Estudos para obter perfis químicos ou físicos de drogas ilícitas destinam-se a provar materialmente a existência de um crime ou para fornecer informações precisas aos serviços de inteligência estratégica e operacional. Um perfil pode ser definido como um conjunto de características específicas selecionadas para proporcionar informações sobre determinada produção, por exemplo, clandestina. Historicamente, focados sobre drogas de abuso, tais estudos podem ser perfeitamente utilizados em outro problema das Ciências Forenses: a falsificação de medicamentos. Seguindo uma tendência mundial, a maior incidência de medicamentos falsificados no Brasil é dos produtos Viagra® (citrato de sildenafila, SLD, Pfizer) e Cialis® (tadalafila, TAD, Eli Lilly). Avaliaram-se perfis físicos e químicos de amostras forenses de Viagra e Cialis falsificados fazendo uso de Análise Multivariada de Dados (AMD). O controle físico dos comprimidos, o perfil inorgânico por espectrometria de fluorescência de raios – X (XRF), o perfil orgânico por espectrometria de massa com ionização por eletro spray (ESI-MS), o perfil de ingredientes farmacologicamente ativos (IFA) por cromatografia líquida acoplada espectrometria de massa (UPLC-MS) e o perfil por espectroscopia de infravermelho (FTIR-ATR) foram avaliados para caracterizar as amostras, detectando falsificações e agrupando amostras com propriedades semelhantes. Os resultados mostraram a presença de falsificações de risco à saúde com a existência de outros IFA do que o especificado na embalagem; a ocorrência simultânea de dois IFA em um mesmo produto; a existência de outros IFA (contaminantes); e concentrações de TAD e SLD muito mais elevadas do que nos medicamentos originais. A aplicação de ferramenta de AMD torna a representação dos dados experimentais mais clara e conclusiva relativamente às diferenças na composição das amostras testadas. Identificamos pares de amostras de apreensões diferentes estreitamente ligadas pelo perfil químico, que podem estar associadas a uma origem ilícita comum de mistura farmacêutica pré-compressão e/ou de ciclo de compressão. Além disso, nossos resultados sugerem a hipótese de uma mesma mistura farmacêutica, contendo apenas SLD, foi empregada na fabricação de comprimidos falsificados de Viagra e de Cialis. / Studies to obtain chemical or physical profiles of illicit drugs intended to materially prove the existence of a crime or to provide to accurate information the strategic and operational intelligence services. A profile can be defined as a series of specific characteristics selected to provide information about certain production (e.g., clandestine). Historically focused on drugs of abuse, such studies can be perfectly used in another problem on Forensic Sciences field: counterfeit medicines. Following a global trend, the highest incidence of counterfeit medicines in Brazil is on the products Viagra® (sildenafil citrate, SLD, Pfizer) and Cialis® (tadalafil, TAD, Eli Lilly). We studied physical and chemical profiles of forensic counterfeit Viagra and Cialis samples using also Multivariate Data Analysis (MDA). Physical control of tablets, inorganic profile by X – Ray fluorescence spectrometry (XRF), organic profile by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), active pharmacologically ingredients (API) profile by liquid chromatography coupled mass spectrometer (UPLC-MS) and infrared spectroscopy (FTIR-ATR) profiles were evaluated to characterize the samples allowing detection of counterfeits and grouping samples with similar properties. The results showed the presence of health risk counterfeits with the existence of API other than specified on the package, the simultaneous occurrence of two API in the same product, the existence of others contaminants API and concentrations of TAD and SLD much higher than in original commercial tablets. By applying a MDA tool the experimental data representation becomes more clear and conclusive with respect to the differences in composition of tested samples. We identified paired samples from different seizures closely linked by chemical profile, which can be associated with a common origin of mixture powders and/or tableting cycle. In addition, our results suggest the hypothesis of a unique pharmaceutical powder mixture containing only SLD, which was compressed into counterfeits Viagra and Cialis tablets.

