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In dieser Dissertation werden die Bindungseigenschaften von Rezeptor-Ligand-Komplexen mit Hilfe von Optischen Pinzetten untersucht. Aufgrund ihrer außerordentlichen Orts- (2nm) und Kraftauflösung (0,2pN) ist es möglich, diese spezifischen Interaktionen anhand einzelner Bindungsereignisse zu charakterisieren. Als Modellsysteme dienen die Wechselwirkungen zwischen den phosphorylierungsspezifischen, monoklonalen Antikörpern HPT-101 und HPT-104 und dem Morbus Alzheimer relevanten Tau-Peptid. Dieses pathogen veränderte Peptid wird krankheitsspezifisch an den Aminosäuren Threonin231 und Serin235 phosphoryliert, sodass die Detektion dieses Phosphorylierungsmusters mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern eine mögliche Früherkennung der Alzheimer-Krankheit darstellt. Eine notwendige Voraussetzung dafür ist jedoch die exakte Kenntnis der Bindungsstellen des Liganden am Rezeptor. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist es, das Epitop des monoklonalen Antikörpers HPT-101 zu bestimmen. Dazu werden mögliche bindungsrelevante Aminosäuren durch ein Alanin ausgetauscht (Alanin-Scan) und so insgesamt sieben neue Tau-Isoformen aus dem ursprünglichen doppelt-phosphorylierten Peptid Tau[pThr231/pSer235] hergestellt. Die jeweiligen Interaktionen zwischen den modifizierten Peptiden und dem Antikörper werden mit der dynamischen Kraftspektroskopie untersucht und mit Hilfe eines literaturbekannten Modells analysiert. Die sich daraus ergebenden Bindungsparameter (Lebensdauer der Bindung, charakteristische Bindungslänge, freie Aktivierungsenergie und Affinitätskonstante) werden zusammen mit den relativen Bindungshäufigkeiten erstmals genutzt, um Kriterien für essentielle, sekundäre und nicht-essentielle Aminosäuren im Tau-Peptid zu definieren. Bemerkenswerterweise existieren für insgesamt drei dieser Parameter (Bindungslebensdauer, Bindungslänge und Affinitätskonstante) scharfe Klassengrenzen, mit denen eine objektive Einteilung des Epitops von Antikörper HPT-101 möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in überzeugender Weise im Einklang mit ELISA-Messungen zu diesem Antikörper-Peptid-Komplexen, sie liefern jedoch einen tieferen Einblick in die Natur einer spezifischen Bindung, da den kraftspektroskopischen Messungen auch die Bindungskinetik zugänglich ist. Das zweite Projekt der vorliegenden Dissertation etabliert eine Methodik, um die Datenvarianz in der Bestimmung der relativen Bindungshäufigkeit zu reduzieren. Anhand einer Kombination aus Fluoreszenz- und kraftspektroskopischen Messungen werden die Wechselwirkungen zwischen dem monoklonalen Antikörper HPT-104 und dem fluoreszenzmarkierten Peptid Tau[Fl-pThr231] untersucht. Es wird gezeigt, dass durch Vorsortieren der Peptid-beschichteten Kolloide, entsprechend ihrer Oberflächenbeladung, die Datenvarianz in den Bindungshäufigkeitsmessungen signifikant reduziert wird.

