investigated the use of next generation sequencing data, from the 1000 Genomes Pilot Prjects, to quantify microsatellite variability in the human population and discover putative new loci involved in trinucleotide repeat expansion diseases. We analysed microsatellites phylogenetic conservation to learn about the role of selection in shaping microsatellite evolution. The rst study con- cluded that in vertebrate lineages amino acid tandem repeats were more conserved than similar sequences located in non-coding regions. This lead us to the conclusion that evolution was preserving repeats in protein-coding regions. In a second stage we analzed the conservation of microsatellites in di erent genomic regions, comparing them with the of microsatellite in inter- genic region. We concluded that selection was not preserving microsatellites only in exons but also in other genomic regions. 1

In the last decade, molecular biology has expanded from a reductionist view to a systems-wide view that tries to unravel the complex interactions of cellular components. Owing to the emergence of high-throughput technology it is now possible to interrogate entire genomes at an unprecedented resolution. The dimension and unstructured nature of these data made it evident that new methodologies and tools are needed to turn data into biological knowledge. To contribute to this challenge we exploited the wealth of publicly available high-throughput genomics data and developed bioinformatics methodologies focused on extracting information at the pathway rather than the single gene level. First, we developed Gene Set Variation Analysis (GSVA), a method that facilitates the organization and condensation of gene expression profiles into gene sets. GSVA enables pathway-centric downstream analyses of microarray and RNA-seq gene expression data. The method estimates sample-wise pathway variation over a population and allows for the integration of heterogeneous biological data sources with pathway-level expression measurements. To illustrate the features of GSVA, we applied it to several use-cases employing different data types and addressing biological questions. GSVA is made available as an R package within the Bioconductor project. Secondly, we developed a pathway-centric genome-based strategy to reposition drugs in type 2 diabetes (T2D). This strategy consists of two steps, first a regulatory network is constructed that is used to identify disease driving modules and then these modules are searched for compounds that might target them. Our strategy is motivated by the observation that disease genes tend to group together in the same neighborhood forming disease modules and that multiple genes might have to be targeted simultaneously to attain an effect on the pathophenotype. To find potential compounds, we used compound exposed genomics data deposited in public databases. We collected about 20,000 samples that have been exposed to about 1,800 compounds. Gene expression can be seen as an intermediate phenotype reflecting underlying dysregulatory pathways in a disease. Hence, genes contained in the disease modules that elicit similar transcriptional responses upon compound exposure are assumed to have a potential therapeutic effect. We applied the strategy to gene expression data of human islets from diabetic and healthy individuals and identified four potential compounds, methimazole, pantoprazole, bitter orange extract and torcetrapib that might have a positive effect on insulin secretion. This is the first time a regulatory network of human islets has been used to reposition compounds for T2D. In conclusion, this thesis contributes with two pathway-centric approaches to important bioinformatic problems, such as the assessment of biological function and in silico drug repositioning. These contributions demonstrate the central role of pathway-based analyses in interpreting high-throughput genomics data. / En l'última dècada, la biologia molecular ha evolucionat des d'una perspectiva reduccionista cap a una perspectiva a nivell de sistemes que intenta desxifrar les complexes interaccions entre els components cel•lulars. Amb l'aparició de les tecnologies d'alt rendiment actualment és possible interrogar genomes sencers amb una resolució sense precedents. La dimensió i la naturalesa desestructurada d'aquestes dades ha posat de manifest la necessitat de desenvolupar noves eines i metodologies per a convertir aquestes dades en coneixement biològic. Per contribuir a aquest repte hem explotat l'abundància de dades genòmiques procedents d'instruments d'alt rendiment i disponibles públicament, i hem desenvolupat mètodes bioinformàtics focalitzats en l'extracció d'informació a nivell de via molecular en comptes de fer-ho al nivell individual de cada gen. En primer lloc, hem desenvolupat GSVA (Gene Set Variation Analysis), un mètode que facilita l'organització i la condensació de perfils d'expressió