Resumo não disponível

Estudos para obter perfis químicos ou físicos de drogas ilícitas destinam-se a provar materialmente a existência de um crime ou para fornecer informações precisas aos serviços de inteligência estratégica e operacional. Um perfil pode ser definido como um conjunto de características específicas selecionadas para proporcionar informações sobre determinada produção, por exemplo, clandestina. Historicamente, focados sobre drogas de abuso, tais estudos podem ser perfeitamente utilizados em outro problema das Ciências Forenses: a falsificação de medicamentos. Seguindo uma tendência mundial, a maior incidência de medicamentos falsificados no Brasil é dos produtos Viagra® (citrato de sildenafila, SLD, Pfizer) e Cialis® (tadalafila, TAD, Eli Lilly). Avaliaram-se perfis físicos e químicos de amostras forenses de Viagra e Cialis falsificados fazendo uso de Análise Multivariada de Dados (AMD). O controle físico dos comprimidos, o perfil inorgânico por espectrometria de fluorescência de raios – X (XRF), o perfil orgânico por espectrometria de massa com ionização por eletro spray (ESI-MS), o perfil de ingredientes farmacologicamente ativos (IFA) por cromatografia líquida acoplada espectrometria de massa (UPLC-MS) e o perfil por espectroscopia de infravermelho (FTIR-ATR) foram avaliados para caracterizar as amostras, detectando falsificações e agrupando amostras com propriedades semelhantes. Os resultados mostraram a presença de falsificações de risco à saúde com a existência de outros IFA do que o especificado na embalagem; a ocorrência simultânea de dois IFA em um mesmo produto; a existência de outros IFA (contaminantes); e concentrações de TAD e SLD muito mais elevadas do que nos medicamentos originais. A aplicação de ferramenta de AMD torna a representação dos dados experimentais mais clara e conclusiva relativamente às diferenças na composição das amostras testadas. Identificamos pares de amostras de apreensões diferentes estreitamente ligadas pelo perfil químico, que podem estar associadas a uma origem ilícita comum de mistura farmacêutica pré-compressão e/ou de ciclo de compressão. Além disso, nossos resultados sugerem a hipótese de uma mesma mistura farmacêutica, contendo apenas SLD, foi empregada na fabricação de comprimidos falsificados de Viagra e de Cialis. / Studies to obtain chemical or physical profiles of illicit drugs intended to materially prove the existence of a crime or to provide to accurate information the strategic and operational intelligence services. A profile can be defined as a series of specific characteristics selected to provide information about certain production (e.g., clandestine). Historically focused on drugs of abuse, such studies can be perfectly used in another problem on Forensic Sciences field: counterfeit medicines. Following a global trend, the highest incidence of counterfeit medicines in Brazil is on the products Viagra® (sildenafil citrate, SLD, Pfizer) and Cialis® (tadalafil, TAD, Eli Lilly). We studied physical and chemical profiles of forensic counterfeit Viagra and Cialis samples using also Multivariate Data Analysis (MDA). Physical control of tablets, inorganic profile by X – Ray fluorescence spectrometry (XRF), organic profile by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), active pharmacologically ingredients (API) profile by liquid chromatography coupled mass spectrometer (UPLC-MS) and infrared spectroscopy (FTIR-ATR) profiles were evaluated to characterize the samples allowing detection of counterfeits and grouping samples with similar properties. The results showed the presence of health risk counterfeits with the existence of API other than specified on the package, the simultaneous occurrence of two API in the same product, the existence of others contaminants API and concentrations of TAD and SLD much higher than in original commercial tablets. By applying a MDA tool the experimental data representation becomes more clear and conclusive with respect to the differences in composition of tested samples. We identified paired samples from different seizures closely linked by chemical profile, which can be associated with a common origin of mixture powders and/or tableting cycle. In addition, our results suggest the hypothesis of a unique pharmaceutical powder mixture containing only SLD, which was compressed into counterfeits Viagra and Cialis tablets.