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Membrane proteins are of undeniable importance for cell physiology across all domains of life and a loss of their function, e.g., due to mutations in their coding sequence, is almost always linked to disease. In humans, mutations in the gene coding for the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an ATP-gated anion channel in epithelia, give rise to cystic fibrosis (CF). Over 2100 mutations of the CFTR gene are known, however, their disease liability remains mostly undetermined. Causal therapies, i.e., small-molecule drugs that target CFTR itself, have improved the lives of people with the most common mutations (e.g. ΔF508, G551D) over the last decade. In contrast, many rare CF-phenotypic mutations are not eligible for these novel treatments and would benefit from in vitro evaluation of their molecular consequences. In vitro studies of membrane proteins are often complicated by the intrinsic hydrophobicity and aggregation susceptibility of this protein group. However, this can be avoided by using short membrane protein fragments corresponding to the smallest in vivo folding unit of the respective protein at the ER membrane. These model proteins can be easily genetically modified, expressed and purified, making them a suitable tool to pinpoint the effects of mutations. This thesis demonstrates the utility of such a reductionist model system: TM3/4, the second helical hairpin of CFTR’s transmembrane domain 1, was used to study protein folding with a focus on disease-causing missense mutations of CFTR, which may cause CFTR misfolding in vivo. TM3/4 purification was first optimized by using a thioredoxin tag, which allowed heat purification of the fusion protein even after initial purification steps. Optimal heat treatment for maximal protein purity and recovery were determined for TM3/4 and another helical hairpin, ATP synthase subunit c. Moreover, tertiary folding of a CF-phenotypic loop mutation, E217G, introducing a non-native GXXXG interaction motif was analyzed by single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) in different lipid bilayer conditions, showing unusually increased stability in comparison to wild type (WT) TM3/4. Furthermore, smFRET was used in tandem with circular dichroism and fluorescence spectroscopy to assess the effect of a specific membrane lipid, cholesterol, on TM3/4 variants showing significant changes on secondary but not tertiary structure. Lastly, a mutant library of 13 TM3/4 mutants was established to perform drug screenings with CFTR correctors – a class of small molecules rescuing or preventing misfolding of CFTR. This screening study demonstrated that (i) not all CF-phenotypic missense mutations are locally misfolded at a lipid bilayer comparable to the ER membrane; and (ii) in vitro restoration of a native WT-like conformation of locally misfolded TM3/4 mutants is not only possible but different drug-mutant pairings can be identified related to folding rescue efficiency of a given corrector on a respective mutant. The latter identified drug-mutant pairings may lead to drug repurposing if the effect can be confirmed in cell culture experiments. In conclusion, the TM3/4 minimal model of CFTR and biophysical methods, such as smFRET, proved as versatile tools not only for investigation of mutation and lipid effects on membrane protein folding but also for drug screenings in a disease context.:1 INTRODUCTION 2 THEORETICAL BACKGROUND 2.1 MEMBRANE PROTEINS AND THEIR NATIVE ENVIRONMENTS 2.1.1 Membrane protein families and their role in human health 2.1.2 Fundamental folding models of α-helical membrane proteins 2.1.3 Co-translational folding at the ER supported by the translocon 2.1.4 Folding-relevant interactions within membrane proteins 2.1.5 Biological membranes and lipid classes 2.1.6 Physical properties of lipid