Die Welpensterblichkeit wird auf 10-20 % der lebend geborenen Welpen geschätzt. Zwei Virusinfektionen scheinen bei Welpensterblichkeit und Fruchtbarkeitsstörungen des Hundes eine wesentliche Rolle zu spielen: das canine Herpesvirus Typ 1 (CHV-1) und das Canine Minute Virus (CnMV, synonym Minute Virus of Canines). Ziel der Arbeit war es, die Verbreitung dieser beiden Viren unter Zuchthunden in Deutschland zu untersuchen. Das klinische Erkrankungsbild ist bei beiden Viren ähnlich. Bei erwachsenen Tieren verläuft die Infektion meist unauffällig. Infektionen während der Trächtigkeit können zu Fruchtresorption, Aborten, Missbildungen und Welpensterblichkeit führen. Infizierte Welpen erkranken meist in den ersten drei Lebenswochen und sind apathisch, zeigen Saugunlust, haben Atemwegsprobleme, Erbrechen und leiden oft auch unter Durchfall. Die Mortalität ist hoch. Zwischen Juli 2004 und Oktober 2005 wurden 429 Serumproben gesammelt. Die Bestimmung der Seroprävalenz von CHV-1 erfolgt im Serumneutralisationstest (SNT) mit Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen ohne den Zusatz von Komplement. CnMV-spezifische Antikörper wurden mittels indirekter Immunofluoreszenz (IFT) auf zuvor mit CnMV infizierten Walter Reed Canine Zellen (WRCC) nachgewiesen. Des Weiteren wurden 37 Abstriche, 34 Spermaproben, 16 Kotproben und 37 verstorbene Welpen aus 14 Würfen mittels PCR und Virusisolierung auf CHV-1 und CnMV direkt untersucht. 27,7 % (119/429) aller Serumproben hatten neutralisierende Antikörper gegen CHV-1. Die Seroprävalenz für CnMV beträgt 5,6 % (24/429). Die statistische Auswertung ergab nur für das Geschlecht einen signifikanten Einfluss auf den Serostatus von CHV-1. Alter, Zwingergröße, Anzahl Ausstellungsbesuche und Rasse spielten keine Rolle für die Seroprävalenz von CHV-1. Bei den klinischen Vorberichten Welpensterblichkeit (n = 24) und Fruchtresorptionen (n = 5) ist die Seroprävalenz von CHV-1 mit 37,5 % und 40 % bedeutend höher als die ermittelte Gesamtprävalenz von 27,7 %. Die Untersuchung der Abstriche, Sperma-, Kot- und Organproben von verstorbenen Welpen mittels PCR und zum Teil Virusisolierung auf CnMV und CHV-1 verlief in allen Fällen mit negativem Ergebnis. Der Nachweis von CnMV ist bis heute nur in wenigen Speziallabors möglich. Um die Nachweismöglichkeiten von CnMV zu verbessern und zu vereinfachen, wurde das Virusprotein-2-(VP2)-Gen von CnMV in den Vektor pET22b(+) kloniert. Das am C-terminalen Ende mit einem 6x His-Tag markierte Protein wurde im E.coli-Stamm BL21CodonPlus(DE3)RIL exprimiert, aufgereinigt und als Antigen im ELISA getestet. Die prokaryotische Genexpression des VP2 von CnMV ist für die Etablierung eines diagnostischen ELISA nicht geeignet. Während der Expression aggregierte das Protein zu unlöslichen Inclusion Bodies. Nach Aufreinigung ist das Protein immer noch mit E.coli-Proteinen kontaminiert. Im ELISA zeigte sich das rekombinante Antigen wenig spezifisch. In Fällen von Welpensterblichkeit (n = 14), waren diese in weit weniger Fällen als vermutet CHV-1 oder CnMV bedingt. Insgesamt scheint CnMV in Deutschland weit weniger verbreitet zu sein als in anderen Ländern der Welt.