Fetal growth restriction (FGR), when a fetus fails to reach its genetic growth potential, affects up to 10 % of pregnancies and is a major risk factor for both neonatal and adulthood morbidity and mortality. There are currently no treatments for FGR except for delivery of the fetus; resulting in premature delivery which, in itself, is linked to poor outcome. Therefore, the focus of current research is to examine whether therapies successfully used to treat diseases with similar aetiologies to FGR can also be used to treat FGR. Sildenafil citrate (SC), a selective phosphodiesterase-5 inhibitor, is one such candidate. With the recent announcement of the STRIDER international clinical trial for the treatment of severe FGR with SC, it is imperative to determine the efficacy and safety of SC treatment on both fetus in utero and long-term adult health. Mouse models that mimic characteristics of human FGR represent an attractive model to perform pre-clinical studies. Recent studies in mice have demonstrated that SC increased fetal and placental weight and normalised umbilical artery blood flow velocity in FGR but no studies have assessed effects of antenatal SC on offspring health. The aims of this study were to assess the effect of antenatal SC treatment on a) fetal weight b) fetal vascular reactivity b) pup viability and d) long-term effects on postnatal development/physiology in a mouse model of FGR.All experiments were performed in the placental-specific insulin-like growth factor 2 knockout mouse (Igf2 P0+/- mice) which have mixed litters of wild-type (WT) and growth restricted (P0) mice. It has been reported that SC administered in the drinking water was able to increase P0 fetal weight and thus this mouse model was chosen to assess the effects of SC on the fetus and offspring. SC was administered to pregnant dams in two regimens; orally (120 – 160 mg.kg-1) and subcutaneously (10 mg.kg-1) between E12.5 and E18.5. WT and P0 fetal abdominal aortas were isolated at E18.5 and ex vivo vascular function was assessed using wire myography. Fetal abdominal aortas demonstrated reliable and reproducible vasocontraction and vasorelaxation; there were some sex- and genotype-specific differences. SC demonstrated dose-dependent effects on fetal aortic function. Offspring from dams treated with a subcutaneous injection of SC or saline were assessed for postnatal growth (week 5 – week 12), systolic blood pressure (week 8 and week 13), glucose tolerance (week 12) and mesenteric / aortic vascular function (week 14 – week 16). These experiments demonstrated that;• A supratherapeutic concentration of antenatal SC (120 – 160 mg.kg-1) did not increase fetal weight but significantly blunted relaxation responses of fetal abdominal aortas at E18.5. • A subcutaneous injection of antenatal SC (10 mg.kg-1) did not increase fetal weight or alter fetal abdominal aortic function in mice but led to increased systolic blood pressure in both WT and P0 offspring. Additionally, glucose sensitivity was significantly reduced in female offspring from SC treated dams. In conclusion, the studies outlined in this thesis have demonstrated that antenatal SC treatment can cause alterations in fetal blood vessel function and also lead to changes in metabolic and cardiovascular function in mouse offspring. Using ex vivo wire myography, mouse fetal abdominal aortas were able to be assessed at E18.5. This methodological advance will be beneficial as it can be applied to assessing putative treatments in mice that show characteristics of human FGR. In addition, this technique will allow for investigation of the underlying mechanisms of in utero programming of adulthood cardiovascular diseases such as hypertension. Future work must focus on the mechanisms leading to increased systolic blood pressure in offspring from SC treated dams and whether such effects are noted in other animal models of FGR using a variety of SC dosing regimens. These studies will provide information with which to increase efficacy, and ensure the safety, of SC treatment in pregnancy complications.

A disfunção erétil (DE) é uma doença relacionada com a sinalização deficiente de óxido nítrico (NO). O NO é produzido a partir da L-arginina pelas enzimas óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), endotelial (eNOS) e induzida (iNOS). A dimetilarginina assimétrica (ADMA) é um inibidor endógeno dos três subtipos existentes de NOS, e é metabolizada principalmente pelas enzimas dimetilarginina dimetilaminohidrolase 1 e 2 (DDAH1 e DDAH2). Vários estudos têm associado alterações em genes, expressão ou atividade das enzimas DDAH com distúrbios em que a sinalização de NO é prejudicada. O objetivo deste estudo foi avaliar se o nível de resposta ao tratamento da DE com sildenafil pode estar associado a polimorfismos dos genes DDAH1 (rs1554597 e rs18582) e DDAH2 (rs805304 e rs805305) e, também, aos