bilayers impacting membrane proteins 2.1.7 Membrane models for in vitro studies 2.2 CYSTIC FIBROSIS AND CFTR 2.2.1 Pathology of cystic fibrosis 2.2.2 Structure and function of the CFTR channel 2.2.3 A minimal model of CFTR to study rare CF mutations 2.2.4 Missense mutations within the CFTR segmental model TM3/4 2.2.5 Novel modulator therapies for the treatment of cystic fibrosis 2.3 IN VITRO ASSESSMENT OF MEMBRANE PROTEIN FOLDING 2.3.1 Expression and purification of membrane proteins 2.3.2 Single-molecule FRET in single- and multi-well mode for protein folding 3 HEAT PURIFICATION OF TRX MEMBRANE PROTEIN FUSIONS 3.1 PREAMBLE AND SUMMARY 3.2 RESULTS AND DISCUSSION 4 IMPACT OF A CFTR LOOP MUTATION WITH ATYPICAL STABILITY 4.1 PREAMBLE AND SUMMARY 4.2 RESULTS AND DISCUSSION 5 EFFECTS OF CHOLESTEROL ON LOCAL CFTR FOLDING 5.1 PREAMBLE AND SUMMARY 5.2 RESULTS 5.2.1 Folding of TM3/4 hairpins in the presence of cholesterol 5.2.2 Folding of TM3/4 hairpins in the presence of Lumacaftor 5.2.3 Impact of Lumacaftor on membrane fluidity 5.3 DISCUSSION 6 CFTR CORRECTOR SCREENINGS WITH SINGLE-MOLECULE FRET 6.1 PRESCREENING TO IDENTIFY MISFOLDED TM3/4 VARIANTS 6.2 SCREENING OF MISFOLDED TM3/4 VARIANTS WITH CFTR CORRECTORS 7 CONCLUSIONS 8 OUTLOOK 9 MATERIALS AND METHODS 9.1 CONSTRUCT DESIGN OF HELICAL TRANSMEMBRANE HAIRPINS 9.2 PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION 9.3 HEAT TREATMENT OF HELICAL TRANSMEMBRANE CONSTRUCTS 9.4 SINGLE-MOLECULE FRET EXPERIMENTS 9.4.1 Labeling of TM3/4 constructs 9.4.2 Liposome preparation and reconstitution of labeled protein constructs 9.4.3 Single-molecule FRET measurements in manual mode 9.4.4 Single-molecule FRET measurements in multi-well screening mode 9.5 CIRCULAR DICHROISM SPECTROSCOPY 9.5.1 Circular dichroism to determine protein heat stability 9.5.2 Circular dichroism to study protein structure in different lipid bilayers 9.6 FLUORESCENCE SPECTROSCOPY 9.6.1 Vesicle leakage assay to test lipid bilayer stability 9.6.2 Examining lipid bilayer fluidity with fluorescent probes 10 APPENDIX 10.1 GENERATION OF A TM3/4 MUTANT LIBRARY 10.2 TM3/4 SCREENINGS WITH CFTR CORRECTORS 10.2.1 SmFRET control screenings and supporting data 10.2.2 Extracted closed state fractions from smFRET screenings 10.2.3 DLS to measure vesicle integrity after corrector addition 11 REFERENCES 12 ACKNOWLEDGEMENTS 13 ERKLÄRUNG GEMÄß §5 ABS. 1 S. 3 DER PROMOTIONSORDNUNG / Membranproteine sind für die Zellphysiologie aller biologischen Domänen von unbestreitbarer Bedeutung und ein Verlust ihrer Funktion, z.B. durch Mutationen in ihrer kodierenden Sequenz, ist fast immer Auslöser von Krankheiten. Beim Menschen führen Mutationen im Gen für den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einen ATP-abhängigen Anionenkanal in Epithelien, zu Mukoviszidose (CF). Über 2100 Mutationen des CFTR-Gens sind bekannt – ob jedoch alle Mutationen tatsächlich CF auslösen, ist weitgehend ungeklärt. Kausale Therapien, d.h. niedermolekulare Medikamente, die auf CFTR selbst abzielen, haben in den letzten zehn Jahren die Lebensqualität von Menschen mit den häufigsten Mutationen (z.B. ΔF508, G551D) verbessert. Demgegenüber stehen jedoch viele seltene CF-phänotypische Mutationen, für welche diese neuartigen Behandlungen nicht zugelassen sind, wodurch diese Mutationen von einer In-vitro-Analyse ihrer molekularen Konsequenzen profitieren würden. In-vitro-Untersuchungen von Membranproteinen werden oft durch die intrinsische Hydrophobizität und Aggregationsanfälligkeit dieser Proteine erschwert. Dies kann jedoch vermieden werden, indem kurze Membranproteinfragmente verwendet werden, die der kleinsten in vivo Faltungseinheit des jeweiligen Proteins an der ER-Membran entsprechen. Diese Modellproteine können routiniert genetisch verändert, exprimiert und aufgereinigt werden, was sie zu einem geeigneten Werkzeug macht, um die Auswirkungen von