Oxigênio molecular singlete [O2(1Δg)], uma espécie excitada, desempenha um papel importante em sistemas químicos e biológicos. É um poderoso eletrófilo, que reage com moléculas ricas em elétrons através de cicloadições [2+2], [4+2] e reações tipo ene. Ácidos graxos poliinsaturados, proteínas e DNA são alvos vulneráveis para o ataque de O2(1Δg). Os endoperóxidos de derivados de naftaleno são muito úteis e versáteis como fontes limpas de O2(1Δg), uma vez que são quase quimicamente inertes. Por outro lado, o desenvolvimento de novas fontes de O2(1Δg) ainda é uma tarefa desafiadora. Os derivados de naftaleno são capazes de armazenar O2(1Δg) por reação de cicloadiação [4+2] e liberá-lo em temperaturas amenas, o que os torna muito adequados para uso em estudos biológicos. A síntese destes compostos está baseada em modificações nos substituintes ligados nas posições 1 e 4 da estrutura do naftaleno. Na primeira parte deste trabalho, a síntese de três endoperóxidos derivados do naftaleno solúveis em água foi realizada. DHPNO2 e NDPO2 foram preparados de acordo com métodos similares descritos na literatura. A síntese de um novo endoperóxido dicatiônico derivado do naftaleno (NBTEO2) foi desenvolvida, contendo dois grupos de cloreto de amônio quaternário nas posições 1,4 do anel aromático. O intermediário chave na síntese dos três endoperóxidos é o BBMN, o qual foi preparado a partir da bromação radicalar do 1,4-dimetilnaftaleno. Nossos resultados têm indicado que este composto dicatiônico pode ser uma fonte química de O2(1Δg) em potencial, e pode ser explorado em estudos com mitocôndrias, onde o papel biológico de O2(1Δg) é investigado. A segunda parte deste trabalho foi dedicada a investigar a geração de O2(1Δg) através das reações entre hidroperóxidos de lipídeos (ácido oleico, linoleico e colesterol), hidroperóxidos orgânicos (cumeno e t-butila), bem como peróxido de hidrogênio com NO2+, utilizando o composto NO2BF4. Evidências da geração de O2(1Δg) foram obtidas através de medidas de emissão de luz na região do infravermelho próximo, no comprimento de onda de 1270 nm. Além disso, a prova inequívoca da presença de O2(1Δg) foi demonstrada através da caracterização espectral direta da emissão de luz no infravermelho próximo. O uso de azida de sódio como captador físico de O2(1Δg), juntamente com as medidas da quimiluminescência, contribuíram para identificar a geração desta espécie na reação entre hidroperóxidos de lipídeos e NO2BF4. Embora seja uma abordagem química, nossos resultados adicionaram informações importantes sobre a peroxidação lipídica, principalmente quando espécies reativas de nitrogênio estão envolvidas. O O2(1Δg) poderia ser gerado como um subproduto da peroxidação lipídica em condições onde espécies reativas de nitrogênio interagem com hidroperóxidos lipídicos. Isto pode contribuir para um melhor entendimento deste evento complexo com implicações fisiológicas ou fisiopatológicas. / Singlet molecular oxygen [O2(1Δg)], an excited species, plays an important role in chemical and biological systems. It is a powerfull electrophile, reacting with electron rich molecules through [2+2] cycloadditions, [4+2] cycloadditions and ene reactions. Polyunsaturated fatty acids, proteins and DNA are vulnerable targets for O2(1Δg) reaction. Naphthalene derivatives endoperoxides are very useful and versatile as a clean source of O2(1Δg), once they are almost chemically inert. On the other hand, developing new sources of O2(1Δg) are still a challenging task. Naphthalene derivatives are able to trap O2(1Δg) by [4+2] cycloaddition and release it in mild temperatures, which make them very suitable for biological studies. The synthesis of these compounds is based on modifications in substituents bonded in 1,4 positions of nafhthalene backbone. In the first part of present work, the synthesis of three water soluble naphthalene derivatives endoperoxides was performed. DHPNO2, NDPO2 were prepared according to similar methods described in the literature. A new di-cationic naphthalene derivative endoperoxide (NBTEO2) synthesis was developed, containing two quaternary ammonium chloride groups in 1,4-positions of aromatic ring. The key intermediate: for the synthesis of the three endoperoxides is the compound BBMN, which was prepared from radicalar bromination of 1,4-dimethylnaphthalene. Our results have indicated that this di-cationic compound can be a potential chemical source of O2(1Δg) and may be explored in mitochondrial studies where O2(1Δg) biological role is investigated. The second part of this work is dedicated to the investigation of generation of O2(1Δg) through reaction of lipid hydroperoxides (oleic acid, linoleic acids and cholesterol), organic hydroperoxides (cumene