haplótipos formados por estes polimorfismos. Foram selecionados 70 pacientes com DE pós-prostatectomia (DEPP) e 70 pacientes com DE clínica (DEC). A função erétil dos voluntários foi avaliada através do questionário Índice Internacional de Função Erétil (IIEF). Para avaliação da resposta ao sildenafil, foram calculadas a diferença entre as pontuações pré e pós-tratamento (?IIEF) e a percentagem atingida da máxima resposta possível (?IIEF%) de cada paciente. Também, os pacientes de cada grupo foram divididos em bons e maus respondedores ao sildenafil de acordo com a mediana dos valores de ?IIEF%. Os genótipos dos rs1554597, rs805304 e rs805305 foram obtidos pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão enzimática, e do rs18582 pela técnica de PCR alelo específica. O software PHASE 2.1 foi utilizado para estimar os haplótipos em cada grupo. Os resultados mostraram que o alelo variante A do rs18582 apresentou tendência para associação com piores respostas ao sildenafil no grupo DEC (P=0,058). No grupo DEPP, portadores dos alelos variantes A do rs805304 e G do rs805305 foram associados a melhores respostas ao sildenafil (?IIEF, P=0,007; ?IIEF%, P=0,025; e score IIEF pós-tratamento, P=0,014). Não foram encontradas outras associações significativas. Estes resultados mostram que os marcadores genéticos rs805304 e rs805305 do DDAH2 podem influenciar as respostas ao sildenafil em pacientes com DE. / Erectile dysfunction (ED) is a disease related to deficient nitric oxide (NO) signaling. NO is produced from L-arginine by three isoforms of the enzyme nitric oxide synthase: neuronal (nNOS), endothelial (eNOS) and induced (iNOS). Asymmetric dimethylarginine (ADMA) is an endogenous inhibitor of the three existing NOS subtypes, and is metabolized primarily by dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 and 2 (DDAH1 and DDAH2) enzymes. Several studies have associated changes in genes, expression or activity of DDAH enzymes with disorders in which NO signaling is impaired. The aim of this study was to evaluate whether the response to ED treatment with sildenafil may be associated with polymorphisms of the DDAH1 (rs1554597 and rs18582) and DDAH2 genes (rs805304 and rs805305), as well as the haplotypes formed by these polymorphisms. We selected 70 patients with postprostatectomy ED (PPED) and 70 patients with clinical ED (CED). The erectile function of the volunteers was assessed using the International Index for Erectile Function (IIEF) questionnaire. To evaluate the response to sildenafil, the difference between the pre- and post-treatment scores (?IIEF) and the percentage reached from the maximum possible response (?IIEF%) of each patient were calculated. Also, patients from each group were divided into good and bad responders to sildenafil according to the median values of ?IIEF%. The genotypes of rs1554597, rs805304 and rs805305 were obtained by the polymerase chain reaction (PCR) technique followed by enzymatic digestion, and rs18582 by the allele-specific PCR technique. The PHASE 2.1 software was used to estimate the haplotypes in each group. The results showed that the variant A allele of rs18582 showed a tendency to be associated with a greater chance of worse responses to sildenafil in the DEC group (P=0,058). In the DEPP group, carriers of the variant alleles A of rs805304 and G of rs805305 were associated with better responses to sildenafil (?IIEF, P=0,007; ?IIEF%, P=0,025; and post-treatment IIEF score, P=0,014). No other significant associations were found. These results show that the genetic markers rs805304 and rs805305 of DDAH2 may influence the responses to sildenafil in patients with ED.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanessa Kovalski Silverio.pdf: 1423306 bytes, checksum: 68729da0a75b158004d6a33911081b96 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Septic shock, which is triggered by microbial products, is mainly characterized by an inadequate tissue perfusion caused by a decreased in blood pressure, vascular damage, hyporeactivity to vasoconstrictors and disseminated intravascular coagulation, which can lead to multiple organ dysfunction and death. Nitric oxide (NO) is an important player in the pathogenesis of sepsis and septic shock, having both protective and deleterious effects. Trials of nonselective NOS inhibitors have shown increased mean arterial pressure, but also increased pulmonary artery pressure and reduced cardiac output. Thus, despite the intense research, there was no clinical progress so far. Perhaps this is due to lack of compression of NO signaling pathways. There is a knowledge gap on the role of the NO-guanylate cyclase- guanosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate (cGMP) pathway during the early stages of sepsis. Most work has studied the role of cGMP by inhibiting the enzyme responsible for its production (guanylate