Mutationen zu genau festzustellen. Diese Dissertation demonstriert die Nützlichkeit eines solchen reduktionistischen Modellsystems: TM3/4, das zweite helikale Haarnadel-Motiv der Transmembrandomäne 1 von CFTR, wurde verwendet, um Proteinfaltung mit Schwerpunkt auf krankheitsverursachende Missense-Mutationen von CFTR zu untersuchen, welche eine CFTR-Fehlfaltung in vivo verursachen können. Die TM3/4-Aufreinigung wurde zunächst durch die Verwendung eines Thioredoxin-Tags optimiert, der eine Hitzeaufreinigung des Fusionsproteins auch nach anfänglichen Reinigungsschritten ermöglichte. Die optimale Hitzebehandlung für maximale Proteinreinheit und -ausbeute wurde für TM3/4 und ein weiteres helikales Haarnadelprotein, die ATP-Synthase-Untereinheit c, bestimmt. Weiterhin wurde die tertiäre Faltung einer CF-phänotypischen Mutation, E217G, die ein nicht-natives GXXXG-Interaktionsmotiv einführt, mittels einzelmolekularem Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET) in verschiedenen Lipiddoppelschichten analysiert, welche eine ungewöhnlich erhöhte Stabilität im Vergleich zum TM3/4-Wildtyp (WT) zeigte. Darüber hinaus wurde smFRET in Verbindung mit Circulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie verwendet, um die Wirkung eines spezifischen Membranlipids, Cholesterin, auf TM3/4-Varianten zu untersuchen, welches signifikante Auswirkungen auf die sekundäre, aber nicht auf die tertiäre Proteinstruktur hatte. Schließlich wurde eine Mutantenbibliothek von 13 TM3/4-Mutanten eingerichtet, um Wirkstoffscreenings mit CFTR-Korrektoren durchzuführen – einer Klasse kleiner Moleküle, die die Fehlfaltung von CFTR verhindern können. Diese Screening-Studie zeigte, dass (i) nicht alle CF-phänotypischen Missense-Mutationen lokal an einer Lipiddoppelschicht fehlgefaltet sind, die mit der ER-Membran vergleichbar ist; und (ii) die In-vitro-Wiederherstellung einer nativen WT-ähnlichen Konformation von lokal fehlgefalteten TM3/4-Mutanten ist nicht nur möglich, sondern es können auch verschiedene Wirkstoff-Mutanten-Paare identifiziert werden, die mit der Faltungsrettungseffizienz eines Korrektors auf eine bestimmte Mutante zusammenhängen. Die letztgenannten Wirkstoff-Mutanten-Paare können zu Drug-Repurposings führen, wenn die Wirkung in Zellkulturexperimenten bestätigt werden kann. Im Allgemeinen, haben sich das TM3/4-Minimalfaltungsmodell von CFTR sowie biophysikalische Methoden, wie z.B. smFRET, als vielseitige Werkzeuge nicht nur für die Untersuchung von Mutations- und Lipideffekten auf die Membranproteinfaltung, sondern auch für das Screening von Medikamenten im Krankheitskontext erwiesen.:1 INTRODUCTION 2 THEORETICAL BACKGROUND 2.1 MEMBRANE PROTEINS AND THEIR NATIVE ENVIRONMENTS 2.1.1 Membrane protein families and their role in human health 2.1.2 Fundamental folding models of α-helical membrane proteins 2.1.3 Co-translational folding at the ER supported by the translocon 2.1.4 Folding-relevant interactions within membrane proteins 2.1.5 Biological membranes and lipid classes 2.1.6 Physical properties of lipid bilayers impacting membrane proteins 2.1.7 Membrane models for in vitro studies 2.2 CYSTIC FIBROSIS AND CFTR 2.2.1 Pathology of cystic fibrosis 2.2.2 Structure and function of the CFTR channel 2.2.3 A minimal model of CFTR to study rare CF mutations 2.2.4 Missense mutations within the CFTR segmental model TM3/4 2.2.5 Novel modulator therapies for the treatment of cystic fibrosis 2.3 IN VITRO ASSESSMENT OF MEMBRANE PROTEIN FOLDING 2.3.1 Expression and purification of membrane proteins 2.3.2 Single-molecule FRET in single- and multi-well mode for protein folding 3 HEAT PURIFICATION OF TRX MEMBRANE PROTEIN FUSIONS 3.1 PREAMBLE AND SUMMARY 3.2 RESULTS AND DISCUSSION 4 IMPACT OF A CFTR LOOP MUTATION WITH ATYPICAL STABILITY 4.1 PREAMBLE AND SUMMARY 4.2 RESULTS AND DISCUSSION 5 EFFECTS OF CHOLESTEROL ON LOCAL CFTR FOLDING 5.1 