Die Welpensterblichkeit wird auf 10-20 % der lebend geborenen Welpen geschätzt. Zwei Virusinfektionen scheinen bei Welpensterblichkeit und Fruchtbarkeitsstörungen des Hundes eine wesentliche Rolle zu spielen: das canine Herpesvirus Typ 1 (CHV-1) und das Canine Minute Virus (CnMV, synonym Minute Virus of Canines). Ziel der Arbeit war es, die Verbreitung dieser beiden Viren unter Zuchthunden in Deutschland zu untersuchen. Das klinische Erkrankungsbild ist bei beiden Viren ähnlich. Bei erwachsenen Tieren verläuft die Infektion meist unauffällig. Infektionen während der Trächtigkeit können zu Fruchtresorption, Aborten, Missbildungen und Welpensterblichkeit führen. Infizierte Welpen erkranken meist in den ersten drei Lebenswochen und sind apathisch, zeigen Saugunlust, haben Atemwegsprobleme, Erbrechen und leiden oft auch unter Durchfall. Die Mortalität ist hoch. Zwischen Juli 2004 und Oktober 2005 wurden 429 Serumproben gesammelt. Die Bestimmung der Seroprävalenz von CHV-1 erfolgt im Serumneutralisationstest (SNT) mit Madin Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen ohne den Zusatz von Komplement. CnMV-spezifische Antikörper wurden mittels indirekter Immunofluoreszenz (IFT) auf zuvor mit CnMV infizierten Walter Reed Canine Zellen (WRCC) nachgewiesen. Des Weiteren wurden 37 Abstriche, 34 Spermaproben, 16 Kotproben und 37 verstorbene Welpen aus 14 Würfen mittels PCR und Virusisolierung auf CHV-1 und CnMV direkt untersucht. 27,7 % (119/429) aller Serumproben hatten neutralisierende Antikörper gegen CHV-1. Die Seroprävalenz für CnMV beträgt 5,6 % (24/429). Die statistische Auswertung ergab nur für das Geschlecht einen signifikanten Einfluss auf den Serostatus von CHV-1. Alter, Zwingergröße, Anzahl Ausstellungsbesuche und Rasse spielten keine Rolle für die Seroprävalenz von CHV-1. Bei den klinischen Vorberichten Welpensterblichkeit (n = 24) und Fruchtresorptionen (n = 5) ist die Seroprävalenz von CHV-1 mit 37,5 % und 40 % bedeutend höher als die ermittelte Gesamtprävalenz von 27,7 %. Die Untersuchung der Abstriche, Sperma-, Kot- und Organproben von verstorbenen Welpen mittels PCR und zum Teil Virusisolierung auf CnMV und CHV-1 verlief in allen Fällen mit negativem Ergebnis. Der Nachweis von CnMV ist bis heute nur in wenigen Speziallabors möglich. Um die Nachweismöglichkeiten von CnMV zu verbessern und zu vereinfachen, wurde das Virusprotein-2-(VP2)-Gen von CnMV in den Vektor pET22b(+) kloniert. Das am C-terminalen Ende mit einem 6x His-Tag markierte Protein wurde im E.coli-Stamm BL21CodonPlus(DE3)RIL exprimiert, aufgereinigt und als Antigen im ELISA getestet. Die prokaryotische Genexpression des VP2 von CnMV ist für die Etablierung eines diagnostischen ELISA nicht geeignet. Während der Expression aggregierte das Protein zu unlöslichen Inclusion Bodies. Nach Aufreinigung ist das Protein immer noch mit E.coli-Proteinen kontaminiert. Im ELISA zeigte sich das rekombinante Antigen wenig spezifisch. In Fällen von Welpensterblichkeit (n = 14), waren diese in weit weniger Fällen als vermutet CHV-1 oder CnMV bedingt. Insgesamt scheint CnMV in Deutschland weit weniger verbreitet zu sein als in anderen Ländern der Welt.

Die Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) ist die medizinisch wichtigste durch Zecken übertragene virale Erkrankung des Menschen in Europa und Asien, welche jährlich 10.000 – 15.000 humane Fälle auf beiden Kontinenten verursacht. Das Verbreitungsgebiet der FSME erstreckt sich von Japan bis Frankreich. Das FSME-Virus zirkuliert in Mikrofoki, zwischen Zecken als natürlichen Vektoren und Säugetierwirten, insbesondere Nagetieren wie der Rötelmaus (Clethrionomys glareolus) und der Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis). Der Mensch infiziert sich mit dem FSME-Virus durch einen Zeckenstich, durch den Verzehr von infizierter Rohmilch oder entsprechenden Milchprodukten und in selten Fällen durch Organtransplantationen oder Muttermilch. Die große Bedeutung von Nagetieren als Teil des FSME-Übertragungszyklus wurde in den vergangenen Jahrzehnten bestätigt. Jedoch gibt es immer noch Wissenslücken über die Dynamik der FSME-Virusinfektion in Nagetierpopulationen in natürlichen FSME-Mikrofoki. Ziel der Studie war es deshalb, in bekannten FSME-Naturherden saisonale und zwischenjährliche Dynamiken des Virus bei wilden Nagetieren festzustellen und einen möglichen Einfluss von demographischen Wirtsfaktoren für eine FSME-Virusinfektion auf individueller Basis herauszufinden. Die Studie wurde in zwei gut untersuchten FSME-Naturherden in Haselmühl und Heselbach in der Oberpfalz, Bayern, durchgeführt. Nagetiere der Arten C. glareolus und A. flavicollis wurden von März bis Oktober 2019 bis 2022 einmal pro Monat für zwei aufeinanderfolgende Nächte in 50 Lebendfallen pro Standort gefangen, mit Isofluran anästhesiert und mit einem Transponder markiert. Anschließend wurde eine Blutprobe entnommen und das Serum auf Antikörper gegen das FSME-Virus mit einem indirekten Immunfluoreszenz-Test (IIFT) untersucht. Danach wurden die Tiere