cyclase), however, in this work we chose to try the increased cGMP levels by inhibiting an enzyme responsible for their degradation, phosphodiesterase 5 (PDE5). In the early stages of shock occurs an intense release of vasoconstrictors agents, which can lead to ischemia damage. In this scenario, cGMP could play a key role counterbalancing these agents and preventing tissue damage. Sildenafil, a type-5 cGMP phosphodiesterase inhibitor, increase GMP at smooth muscle cells and promotes vasodilation .Thus, the purpose of this study was to investigate the effect of treatment with sildenafil in the early stages of sepsis. Male Wistar rats were divided into 2 groups of 16 animals each and submitted to either Cecal Ligation and Puncture (CLP) or the sham procedure. Eight hours after the procedure, the CLP and sham groups were randomly assigned to receive sildenafil (10 mg/kg orally) or vehicle. Twenty-four hours after the CLP or sham procedure, the mean arterial blood pressure, systolic and diastolic blood pressure and vascular reactivity to phenylephrine were evaluated. Additionally, blood samples were collected for measurement of nitric oxide (nitrate and nitrite), urea, creatinine, AST, ALT, lactate and CK.; hematological analyzes were also performed. Statistical significance was analyzed by two-way ANOVA followed by post hoc Bonferroni. The results shows that the CLP was able to reproduce the main characteristics of humans sepsis like as, systemic inflamation, hypotension, reduced response to vasoconstrictors, hypoxia and tissue damage. Interestingly, treatment with sildenafil improved and the organ hypoperfusion at early stages of sepsis reducing organ injury. Thus, phosphodiesterase inhibition may be a useful therapeutic strategy if administered at the proper window of opportunity. / O choque séptico, que é desencadeado por produtos microbianos, é caracterizado principalmente por uma perfusão tecidual inadequada causada pela diminuição da pressão arterial, lesão vascular, hiporreatividade a vasoconstritores e coagulação intravascular disseminada, o que pode levar à disfunção de múltiplos órgãos e morte. O óxido nítrico (NO) tem um importante papel na patogênese da sepse e choque séptico, tendo efeitos tanto protetores como deletérios. Ensaios clínicos com inibidores não seletivos da NOS (óxido nítrico sintase) motraram melhora nos níveis da pressão arterial média, porém houve também um aumento da pressão da artéria pulmonar e redução do débito cardíaco. Assim, apesar da investigação intensa, não houve progressos clínicos até agora. Talvez isso se deve à falta de compreensão do NO e suas vias de sinalização. Há por exemplo uma lacuna sobre o papel da enzima guanilato ciclase solúvel e do segundo mensageiro guanosina 3',5'- monofosfato cíclico (cGMP) durante os momentos iniciais da sepse. A maioria dos trabalhos tem estudado o papel do cGMP através da inibição da enzima responsável pela sua produção (guanilato ciclase), porém, neste trabalho optamos por tentar o aumento dos níveis de cGMP através da inibição de uma enzima responsável pela sua degradação, a fosfodiesterase 5 (PDE5). Nos primeiros estágios de choque ocorre uma intensa liberação de agentes vasoconstritores, o que pode levar a danos por isquemia. Neste cenário, o cGMP pode desempenhar um papel chave para contrabalançar esses agentes e impedir danos nos tecidos. O sildenafil, um inibidor de fosfodiesterase do tipo 5, aumenta cGMP em células do músculo liso promovendo vasodilatação. Assim, o propósito do presente estudo foi investigar o efeito do tratamento com sildenafil nas fases iniciais da sepse. Ratos Wistar machos foram divididos em 2 grupos de 16 animais cada e submetidos ao procedimento CLP (Cecal Ligation and Puncture) ou à falsa cirurgia (sham). Oito horas após o procedimento, os grupos CLP e sham foram aleatoriamente divididos para receber sildenafil (10 mg / kg por via oral) ou veículo. Vinte e quatro horas após o procedimento CLP ou sham, a pressão arterial média, sistólica e diastólica e reatividade vascular à fenilefrina foram avaliadas. Além disso, amostras de sangue foram coletadas para a dosagem de óxido nítrico (nitrato e nitrito), uréia, creatinina, AST, ALT, lactato e CK; análises hematológicas também foram realizadas. A significância estatística foi analisada por ANOVA de duas vias seguida de post hoc Bonferroni. Os resultados mostram que o modelo CLP foi capaz de reproduzir as principais características da sepse como inflamação sistêmica, hipotensão, redução da resposta ao vasoconstritores, hipóxia e dano tecidual. Interessantemente, o tratamento com sildenafil melhorou a hipoperfusão em estágios iniciais de sepse reduzindo a lesão de órgãos. Sendo assim, inibidores das fosfodiasterases, como o sildenafil, podem ser ferramentas terapêuticas úteis para o tratamento da sepse, desde que administrados na correta janela de oportunidade.