PREAMBLE AND SUMMARY 5.2 RESULTS 5.2.1 Folding of TM3/4 hairpins in the presence of cholesterol 5.2.2 Folding of TM3/4 hairpins in the presence of Lumacaftor 5.2.3 Impact of Lumacaftor on membrane fluidity 5.3 DISCUSSION 6 CFTR CORRECTOR SCREENINGS WITH SINGLE-MOLECULE FRET 6.1 PRESCREENING TO IDENTIFY MISFOLDED TM3/4 VARIANTS 6.2 SCREENING OF MISFOLDED TM3/4 VARIANTS WITH CFTR CORRECTORS 7 CONCLUSIONS 8 OUTLOOK 9 MATERIALS AND METHODS 9.1 CONSTRUCT DESIGN OF HELICAL TRANSMEMBRANE HAIRPINS 9.2 PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION 9.3 HEAT TREATMENT OF HELICAL TRANSMEMBRANE CONSTRUCTS 9.4 SINGLE-MOLECULE FRET EXPERIMENTS 9.4.1 Labeling of TM3/4 constructs 9.4.2 Liposome preparation and reconstitution of labeled protein constructs 9.4.3 Single-molecule FRET measurements in manual mode 9.4.4 Single-molecule FRET measurements in multi-well screening mode 9.5 CIRCULAR DICHROISM SPECTROSCOPY 9.5.1 Circular dichroism to determine protein heat stability 9.5.2 Circular dichroism to study protein structure in different lipid bilayers 9.6 FLUORESCENCE SPECTROSCOPY 9.6.1 Vesicle leakage assay to test lipid bilayer stability 9.6.2 Examining lipid bilayer fluidity with fluorescent probes 10 APPENDIX 10.1 GENERATION OF A TM3/4 MUTANT LIBRARY 10.2 TM3/4 SCREENINGS WITH CFTR CORRECTORS 10.2.1 SmFRET control screenings and supporting data 10.2.2 Extracted closed state fractions from smFRET screenings 10.2.3 DLS to measure vesicle integrity after corrector addition 11 REFERENCES 12 ACKNOWLEDGEMENTS 13 ERKLÄRUNG GEMÄß §5 ABS. 1 S. 3 DER PROMOTIONSORDNUNG

Photo-induced charge transfer which occurs between molecules or different parts of a large molecule is the pivotal process related to performances of organic electronics. In particular, injection of charge carriers into conjugated polymers and dissociation of photo-generated excitons at the heterojunction between a donor and acceptor system are of great importance in determining the luminescence efficiency of organic light emitting diodes (OLEDs) and solar energy conversion efficiency of organic solar cells, respectively. However, the complex nature of organic semiconductors as well as complicated primary processes involved in the functioning of these devices have prevented us from understanding unique characteristics of these processes and thereby engineering better materials for higher performances. In this dissertation, two different types of photo-induced (or -related) charge transfer processes occurring in organic semiconductors were investigated by using single molecule spectroscopy (SMS) techniques to unravel the complexities of these processes. The carefully designed functioning capacitor-like model devices similar to OLEDs and photovoltaic cells were fabricated where isolated single nanoparticles were introduced as an active medium to mitigate the complexities of these materials. We observed that injection of positively charged carriers (holes) into poly[2-methoxy-5-(2'-ethyl-hexyloxy)-1,4-phenylene vinylene] (MEH-PPV) single nanoparticles from the carbazole hole transport layer does not occur in the absence of light. We denoted the observed hole injection in aid of light as the light-induced hole transfer mechanism (LIHT). It was revealed that the charging dynamics are highly consistent with a cooperative charging effect. In addition, the LIHT was proposed as the possible source for the formation of deep trapped hole in organic devices. Local exciton dissociation yields across a nanostructured domain between poly(9,9-dioctylfluorene-alt-benzothiadiazole) (F8BT) single nanoparticles and either poly(9,9- dioctylfluorene - co - bis-N,N- (4 -butylphenyl)-bis-N,N-phenyl-1,4-phenylene diamine) (PFB) or poly(9,9-dioctylfluorene-co-N-(4-butylphenyl)diphenylamine) (TFB) film in model photovoltaic devices was also investigated. A wide distribution of exciton dissociation yields was observed from each nanodomain due to the device geometry. The observed hysteresis in fluorescence voltage curve was ascribed to accumulated charges following charge separations. The dynamics of charge separation under the applied electric field was described in more detail. / text