am Fangort wieder ausgesetzt. Sobald ein Nagetier in drei verschiedenen Monaten gefangen wurde, erfolgte die Euthanasie und die Entnahme einer Thoraxspülprobe, die ebenfalls serologisch mittels IIFT untersucht wurde. Die Konfidenzintervalle (95 % KI) für die Prävalenz von Antikörpern gegen das FSME-Virus in den Nagetieren, wurden mit der Methode nach Clopper und Pearson in GraphPad-Software errechnet. Der Einfluss individueller Charakteristika der Nagetiere sowie Jahr des Fangs, Jahreszeit und Standort wurden in einem linear gemischten Model mit des lme4 Pakets in R-Software berechnet. In der Studie konnten insgesamt 706 Fänge von 500 Individuen dokumentiert werden, von denen 651 Proben von 478 Individuen (338 C. glareolus; 140 A. flavicollis) serologisch untersucht wurden. Es konnte eine Gesamtprävalenz von 16,9 % (95 % KI: 14,2 – 20,0) ermittelt werden. Rötelmäuse (19,4 %) waren häufiger betroffen als Gelbhalsmäuse (10,5 %). Der Anteil der Seropositivität unterschied sich zwischen den Jahren nicht signifikant und lag zwischen 11,8 % im Jahr 2021 und 19,2 % im Jahr 2020. Die Jahreszeiten Frühling (23,6 %), Sommer (20,2 %) und Herbst (10,8 %) hatten keinen Einfluss auf die Infektionswahrscheinlichkeit der Nagetiere. Auch zwischen den Standorten Haselmühl (15,7 %) und Heselbach (17,8 %) gab es keine Unterschiede in der Prävalenz. Die Seropositivität der Geschlechter unterschied sich signifikant zwischen weiblichen (18,5 %) und männlichen A. flavicollis (7,1 %). Bei C. glareolus wurde bei den Männchen (40,4 %) ein signifikant höherer Anteil an Seropositivität beobachtet als bei den Weibchen (15,6 %). Adulte A. flavicollis (12,0 %) wiesen eine signifikant höhere Seroprävalenz auf als Juvenile (3,2 %), ebenso wie bei adulten C. glareolus (25,4 %) und Juvenilen (9,8 %). Unabhängig von saisonalen oder jährlichen Schwankungen wurden FSME-Virus-Antikörper mit einer Prävalenzrate von 16,9 % nachgewiesen. Männliche erwachsene Rötelmäuse waren in unserer Studie häufiger mit dem FSME-Virus infiziert. Gelbhalsmäuse spielen als Wirte im FSME-Viruszyklus wahrscheinlich eine untergeordnete Rolle.

Einleitung: Toxoplasma gondii stellt einen der weltweit häufigsten, ubiquitär vorkommenden, alimentär übertragbaren Krankheitserreger dar. Der Verzehr von nicht ausreichend erhitztem Fleisch und Fleischerzeugnissen, welche infektiöse Stadien des Protozoen enthalten, erwies sich als eine der bedeutendsten Infektionsquellen für den Menschen. Waschbären (Procyon lotor) gelten in Deutschland als invasive Art. Aufgrund der steigenden Jagdstrecke in den letzten Jahrzehnten wird neben der Pelzproduktion auch die Verwendung des Fleisches als Wildbret zunehmend attraktiv. Gegenwärtig gibt es nur wenige Daten zur Erregerlast von T. gondii in für den humanen Konsum relevanten Gewebeteilen bei Waschbären, ferner zur Durchseuchungsrate der Waschbären in Deutschland und assoziierten Risikofaktoren. Ziele der Studie: In dieser Arbeit sollten die Seroprävalenz von T. gondii bei Waschbären in Deutschland sowie damit assoziierte Risikofaktoren ermittelt werden. Die für den menschlichen Verzehr relevanten Fleischteile sollten ergänzend dazu direkt molekularbiologisch untersucht werden, um qualitative und quantitative Ergebnisse zum Vorkommen von T.-gondii-Stadien in ebendiesem Gewebe zu erhalten. Schlussendlich sollten diese Daten als Beitrag zur Risikoabschätzung einer Toxoplasma-gondii-Infektion des Menschen durch den Verzehr des Fleisches von wildlebenden Waschbären aus Deutschland zur Verfügung gestellt werden. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Studie wurden Proben von 820 wildlebenden Waschbären, die von Dezember 2017 bis April 2021 erlegt wurden, untersucht. Das Erlegungsdatum, die Herkunftspostleitzahl, Alter, Geschlecht und Gewicht der Tiere wurden jeweils erfasst. Von den Tieren wurden Kopf, Zwerchfell, Vorder- und Hintergliedmaße entnommen, um Fleischsaft durch Auftauen zu generieren. Mittels kommerziellen ELISAs (Enzyme‐Linked Immunosorbent Assay) wurden T.-gondii-spezifische Antikörper im Fleischsaft nachgewiesen und Risikofaktoren, basierend auf den zugrundeliegenden tierassoziierten Daten, ermittelt. Auf Grundlage der serologischen Ergebnisse wurde das Fleisch der Gliedmaßen von 50 negativen, 50 niedrigpositiven und 50 hochpositiven Proben mittels magnetic-capture Polymerase Chain Reaction (PCR) quantitativ untersucht. Zur Untersuchung der Prävalenz-Unterschiede für die einzelnen Risikofaktoren, wurden Chi-Quadrat-Tests durchgeführt. Für das Gewicht wurde eine einfache logistische Regression angewandt. Ergebnisse: Bei 48,5 % (398/820; 95 % Konfidenzintervall KI: 45,1-52,0) der untersuchten Waschbären wurden T.-gondii-spezifische Antikörper nachgewiesen. Weitere 48,5 % der Proben waren negativ und 2,9 % (47/820; 95 % KI: 2,0-4,3) fraglich. Statistisch signifikante Unterschiede wurden für die Faktoren Geschlecht (p = 0,028), Saison (p < 0,0003) und Gewicht (odds ratio: 1,783; 95 % KI: 1,513-2,108; p < 0,0001) festgestellt. Rüden waren häufiger seropositiv als Fähen, im Spätwinter/Frühling erlegte Tiere waren häufiger seropositiv als im Herbst erlegte Tiere und je schwerer die Tiere waren, umso höher war die Chance eines positiven Antikörper-Nachweises. Bei 56 der untersuchten 150 Waschbärenfleischproben wurde T.