A disfunção erétil (DE) é uma doença relacionada com a sinalização deficiente de óxido nítrico (NO). O NO é produzido a partir da L-arginina pelas enzimas óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), endotelial (eNOS) e induzida (iNOS). A dimetilarginina assimétrica (ADMA) é um inibidor endógeno dos três subtipos existentes de NOS, e é metabolizada principalmente pelas enzimas dimetilarginina dimetilaminohidrolase 1 e 2 (DDAH1 e DDAH2). Vários estudos têm associado alterações em genes, expressão ou atividade das enzimas DDAH com distúrbios em que a sinalização de NO é prejudicada. O objetivo deste estudo foi avaliar se o nível de resposta ao tratamento da DE com sildenafil pode estar associado a polimorfismos dos genes DDAH1 (rs1554597 e rs18582) e DDAH2 (rs805304 e rs805305) e, também, aos haplótipos formados por estes polimorfismos. Foram selecionados 70 pacientes com DE pós-prostatectomia (DEPP) e 70 pacientes com DE clínica (DEC). A função erétil dos voluntários foi avaliada através do questionário Índice Internacional de Função Erétil (IIEF). Para avaliação da resposta ao sildenafil, foram calculadas a diferença entre as pontuações pré e pós-tratamento (?IIEF) e a percentagem atingida da máxima resposta possível (?IIEF%) de cada paciente. Também, os pacientes de cada grupo foram divididos em bons e maus respondedores ao sildenafil de acordo com a mediana dos valores de ?IIEF%. Os genótipos dos rs1554597, rs805304 e rs805305 foram obtidos pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão enzimática, e do rs18582 pela técnica de PCR alelo específica. O software PHASE 2.1 foi utilizado para estimar os haplótipos em cada grupo. Os resultados mostraram que o alelo variante A do rs18582 apresentou tendência para associação com piores respostas ao sildenafil no grupo DEC (P=0,058). No grupo DEPP, portadores dos alelos variantes A do rs805304 e G do rs805305 foram associados a melhores respostas ao sildenafil (?IIEF, P=0,007; ?IIEF%, P=0,025; e score IIEF pós-tratamento, P=0,014). Não foram encontradas outras associações significativas. Estes resultados mostram que os marcadores genéticos rs805304 e rs805305 do DDAH2 podem influenciar as respostas ao sildenafil em pacientes com DE. / Erectile dysfunction (ED) is a disease related to deficient nitric oxide (NO) signaling. NO is produced from L-arginine by three isoforms of the enzyme nitric oxide synthase: neuronal (nNOS), endothelial (eNOS) and induced (iNOS). Asymmetric dimethylarginine (ADMA) is an endogenous inhibitor of the three existing NOS subtypes, and is metabolized primarily by dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 and 2 (DDAH1 and DDAH2) enzymes. Several studies have associated changes in genes, expression or activity of DDAH enzymes with disorders in which NO signaling is impaired. The aim of this study was to evaluate whether the response to ED treatment with sildenafil may be associated with polymorphisms of the DDAH1 (rs1554597 and rs18582) and DDAH2 genes (rs805304 and rs805305), as well as the haplotypes formed by these polymorphisms. We selected 70 patients with postprostatectomy ED (PPED) and 70 patients with clinical ED (CED). The erectile function of the volunteers was assessed using the International Index for Erectile Function (IIEF) questionnaire. To evaluate the response to sildenafil, the difference between the pre- and post-treatment scores (?IIEF) and the percentage reached from the maximum possible response (?IIEF%) of each patient were calculated. Also, patients from each group were divided into good and bad responders to sildenafil according to the median values of ?IIEF%. The genotypes of rs1554597, rs805304 and rs805305 were obtained by the polymerase chain reaction (PCR) technique followed by enzymatic digestion, and rs18582 by the allele-specific PCR technique. The PHASE 2.1 software was used to estimate the haplotypes in each group. The results showed that the variant A allele of rs18582 showed a tendency to be associated with a greater chance of worse responses to sildenafil in the DEC group (P=0,058). In the DEPP group, carriers of the variant alleles A of rs805304 and G of rs805305 were associated with better responses to sildenafil (?IIEF, P=0,007; ?IIEF%, P=0,025; and post-treatment IIEF score, P=0,014). No other significant associations were found. These results show that the genetic markers rs805304 and rs805305 of DDAH2 may influence the responses to sildenafil in patients with ED.