Les amphipoles (APols) sont devenus des outils importants pour la stabilisation, le repliement, et les études structurales et fonctionnelles in vitro des protéines membranaires (MPs). Les MPs sont les unités fonctionnelles des biomembranes et représentent environ un tiers des protéines qui sont codées par le génome. La première partie de mon travail est dédiée à la cristallisation de MPs piégée par des APol. La cristallisation directe de protéines solubilisées en APol sera d'une grande importance pour la biologie structurale. Cependant, malgré des efforts considérables, il n'est pas certain que les complexes MP/APol peuvent être utilisés pour former des cristaux bien ordonnés utilisables en cristallographie des rayons X. Le premier objectif de cette thèse est de montrer que les MPs piégées par des APol peuvent être cristallisées in meso. Pour faire cela, nous avons utilisé des bicouches amphiliques interconnectées qui sont ajustables pour certaines MPs. Cette méthode a été récemment développée dans notre laboratoire. Nous avons utilisé la bactériorhodopsin (BR) piégée avec APol A8-35 comme système modèle pour nos études cristallographiques. Le premier cristal obtenu diffractait à 3 Å, alors qu'une nouvelle méthode de cristallisation en nanovolume, exploitant des précipitants secs, améliore les pics de diffraction aux rayons X observés jusqu'a 2 Å. La structure de BR a été résolue à 2 Å et s'est révélée identique aux autre structures obtenues précédemment à partir de protéine solubilisée en détergents. Nous suggérons que le protocole proposé, de cristallisation in meso, est applicable aux MPs solubilisées avec des APols.La deuxième partie est liée aux applications des APols pour les études de MPs à l'aide de spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). La spectroscopie SERS a énormément évolué depuis sa découverte en 1970. C'est un outil analytique puissant pour sélectionner les molécules qui adsorbent sur des nanoparticules et des nanostructures à base de métaux nobles, possiblement au niveau de la molécule unique. Malheureusement les études de MPs sont loin de l'application courante du SERS à cause de la difficulté résultante de la nature amphiphilique des MPs. La capacité des APols à piéger les MPs et de les garder solubles, stables et fonctionnelles ouvre la voie pour des applications extrêmement intéressantes des études SERS, éventuellement au niveau de la molécule unique. De plus, le deuxième objectif de ce travail de thèse était de démontrer la faisabilité de l'utilisation de SERS avec des MPs piégées par des APols. Le même modèle (BR/A8-35) a été utilisé pour les études cristallographiques et pour les agrégats de NP d'argent. Cette tâche a été réalisée a un niveau suffisant pour commencer des études de MPs avec la méthode SERS.Le premier chapitre de cette thèse commence avec des informations générales à propos de l'importance des études de MPs et les problèmes inhérents à leur manipulation. Plus loin dans le chapitre, un bref résumé des APols, de leurs propriétés et leurs applications est présenté. La majeure partie de l'introduction est dédiée aux points importants des différentes approches de cristallisation de MPs et de spectroscopie Raman, en particulier SERS spectroscopie, et leurs applications aux protéines. La fin de la partie “Introduction” présente les conclusions à propos des applications des APols pour les études de cristallographie aux rayons X et pour les études de spectroscopie SERS sur les MPs, définissant les objectifs principaux pour ce travail. Le chapitre “Materials and methods” consiste