-gondii-DNA (Deoxyribonucleic Acid) nachgewiesen. Davon gehörten 18 Tiere der serologisch niedrigpositiven Gruppe und 38 Tiere der serologisch hochpositiven Gruppe an. In den Proben der seronegativen Tiere wurde keine T.-gondii-DNA detektiert. In der serologisch hochpositiven Gruppe gab es statistisch signifikant mehr positive Proben (p < 0,0001) und es wurden statistisch signifikant höhere Werte der DNA-Äquivalente (p < 0,0001) pro 100 g Waschbärenfleisch nachgewiesen als bei den serologisch Niedrigpositiven. Schlussfolgerung: Waschbären in Deutschland sind stark mit T. gondii befallen. Bei Handling und Verzehr von Waschbärenfleisch besteht daher grundsätzlich ein potenzielles humanes Gesundheitsrisiko. Das Fleisch sollte vor dem Verzehr ausreichend durcherhitzt werden. Jedoch sind weitere Studien im Rahmen von Bioassay oder Zellkulturen nötig, um eine bessere Aussage über die Infektiosität treffen zu können.:Inhalt Seite 1 Einleitung ............................................................................................................. 1 2 Literaturübersicht ................................................................................................. 3 2.1 Lebenszyklus und Parasitenstadien von Toxoplasma gondii ............................. 3 2.2 Toxoplasmose beim Menschen .......................................................................... 7 2.2.1 Klinische Manifestation ................................................................................... 7 2.2.2 Risikofaktoren ................................................................................................ 8 2.2.3 Seroprävalenz .............................................................................................. 10 2.3 Toxoplasmose beim Tier .................................................................................. 12 2.3.1 Klinische Manifestation ................................................................................. 12 2.3.2 Prävalenz in verschiedenen Tierarten .......................................................... 12 2.3.3 Toxoplasmose bei Waschbären .................................................................... 14 2.4 T. gondii in Lebensmitteln ................................................................................ 16 2.4.1 Vorkommen in Lebensmitteln ....................................................................... 16 2.4.2 Prävention und Inaktivierung von T. gondii ................................................... 17 2.5 Diagnostik ....................................................................................................... 20 2.5.1 Serodiagnostik ............................................................................................. 21 2.5.2 Molekulardiagnostik ..................................................................................... 22 3 Publikationen ..................................................................................................... 25 3.1 Publikation 1 ................................................................................................... 25 3.2 Publikation 2 ................................................................................................... 35 4 Diskussion .......................................................................................................... 43 5 Zusammenfassung.............................................................................................. 50 6 Summary ............................................................................................................ 52 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 54 8 Danksagung ....................................................................................................... 68

In Regionen, in denen verschiedene Flaviviren zirkulieren, wird die Diagnostik des West-Nil-Virus (WNV) oft durch Kreuzreaktionen erschwert. Einer dieser Staaten ist der Sudan, in welchem neben dem WNV auch Dengue-Viren (DENV) endemisch sind. Ziel dieser Arbeit war es, die WNV-Seroprävalenz im Sudan unter Ausschluss von Kreuzreaktionen mit Dengue-Viren oder dem Zika-Virus zu ermitteln. Zudem sollte bei Probanden mit früherer DENV-Infektion der Anteil an WNV-neutralisierenden Seren bestimmt werden. Serumproben von Patienten mit Fieber aus den sudanesischen Regionen Kassala, Nord-Kordofan und Red Sea State wurden vor Beginn dieser Arbeit mittels ELISA auf DENV-Antikörper untersucht. Seren ohne DENV-Antikörper (N = 106) und eine mit den Probanden dieser Gruppe hinsichtlich Herkunft, Alter und Geschlecht übereinstimmende zweite Personengruppe mit DENV-Antikörpern (N = 108) wurden ausgewählt. In allen Serumproben wurden mittels Mikroneutralisationstest sowohl die Häufigkeit WNV-neutralisierender Antikörper als auch deren Titer bestimmt. In der Gruppe der Seren ohne DENV-Antikörper neutralisierten 30,2% das WNV. Diese wurden in weiteren Neutralisationstests auf DENV- und ZIKV-neutralisierende Antikörper untersucht. 