Por meio da técnica de microperfusão estacionária in vivo, túbulos proximais (TP) de ratos Wistar foram perfundidos com solução CTRL contendo ou não Sinva 100μM ou Sil 10μM para determinar a reabsorção de bicarbonato (JHCO3-). A perfusão de Sil diminuiu o JHCO3- em 20%, enquanto que Sinva incrementou em 19,31% o JHCO3- comparado com o CTRL. Já a Prav diminuiu em 15% o JHCO3- . Para testar se os efeitos foram dependents de NHE3, PTs foram perfundidos com CTRL, Sil, Sinva ou Prav mais S3226, um inibidor específico de NHE3. O JHCO3- remanescente (insensível à S3226) não foi diferente entre os grupos, mostrando que NHE3 foi modulado por Sil e Sinva. Já o efeito inibitório da Prav ocorre não apenas via NHE3 mas também via H+ ATPase. Para determinar se a via Rho está envolvida nestes efeitos, os PTs foram perfundidos com Y-27632 1μM, inibidor de Rho GTPase. A perfusão com Y-27632 reverteu o efeito inibitório promovido tanto pelo Sil quanto pela Prav, demonstrando que o efeito inibitório destes fármacos sobre a atividade do NHE3 ocorre via Rho. Além disso, o efeito inibitório de Sil foi completamente abolido pelo inibidor de PKG dependente de GMPc KT5823 10-6 M. Para confirmar estes resultados, animais foram mantidos em gaiolas metabólicas por 24 h e tratados via oral com 7mg/Kg/dia de Sinva e 20mg/Kg/dia de Sil. Sil diminuiu a CE Na+, indicando que outros mecanismos de transporte podem estar envolvidos em alterações no manejo de Na+ pelos rins promovidas por Sil. Já a infusão de Prav em ratos Wistar pela jugular durante 30 min promoveu aumento da CE Na+, sugerindo que o fármaco age inibindo NHE3. / By means of stationary microperfusion, PT of Wistar rats were perfused with a CTRL solution with or without 100μM Simva or 10μM Sil to determine bicarbonate reabsorption (JHCO3-). Perfusion of Sil decreased JHCO3- by 20% and perfusion of Simva increased JHCO3- by 19,31% compared to CTRL. Prav decreased JHCO3- by 15%. To test if these effects were NHE3-dependent, PTs were perfused with CTRL, Sil, Simva or Prav plus 2μ M S3226, a specific NHE3 inhibitor. The reminiscent S3226-insensitive JHCO3- was not different among groups, showing that NHE3 was modulated by Sil or Simva. To determine if Rho was involved in these effects, the PTs were perfused with the Rho GTPase inhibitor Y-27632 (1μM). Perfusion with Y-27632 reversed the inhibitory effect promoted by both Sil and Prav, demonstrating that the inhibitory effect of these drugs on NHE3 activity occurs via Rho. Furthermore, the inhibitory effect of Sil was completely abolished by either the protein kinase G (PKG) inhibitor dependent of cGPM KT5823 10-6 M. To confirm our results the animals were kept for 24 hours in metabolic cages and treated orally with 7mg/kg Sim or 20mg/kg Sil. The Sil decreased the Na+ excretion load, indicating that other transport mechanisms beyond the proximal tubule involved in the changes of handling of Na+ by the treatment with Sil. On the other hand, the infusion of Prav in Wistar rats by jugular for 30 min promoted an increase in Na+ CE, suggesting that the drug acts by inhibiting NHE3.

Submitted by DIOGO SOUSA ZANONI (zanoni_19@hotmail.com) on 2019-01-31T11:46:22Z No. of bitstreams: 1 Defesa Doutorado - entrega Pós.pdf: 2160080 bytes, checksum: a016ec7f20ec85dc0433f4452821780e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lucia de Grava Kempinas (algkempinas@fca.unesp.br) on 2019-01-31T19:07:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zanoni_ds_dr_botfmvz.pdf: 2160080 bytes, checksum: a016ec7f20ec85dc0433f4452821780e (MD5) / Made available in DSpace on 2019-01-31T19:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zanoni_ds_dr_botfmvz.pdf: 2160080 bytes, checksum: a016ec7f20ec85dc0433f4452821780e (MD5) Previous issue date: 2018-12-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O glaucoma é a principal causa global de cegueira irreversível e o número de pessoas com glaucoma em todo o mundo aumentará para 111,8 milhões em 2040, mesmo com os tratamentos vigentes. Deste modo, enseja uma necessidade de desenvolver terapias neuroprotetoras que possam ser usadas para reduzir os efeitos perniciosos do glaucoma, como a morte de células ganglionares da retina (CGR). Avanços na compreensão da fisiopatologia do glaucoma é um fator chave na compreensão da patogênese da neuropatia glaucomatosa. Neste contexto a isquemia retiniana desempenha um papel central em várias doenças da retina. A patogênese da isquemia retiniana envolve alterações temporais da morfologia e morfometria da retina assim como mudanças na expressão gênica e protéica. O Citrato de Sildenafila (SC) mostrou efeito protetor nos modelos de isquemia/reperfusão (I/R) com efeitos neuroprotetores. Contudo, a administração oral de CS, em humanos, encontra inúmeros efeitos colaterais, tais como redução da pressão arterial, dores de cabeça, rubor e congestão nasal são concomitantes, assim como pacientes com moderada a grave doença cardiovascular ou aqueles submetidos a terapia a base de nitrato apresentam riscos secundários aumentados para efeitos cardiovasculares adversos. Deste modo, propomos que a administração tópica de CS pode ser uma alternativa à via oral e também ser igualmente neuroprotetor no glaucoma e podem minimizar os riscos indesejados no uso sistêmico desse fármaco, além de oferecer uma nova abordagem para a intervenção terapêutica na patogênese da neuropatia glaucomatosa. Caso nossos resultados sejam positivos, em um estudo tão abrangente, pode levar a um ensaio clínico deste fármaco seguro e promissor em pacientes com glaucoma. / Glaucoma is the leading global cause of irreversible blindness and the number of people with