en une description détaillée des matériels et des protocoles utilisés dans cette étude. Le résultat des études de cristallisation et de SERS et leurs interprétations sont présentés comme deux différentes parties dans le dernier chapitre “Results and discussions”. Le chapitre “Conclusions and perspectives est présent dans chaque partie. / Amphipols (APols) have become important tools for the stabilization, folding, and in vitro structural and functional studies of membrane proteins (MPs). MPs are the main functional units of biomembranes and represent roughly one-third of the proteins encoded in the genome. The first part of my work was dedicated to crystallization of a MP trapped by APol. Direct crystallization of MPs solubilized in APols would be of high importance for structural biology. However, despite considerable efforts, it is still not clear whether MP/APol complexes can be used to form well-ordered crystals suitable for X-ray crystallography. The first major goal of this PhD thesis work was to show that APol-trapped MP can be crystallized in meso. To perform it we utilized special, flexibly adjustable for a certain MP, interconnected amphiphilic bilayers (IAB) approach which has been recently developed in our laboratory. We used bacteriorhodopsin (BR) trapped with APol A8-35 as a model system for our crystallization studies. The first obtained crystals diffracted to 3 Å, while a new developed type of high throughput nanovolume crystallization, exploiting dry precipitants, shifted the observed X ray diffraction peaks beyond 2 Å. The structure of BR was solved to 2 Å and found to be indistinguishable from previous structures obtained with a detergent-solubilized protein. We suggest that the proposed protocol of in meso crystallization is generally applicable to APol-trapped MPs.The second, to a certain extent, complementary part of the present work was related to application of APols to the surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of MPs. SERS spectroscopy has been developed dramatically since its discovery in the 1970s. It is a powerful analytical tool for selective sensing of molecules adsorbed onto noble metal nanoparticles (NPs) and nanostructures, including at the single molecule (SM) level. Unfortunately, MPs studies are far away from the main stream of SERS applications due to the great handling difficulties resulting from the amphiphilic nature of MPs. The ability of APols to trap MPs and keep them soluble, stable and functional opens the way for highly interesting applications of SERS studies, possibly at the SM level. Thus, the second goal of this PhD thesis work was to prove our concept of feasibility of SERS with MPs trapped by APols. Using the same as in the crystallization studies model BR/A8-35 complexes and silver NP aggregates, the task was fulfilled to a degree enough to start with the SERS studies of MPs.The first chapter of the PhD thesis begins with general information about the importance of MP studies and the problems with their handling. Further in this chapter, a brief overview of APols, their properties and applications is presented. The largest part of the “Introduction” is dedicated to main points of different MP crystallization approaches and Raman spectroscopy, in particular SERS spectroscopy, and their applications to proteins. The end of the “Introduction” part presents the conclusions about APol application for X-ray crystallography and SERS spectroscopy studies of MPs, setting the main goals for the present work. The “Materials and methods” chapter consists of detailed description of the materials and protocols used in this study. The results of crystallization and SERS studies and their interpretations are presented as two different parts in the last “Results and discussions” chapter. The “Conclusions and perspectives” sections accompany each of these parts.