18,9% dieser Serumproben wiesen ausschließlich Antikörper gegen das WNV auf, sodass die ermittelte Seroprävalenz zwischen 18,9% und 30,2% lag. Die Seroprävalenz stieg mit zunehmendem Alter der Testpersonen an. Männer und Frauen waren gleichermaßen betroffen. Der Anteil der DENV-positiven Seren, die das WNV neutralisierten, betrug 83,3%. Diese Seren zeigten höhere WNV-Neutralisationstiter als die DENV-negativen Proben. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass ein erheblicher Anteil der Probanden eine serologisch nachgewiesene WNV-Infektion hatte. Im Vergleich dazu wies die große Mehrheit der Personen mit zurückliegender DENV-Infektion WNV-neutralisierende Antikörper auf. Es sind weitere Studien erforderlich, um klinische Fälle von WNV-Infektionen zu identifizieren und um herauszufinden, ob Personen mit kreuzneutralisierenden Antikörpern vor WNV-Infektionen geschützt sind.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Charakterisierung, Verwandtschaft und Übertragung des West Nil Virus 1.2 Klinische Symptomatik einer West-Nil-Virus-Infektion 1.3 Verbreitung und Ausbrüche 1.4 Situation im Sudan 1.5 Serologische Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 2 Aufgabenstellung 3 Materialien und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien 3.1.2 Enzyme und Farbstoffe 3.1.3 Nährmedien 3.1.4 Puffer 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Kits 3.1.7 Virusstämme 3.1.8 Zellen 3.1.9 Patientenproben 3.1.10 Software und Programme 3.1.11 Technische Geräte und Materialien 3.2 Methoden 3.2.1 Kriterien zur Auswahl der Probanden 3.2.2 Zellkultivierung 3.2.3 Zellzählung 3.2.4 Mikroneutralisationstest 3.2.4.1 Screening 3.2.4.2 Antikörpertiter-Test 3.2.4.3 Interpretation 3.2.5 ELISA zum Nachweis Virus-infizierter Zellen 3.2.6 Bewertung der Ergebnisse 3.3 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl der Seren 4.2 Anteil der WNV-NT-positiven Probanden 4.3 Anteil der DENV- und ZIKV-NT-positiven Probanden 4.4 Vergleich der WNV-Seroprävalenz in Gruppe 1 und Gruppe 2 4.5 Charakteristika der WNV-NT-positiven Probanden 4.6 WNV-Antikörpertiter 5 Diskussion 5.1 Seroprävalenz des West-Nil-Virus 5.2 Assoziation zwischen zurückliegenden DENV-Infektionen und WNV-neutralisierenden Antikörpern 5.3 Häufigkeit von WNV-Infektionen in Kassala und Nord-Kordofan 5.4 Zusammenhang zwischen dem Alter und Geschlecht der Probanden und dem Anteil WNV-neutralisierender Antikörper 5.5 Methodenbeurteilung 5.6 Bedeutung der Untersuchungsergebnisse 6 Zusammenfassung der Arbeit 7 Literaturverzeichnis 8 Abbildungsverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis 10 Formelverzeichnis 11 Selbstständigkeitserklärung 12 Lebenslauf 13 Danksagung

Einleitung: Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein Arbovirus (engl.: arthropod-borne virus) aus der Familie der Flaviviridae. Vorrangig wird das WNV in einem Vogel-Stechmücken-Vogel-Zyklus übertragen, allerdings können auch Pferde und Menschen als Fehlwirte infiziert werden (CHANCEY et al. 2015). Bei etwa 8–10 % der infizierten Equiden kommt es zum Auftreten neurologischer Symptome mit teils schweren und fatalen Krankheitsverläufen (BUNNING et al. 2004). Im Jahr 2018 wurden die ersten zwei equinen WNV-Infektionen in Deutschland nachgewiesen (ZIEGLER et al. 2019). Alle seither gemeldeten equinen WNV-Infektionen konzentrieren sich auf den mitteldeutschen Raum (TSIS 2022). Informationen zur Seroprävalenz der WNV-Infektionen in der hiesigen Pferdepopulation existieren jedoch nicht. Ziele der Untersuchung: Anhand einer Querschnittsstudie sollte die Seroprävalenz equiner WNV-Infektionen in einem Gebiet mit erwarteter Viruszirkulation bestimmt werden. Darüber hinaus sollte die Seroprävalenz in Landkreisen mit gemeldeten equinen Infektionen (Fall-Landkreisen, LK) und solchen ohne bisher registrierte equine WNV-Infektionen (Kontroll-LK) verglichen werden. In einem zweiten Studienteil sollten anhand der Erhebung pferde- und betriebsspezifischer Daten sowie Informationen zum individuellen und betrieblichen Mückenmanagement Risikofaktoren für eine WNV-Infektion von Pferden in Mitteldeutschland ermittelt werden. Tiere, Material und Methoden: Im Jahr 2020 wurde ein Studiengebiet mit neun Landkreisen (LK) aus drei Bundesländern definiert. In sechs Fall-LK wurden in den Jahren 2018/2019 equine WNV-Infektionen registriert, während in drei Kontroll-LK keine registrierten Fälle vorlagen. Pferdehalter mit fünf und mehr gemeldeten Equiden wurden zur freiwilligen Teilnahme an der Studie eingeladen. Eingeschlossen wurden klinisch gesunde Pferde, die mindestens 12 Monate alt, nicht gegen das WNV geimpft und dauerhaft in der Region gehalten wurden. Alle Seren wurden in einem kompetitiven ELISA (cELISA) auf flavivirenspezifische Antikörper untersucht. Um akute Infektionen zu detektieren, wurden