glaucoma worldwide will increase to 111.8 million by 2040, even with current treatments. Thus, there is a need to develop neuroprotective therapies that can be used to reduce the deleterious effects of glaucoma, such as retinal ganglion cell death (RBC). Advances in understanding the pathophysiology of glaucoma are a key factor in understanding the pathogenesis of glaucomatous neuropathy. In this context, retinal ischemia plays a central role in various diseases of the retina. The pathogenesis of retinal ischemia involves temporal changes in retinal morphology and morphometry as well as changes in gene and protein expression. Sildenafil Citrate (SC) showed protective effect in the ischemia / reperfusion (I / R) models with neuroprotective effects. However, oral administration of CS in humans finds numerous side effects such as reduced blood pressure, headaches, flushing and nasal congestion are concomitant, as well as patients with moderate to severe cardiovascular disease or those undergoing nitrate therapy have increased secondary risks for adverse cardiovascular effects. Thus, we propose that the eye drops administration of CS may be an alternative to the oral route and also be equally neuroprotective in glaucoma and may minimize the undesirable risks in the systemic use of this drug, as well as offer a new approach for the therapeutic intervention in the pathogenesis of neuropathy glaucomatous. If our results are positive, in such a comprehensive study, it may lead to a clinical trial of this safe and promising drug in patients with glaucoma. / 142471\2015-1

Submitted by DIOGO SOUSA ZANONI (zanoni_19@hotmail.com) on 2019-02-01T17:03:15Z No. of bitstreams: 1 Defesa Doutorado - entrega Pós.pdf: 2159159 bytes, checksum: c32db30aea42543516cc0f930e17164d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Lucia de Grava Kempinas (algkempinas@fca.unesp.br) on 2019-02-01T18:10:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zanoni_ds_dr_botfmvz.pdf: 2159159 bytes, checksum: c32db30aea42543516cc0f930e17164d (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-01T18:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zanoni_ds_dr_botfmvz.pdf: 2159159 bytes, checksum: c32db30aea42543516cc0f930e17164d (MD5) Previous issue date: 2018-12-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O glaucoma é a principal causa global de cegueira irreversível e o número de pessoas com glaucoma em todo o mundo aumentará para 111,8 milhões em 2040, mesmo com os tratamentos vigentes. Deste modo, enseja uma necessidade de desenvolver terapias neuroprotetoras que possam ser usadas para reduzir os efeitos perniciosos do glaucoma, como a morte de células ganglionares da retina (CGR). Avanços na compreensão da fisiopatologia do glaucoma é um fator chave na compreensão da patogênese da neuropatia glaucomatosa. Neste contexto a isquemia retiniana desempenha um papel central em várias doenças da retina. A patogênese da isquemia retiniana envolve alterações temporais da morfologia e morfometria da retina assim como mudanças na expressão gênica e protéica. O Citrato de Sildenafila (SC) mostrou efeito protetor nos modelos de isquemia/reperfusão (I/R) com efeitos neuroprotetores. Contudo, a administração oral de CS, em humanos, encontra inúmeros efeitos colaterais, tais como redução da pressão arterial, dores de cabeça, rubor e congestão nasal são concomitantes, / Glaucoma is the leading global cause of irreversible blindness and the number of people with glaucoma worldwide will increase to 111.8 million by 2040, even with current treatments. Thus, there is a need to develop neuroprotective therapies that can be used to reduce the deleterious effects of glaucoma, such as retinal ganglion cell death (RBC). Advances in understanding the pathophysiology of glaucoma are a key factor in understanding the pathogenesis of glaucomatous neuropathy. In this context, retinal ischemia plays a central role in various diseases of the retina. The pathogenesis of retinal ischemia involves temporal changes in retinal morphology and morphometry as well as changes in gene and protein expression. Sildenafil Citrate (SC) showed protective effect in the ischemia / reperfusion (I / R) models with neuroprotective effects. However, oral administration of CS in humans finds numerous side effects such as reduced blood pressure, headaches, flushing and nasal congestion are concomitant, as well as patients with moderate to severe cardiovascular disease or those undergoing nitrate therapy have increased secondary risks for adverse cardiovascular effects. Thus, we propose that the eye drops administration of CS may be an alternative to the oral route and also be equally neuroprotective in glaucoma and may minimize the undesirable risks in the systemic use of this drug, as well as offer a new approach for the therapeutic intervention in the pathogenesis of neuropathy glaucomatous. If our results are positive, in such a comprehensive study, it may lead to a clinical trial of this safe and promising drug in patients with glaucoma. / 142471\2015-1