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Funktionalisierte organische Perylenbisimidfarbstoffe (PBI) und aus Cadmiumselenid bestehende Halbleiternanokristalle werden hinsichtlich physikalischer sowie chemischer Wechselwirkungsprozesse miteinander und mit ihrer Umgebung mittels zeitaufgelöster optischer Spektroskopie untersucht. Im Mittelpunkt der Studien an diesem organisch/anorganischen Modellsystem nanoskopischer Größe steht die Aggregatbildungskinetik und die Identifikation und Quantifizierung von Transferpozessen. Die Anbindung der gut löslichen PBI-Farbstoffe an die Oberfläche solcher Halbleiternanokristalle mittels spezieller Ankergruppen wird durch Selbstorganisation in Lösung realisiert. Die Kombination von Absorptions- und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie zeigt einen unterschiedlich starken Einfluss von Liganden und Farbstoffen auf die Fluoreszenzlöschung der Nanokristalle und belegt, dass Resonanzenergietransfer zum Farbstoff nur in sehr geringem Maße die physikalische Ursache der Fluoreszenzlöschung ist. Die Anzahl adsorbierter Farbstoffe und die Stärke der Fluoreszenzlöschung eines einzelnen Farbstoffmoleküls werden aus zeitaufgelösten Einzelmolekülexperimenten an immobilisierten Emittern gewonnen, welche den direkten spektroskopischen Zugang zur Verteilung gebundener und freier Farbstoffe/Nanokristalle erlaubt. Darüber hinaus werden ankergruppen- und umgebungsspezifische Einflüsse auf die Konformations- und Orientierungsdynamik von Perylenbisimidmolekülen dargestellt. Abschließend werden photo-physikalische Gemeinsamkeiten chemisch unterschiedlich hervorgerufener Fluoreszenzlöschungsprozesse herausgearbeitet und im Kontext von Einzelkristall-Blinkprozessen diskutiert.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in Form photostabiler Perylenbisimide sowie etallischer Nanopartikel zur Untersuchung von Polymeren und nanoskopischen Flüssigkeitsfilmen. Einzelmoleküluntersuchungen zeigen, dass eine chemische Modifizierung der Farbstoffe durch löslichkeitserhöhende Seitengruppen, Molekülkonformationen mit stark variierenden Emissionswellenlängen je nach Seitengruppen-orientierung zur Folge hat. Zeitabhängige Fluoreszenzmessungen an einzelnen Molekülen ermöglichen eine direkte Beobachtung von Übergängen zwischen diesen molekularen Konformationen deren Dynamik vorwiegend durch die Eigenschaften der umgebenden Polymermatrix bestimmt wird. Die gewonnenen Ergebnisse lassen somit Rückschlüsse auf die nanoskopische Umgebung des Moleküls zu. Es werden diskrete Zustände innerhalb der Molekülumgebung sowie eine erhöhte Konformationsdynamik im Falle von alkylsubstituierten Perylenbisimiden beobachtet. Darüber hinaus werden die nanoskopischen Auswirkungen von makroskopischen, mechanischen Deformationen auf amorphe Polymerfilme mikrorheologisch mit Hilfe von stäbchenförmigen Perylenbisimiden studiert. Die gewonnenen Einzelmoleküldaten ermöglichen die Berechnung der lokalen, mikroskopischen Deformation sowie der Orientierung der Sondenmoleküle, welche gut mit einem Model für stäbchenförmige Objekte in einem uniaxial deformierten Kontinuum übereinstimmt. In weiteren Experimenten gelingt der Nachweis ultradünner Wasserfilme auf SiO2-Oberflächen durch Messung der Diffusion von Silbernanopartikeln. Die verwendeten Nanopartikel weisen hierbei eine monodisperse Größenverteilung im Bereich von einem Nanometer als Resultat ihrer Synthese in Y-Zeolith-Kristallen auf. Die Untersuchungen ergeben eine Filmdickenabhängigkeit des Diffusionsverhaltens sowie einen starken Einfluss durch Oberflächensilanisierung bzw. Hydroxylierung.