alle reaktiven Seren (positiv und fraglich) weiterhin auf das Vorliegen von IgM-Antikörper untersucht. Verifiziert wurden die cELISA-reaktiven Seren im Neutralisationstest (VNT). Analysiert wurde neben WNV auch das mit ihm serologisch eng verwandte Usutu-Virus (USUV) und das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV). Für die Risikofaktorenanalyse wurden epidemiologische Daten in Form eines Fragebogens für alle teilnehmenden Pferde erhoben und statistisch mittels Logistischer Regression ausgewertet. Ergebnisse: Zwischen September und November 2020 wurden 940 Pferde aus 127 Betrieben beprobt. Insgesamt 106 Seren waren im cELISA reaktiv; hiervon wurden bei sechs Pferden IgM-Antikörper festgestellt. Im VNT zeigten 54/106 Pferden neutralisierende Antikörper gegen das WNV, 35/106 Pferden Antikörper gegen das FSMEV und 8/106 Seren neutralisierten das USUV. Die WNV-Seroprävalenz lag auf Pferde-Ebene bei 5,8 % und auf Betriebsebene bei 21,3 %, In den Fall-LK war die Seroprävalenz mit 7,2 % signifikant höher als in den Kontroll-LK mit 2,7 %. Seropositive Pferde konnten in allen sechs Fall-LK, und in zwei der drei Kontroll-LK ermittelt werden. Das Regressionsmodell zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Seropositivität für sechs Variablen. Der Typus Pony und eine zunehmende WNV-Impfdichte im Betrieb verringerten die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität, während die Haltung in einem Fall-LK, 24h Zugang zum Auslauf, die Existenz eines Unterstandes im Auslauf und die Verwendung einer Fliegendecke die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität erhöhten. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse bestätigen eine WNV-Zirkulation in Mitteldeutschland mit einer Seroprävalenz von 5,8 % in der lokalen Pferdepopulation. Neben dem WNV zirkulieren mit FSMEV und USUV mindestens zwei weitere eng verwandte Flaviviren in der Region, wovon die durch das FMEV ausgelöste FSME als Differentialdiagnose für Erkrankungen mit neurologischen Erscheinungsformen in Betracht gezogen werden sollte. In Bezug auf die Risikofaktoren bleibt fraglich, ob Ponys einem reduzierten Risiko der Infektion unterliegen. Die Haltung in Landkreisen mit bereits registrierten equinen WNV-Infektionen sowie ein permanenter Zugang zum Auslauf in der insektenreichen Zeit von April bis November steigert das Risiko einer WNV-Infektion für Pferde.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das West-Nil-Virus 2.1.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.1.2 Übertragung 2.1.3 Epidemiologie 2.1.4 Pathogenese und Pathologie 2.1.5 Immunologie 2.1.6 Diagnostik 2.1.7 Klinische Symptomatik 2.1.8 Therapie und Prophylaxe 2.1.9 Tierseuchenrechtliche Regelung equiner WNV-Infektionen 2.2 Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus 2.2.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.2.2 Übertragung 2.2.3 Epidemiologie 2.2.4 Pathogenese und Immunologie 2.2.5 Diagnostik 2.2.6 Klinische Symptomatik 2.3 Das Usutu-Virus 2.3.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.3.2 Übertragung 2.3.3 Epidemiologie 2.3.4 Pathogenese und Immunologie 2.3.5 Diagnostik 2.3.6 Klinische Symptomatik 3 Ziele der Studie 4 Publikation 4.1 Stellungnahme zum Eigenanteil 4.2 Ergänzende Daten der Publikation 4.2.1 Tabelle 1: Beschreibung teilnehmender Betriebe 4.2.2 Tabelle 2: Deskriptive Statistik auf Pferde-Ebene 4.2.3 Tabelle 3: Laborergebnisse Serologie 4.2.4 Tabelle 4: Univariate Analyse 4.2.6 Tabelle 5: Logistische Regression 5 Diskussion 5.1 WNV-Seroprävalenz 5.1.1 Vergleich innerhalb Europas 5.1.2 Vergleich zwischen Fall- und Kontroll-Landkreisen 5.2 Verbreitung FSMEV 5.3 Verbreitung USUV 5.4 Risikofaktoren für WNV-Seropositivität 5.4.1 Typus 5.4.2 Landkreise 5.4.3 Haltungsform und die Existenz eines Unterstandes 5.4.4 WNV Impfdichte im Betrieb 5.4.5 Nutzung einer Fliegendecke 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Danksagung

Einleitung Die FSME ist die medizinisch bedeutsamste zeckenübertragene Krankheit in Europa und Asien. In Europa erkranken jährlich mehrere tausend Menschen an der FSME. Zur Seroprävalenz der FSME liegen wenige Daten vor, da seit dem Aufkommen der FSME-Impfung in den 80er Jahren in Deutschland eine Unterscheidung von Impf- und Infektionsantikörpern mittels konventioneller serologischer Methoden nicht mehr möglich war. Die Entwicklung eines neuen ELISAs im Jahr 2020, der auf dem Nichtstrukturprotein 1 (NS1) basiert, macht diese Unterscheidung möglich. Ziele der Arbeit Die Ziele der durchgeführten Studie waren die Bestimmung von epidemiologischen Zielgrößen wie Seroprävalenz, Infektions- und Immunitätsrate sowie das Generieren neuer Daten zum Manifestationsindex im endemischen Landkreis Ortenaukreis in Baden-Württemberg. Das Vorliegen historischer Daten zur Seroprävalenz, die vor Einführung der Impfung im Landkreis Ortenaukreis erhoben wurden, schaffte zudem die interessante Möglichkeit, die Häufigkeit der FSME-Infektionen in einem endemischen Gebiet über einige Jahrzehnte zu