dels gens en conjunts. GSVA possibilita anàlisis posteriors en termes de vies moleculars amb dades d'expressió gènica provinents de microarrays i RNA-seq. Aquest mètode estima la variació de les vies moleculars a través d'una població de mostres i permet la integració de fonts heterogènies de dades biològiques amb mesures d'expressió a nivell de via molecular. Per il•lustrar les característiques de GSVA, l'hem aplicat a diversos casos usant diferents tipus de dades i adreçant qüestions biològiques. GSVA està disponible com a paquet de programari lliure per R dins el projecte Bioconductor. En segon lloc, hem desenvolupat una estratègia centrada en vies moleculars basada en el genoma per reposicionar fàrmacs per la diabetis tipus 2 (T2D). Aquesta estratègia consisteix en dues fases: primer es construeix una xarxa reguladora que s'utilitza per identificar mòduls de regulació gènica que condueixen a la malaltia; després, a partir d'aquests mòduls es busquen compostos que els podrien afectar. La nostra estratègia ve motivada per l'observació que els gens que provoquen una malaltia tendeixen a agrupar-se, formant mòduls patogènics, i pel fet que podria caldre una actuació simultània sobre múltiples gens per assolir un efecte en el fenotipus de la malaltia. Per trobar compostos potencials, hem usat dades genòmiques exposades a compostos dipositades en bases de dades públiques. Hem recollit unes 20.000 mostres que han estat exposades a uns 1.800 compostos. L'expressió gènica es pot interpretar com un fenotip intermedi que reflecteix les vies moleculars desregulades subjacents a una malaltia. Per tant, considerem que els gens d'un mòdul patològic que responen, a nivell transcripcional, d'una manera similar a l'exposició del medicament tenen potencialment un efecte terapèutic. Hem aplicat aquesta estratègia a dades d'expressió gènica en illots pancreàtics humans corresponents a individus sans i diabètics, i hem identificat quatre compostos potencials (methimazole, pantoprazole, extracte de taronja amarga i torcetrapib) que podrien tenir un efecte positiu sobre la secreció de la insulina. Aquest és el primer cop que una xarxa reguladora d'illots pancreàtics humans s'ha utilitzat per reposicionar compostos per a T2D. En conclusió, aquesta tesi aporta dos enfocaments diferents en termes de vies moleculars a problemes bioinformàtics importants, com ho son el contrast de la funció biològica i el reposicionament de fàrmacs "in silico". Aquestes contribucions demostren el paper central de les anàlisis basades en vies moleculars a l'hora d'interpretar dades genòmiques procedents d'instruments d'alt rendiment.

Mechanisms underlying congenital malformations are largely unknown despite its high incidence, affecting 2-3% of liveborn infants. A broader knowledge about the causes of birth defects would provide valuable information regarding the outcome and prognosis of the anomaly, the development and establishment of diagnostic protocols, the design of therapeutic strategies and genetic counseling to the family. Different approaches have been used in the present thesis regarding technologies and model diseases to elucidate the contribution of genetic and epigenetic alterations in the etiopathogenesis of congenital malformations. Copy number variations, methylation patterns, as well as point mutations have been explored. Moreover, a study to analyze genetic counseling in relation to one of the new molecular techniques used has been performed. Obtained data reveal a relevant role of genetic and epigenetic alterations in congenital malformations, in some cases as a unique cause to explain the disease and in others as part of an oligogenic or multifactorial model. / Els mecanismes causants de les malformacions congènites són poc coneguts malgrat l’elevada incidència d’aquestes patologies, que afecten el 2-3% de recent nascuts. Un coneixement més ampli de les causes de les anomalies congènites proporcionaria informació rellevant pel que fa al pronòstic de l’anomalia, el desenvolupament i establiment de protocols diagnòstics, el disseny d’estratègies terapèutiques, així com l’assessorament genètic a la família. En la tesi que es presenta s’han utilitzat diferents estratègies, pel que fa a tecnologies i models de malalties, amb l’objectiu d’esbrinar la contribució d’alteracions genètiques i epigenètiques en l’etiopatogènia de les malformacions congènites. S’han analitzat variacions en número de còpia, patrons de metilació, així com mutacions puntuals. D’altra banda, també s’ha realitzat un estudi per aprofundir en l’assessorament genètic en relació a una de les noves tècniques moleculars utilitzades. Els resultats obtinguts indiquen que les altercacions genètiques i epigenètiques tenen una contribució molt rellevant en l’etiologia de les malformacions congènites, en alguns casos com a causa única de la malaltia i en altres com a component d’un model oligogènic o multifactorial.