vergleichen. Des Weiteren wurden die Blutproben auf neutralisierende Antikörper hin untersucht und die serologische Immunitätsrate der Proben mit vom Robert Koch-Institut bereitgestellten Zahlen zum Impfschutz in der Bevölkerung verglichen. Material und Methoden Insgesamt wurden 2220 Blutspenderestproben, die größtenteils aus dem Landkreis Ortenaukreis in Baden-Württemberg stammen, beprobt. Die FSME-Meldezahlen für das untersuchte Gebiet wurden vom RKI bereitgestellt. Zuerst wurden alle Blutproben mit einem IgG-ELISA auf IgG-Antikörper gegen die FSME getestet. Alle in diesem ELISA positiven Proben wurden im weiteren Verlauf mit dem neuen NS1-ELISA auf IgG-Antikörper gegen das NS1-Protein getestet. Alle im IgG-ELISA positiven und im NS1-ELISA negativen Proben wurden mittels SNT auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper überprüft. Der IIFT wurde zur Überprüfung von kreuzreaktiven Antikörpern verwendet. Die auf Daten der Krankenversicherungen basierende Durchimpfungsrate für den Ortenaukreis wurde vom Robert Koch-Institut bereitgestellt. Ergebnisse Von den 2220 Proben wiesen 57 % (1257/2220) IgG-Antikörper gegen die FSME auf. 125 der 2220 Proben, also 5,6 %, wurden mithilfe des NS1-ELISAs positiv auf eine vorangegangene FSME-Infektion getestet. Bei wenigen Proben wurden kreuzreagierende Antikörper gefunden, die durch andere Flaviviren induziert wurden (7/2220). Es konnte ein Manifestationsindex von ca. 2 % ermittelt werden, sowie eine hohe Anzahl an stillen Infektionen von über 250 pro 100.000 Einwohnern pro Jahr. Für ca. 55 % (1150/2104) der Proben wurde ein neutralisierender Antikörpertiter gegen das FSME-Virus ermittelt. Schlussfolgerung In den dieser Arbeit zugrunde liegenden Studien wurden neue Daten zu FSME-Inzidenz und Manifestationsindex in einem endemischen Gebiet generiert. Nach Vergleich mit Daten aus dem Jahr 1986 ist festzustellen, dass die Ergebnisse für einen etwa siebenfachen Anstieg der FSME-Infektionsraten im untersuchten Gebiet trotz der Verfügbarkeit eines hochwirksamen Impfstoffs sprechen. Die serologische Immunitätsrate ist signifikant höher als die vom Robert Koch-Institut für den Ortenaukreis erhobenen Zahlen zum Impfschutz (ca. 20 %), was für eine längere Haltbarkeit der von der Impfung induzierten Antikörper sprechen könnte, als ursprünglich angenommen. Diese Arbeit verdeutlicht außerdem den Nutzen von Seroprävalenzstudien zur Ergänzung Inzidenz-basierter Risikobewertung von Gebieten, in denen das FSME-Virus endemisch ist.:1 Einleitung......................................................................................1 2 Literaturübersicht.........................................................................2 2.1 Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)................2 2.1.1 Virologie................................................................................2 2.1.2 Virusreplikation.....................................................................3 2.1.3 Epidemiologie in Deutschland..............................................4 2.1.4 Übertragungszyklus des FSME-Virus...................................6 2.1.5 Infektion und Krankheitsverlauf............................................8 2.1.6 Impfung.................................................................................9 2.1.7 Diagnostik............................................................................10 2.1.8 Serologische Methoden.......................................................11 3 Publikationen...............................................................................14 3.1 Eigenanteil Publikation 1..............................................................14 3.1.1 Publikation 1........................................................................16 3.2 Eigenanteil Publikation 2..............................................................25 3.2.1 Publikation 2........................................................................26 4 Diskussion....................................................................................36 5 Zusammenfassung.......................................................................44 6 Summary......................................................................................46 7 Referenzen...................................................................................48 7.1 Literatur........................................................................................48 7.2 Abbildungsverzeichnis.................................................................59 8 Danksagung.................................................................................60 / Introduction TBE is the medically most significant tick-borne disease in Europe and Asia. In Europe, several thousand people fall ill with TBE every year. There is little data available on the seroprevalence of TBE, because the availability of TBE vaccination since the 1980s in Germany has made it no longer possible to distinguish between vaccine- and infection-induced antibodies using conventional serological methods. The development of a new ELISA in 2020 based on the non-structural protein 1 (NS1) makes this distinction possible. Objectives The study’s objectives were to determine epidemiological target points such as seroprevalence, infection and serological immunity rates and to generate new data on the manifestation index in the endemic district of Ortenaukreis in Baden-Württemberg. The availability of historical seroprevalence data collected before the introduction of TBE vaccination in the Ortenaukreis district also provided the interesting opportunity to compare the prevalence of TBE infections in an endemic area over several decades. Additionally, the blood samples were analysed for neutralising antibodies, and the serological immunity rate of the sample size was compared with numbers on the vaccination rate in the population provided by the Robert Koch Institute (RKI). Material and Methods A total of 2220 blood donor samples, most of which came from the Ortenaukreis district in Baden-Württemberg, were sampled. The RKI provided TBE reporting numbers for the region of interest. All blood samples were initially tested for IgG antibodies against TBE using an IgG ELISA. All samples positive in this ELISA were subsequently tested for IgG antibodies against the NS1 protein in the new NS1 ELISA. All samples positive in the IgG ELISA and negative in the NS1 ELISA were tested for the presence of neutralising antibodies with the SNA. The IIFA was used to check for cross-reactive antibodies. The vaccination rate for the Ortenaukreis district, based on health insurance data, was provided by the RKI. Results Of the 2220 samples, 57 % (1257/2220) showed IgG antibodies against TBE. 125 of the 2220 samples, i.e. 5.6 %, tested positive for a previous TBE infection in the NS1 ELISA. In a few samples, cross-reacting antibodies induced by other flaviviruses were found (7/2220). A manifestation index of ca. 2 % could be determined, as well as a high number of silent infections of more than 250 per 100.000 inhabitants per year. A neutralising antibody titer against the TBE virus could be determined for ca. 55 % (1150/2104) of the sample size. Conclusion In the studies on which this work is based, new TBE incidence and manifestation index data were generated for an endemic area. After comparing the data from 1986, the results indicate an approximately sevenfold increase in TBE infection rates in the studied area despite the availability of a highly effective vaccine. The serological protection rate is significantly higher than the immune protection rate numbers collected by the RKI for the Ortenaukreis (approx. 20 %), which could speak for longer durability of the antibodies induced by the vaccination than originally assumed. Furthermore, this study illustrates the use of seroprevalence studies in addition to incidence-based risk assessment of TBE endemic areas.:1 Einleitung......................................................................................1 2 Literaturübersicht.........................................................................2 2.1 Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)................2 2.1.1 Virologie................................................................................2 2.1.2 Virusreplikation.....................................................................3 2.1.3 Epidemiologie in Deutschland..............................................4 2.1.4 Übertragungszyklus des FSME-Virus...................................6 2.1.5 Infektion und Krankheitsverlauf............................................8 2.1.6 Impfung.................................................................................9 2.1.7 Diagnostik............................................................................10 2.1.8 Serologische Methoden.......................................................11 3 Publikationen...............................................................................14 3.1 Eigenanteil Publikation 1..............................................................14 3.1.1 Publikation 1........................................................................16 3.2 Eigenanteil Publikation 2..............................................................25 3.2.1 Publikation 2........................................................................26 4 Diskussion....................................................................................36 5 Zusammenfassung.......................................................................44 6 Summary......................................................................................46 7 Referenzen...................................................................................48 7.1 Literatur........................................................................................48 7.2 Abbildungsverzeichnis.................................................................59 8 Danksagung.................................................................................60