and t-butyl), as well as hydrogen peroxide with NO2+, using the compound NO2BF4. Evidences of generation of O2(1Δg) were obtained recording the monomol light emission measurement in near infrared region at wavelength of 1270 nm. Moreover, the proof of the presence of O2(1Δg) was unequivocally demonstrated by the direct spectral characterization of near-infrared light emission. The use of sodium azide as a physical quencher of O2(1Δg), associated to chemiluminescence measurements, contributed to identify the generation of this species in the reaction of lipid hydroperoxides and NO2BF4. Although, it is a chemical approach, our results add important information about lipid peroxidation, mainly when reactive species of nitrogen are involved. O2(1Δg) might be generate as a byproduct of lipid peroxidation, in conditions where reactive nitrogen species interact with lipid hydroperoxides. This might contribute to a better understand of this complex event and physiological or physiopathological implications

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaHSO.pdf: 1397021 bytes, checksum: 1db8d16eef2d0b39d08b8b794e469761 (MD5) Previous issue date: 2009-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Esp?cies reativas de oxig?nio (EROs) s?o produtos do metabolismo celular capazes de reagir com biomol?culas, como prote?nas, lip?deos e ?cido nucl?ico. Essas rea??es podem causar modifica??es delet?rias para a c?lula. Fotossensibilizadores como o azul de metileno (MB), s?o capazes de produzir EROs, como o oxig?nio singlete (1O2), uma das formas mais reativas do oxig?nio molecular. O 1O2 ? capaz de oxidar guaninas, gerando les?es no DNA, como 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), o mais frequente produto da oxida??o, que durante a replica??o pode emparelhar com adenina levando ? muta??es. Foi de interesse desse estudo, caracterizar a citotoxicidade, o potencial mutag?nico e o padr?o de express?o prot?ica, durante o estresse oxidativo induzido pelo MB, usando como modelo cepas de Escherichia coli proficiente em reparo e deficientes em MutY-Glicosilase, uma enzima de reparo envolvida na corre??o de pares 8-oxoG:Adenina. Essas cepas foram tratadas com MB em presen?a ou aus?ncia de luz. O crescimento, sobreviv?ncia, a taxa de mutag?nese e padr?o de s?ntese prot?ica, foram analisados. O tratamento afetou o crescimento bacteriano, induzindo morte celular, mutag?nese, e mudan?as no padr?o de s?ntese prot?ica em ambas as cepas. Entretanto a cepa deficiente em MutY mostrou uma maior sensibilidade em rela??o a cepa proficiente. Adicionalmente, a cepa deficiente em MutY apresentou um padr?o de express?o prot?ica diferenciado quando comparado com a cepa proficiente. Esses resultados sugerem o envolvimento da MutY na corre??o de les?es de DNA n?o caracterizadas e que a aus?ncia de MutY induz altera??es no padr?o de express?o prot?ica

Evidências apontam para o envolvimento da peroxidação lipídica em diversas patologias. Os hidroperóxidos de lipídios (LOOH) são os produtos primários da peroxidação lipídica e sua decomposição resulta em produtos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila. Esses radicais desempenham papel importante na propagação da peroxidação lipídica e também podem gerar oxigênio molecular singlete (1O2) por meio da combinação de dois radicais peroxila. Neste trabalho investigamos a possibilidade dos LOOH, em particular dos hidroperóxidos de ácido linoléico (LAOOH), de servirem como fonte 1O2 na presença de oxidantes de relevância biológica como metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. A formação de 1O2 foi claramente demonstrada na reação de LAOOH com esses oxidantes pelas detecções (i) da emissão bimolecular na região espectral do vermelho (λ>570 nm), (ii) da emissão monomolecular no infravermelho-próximo (λ=1270 nm), (iii) do espectro de emissão no infravermelho, e (iv) da intensificação e supressão da luminescência na presença de D2O e azida, respectivamente. Além disso, os mecanismos de reação foram estudados utilizando LAOOH marcados com oxigênio-18 (LA18O18OH) e captadores químicos específicos para 1O2 aliada à tecnica de detecção por HPLC acoplada à espectrometria de massa. Os resultados mostraram a formação de 1O2 marcado [18(1O2) ] na reação de LA18O18OH com os três oxidantes, revelando que os átomos de oxigênio do 1O2 são derivados do hidroperóxido. Em conjunto, as evidências obtidas levam à conclusão de que os LOOH podem servir como fontes potenciais de 1O2 em sistemas biológicos em situações onde haja a coexistência de LOOH e metais, peroxinitrito ou ácido hipocloroso. / Evidences point to the involvement of lipid peroxidation in several diseases. Lipid hydroperoxides (LOOH) are the primary products of lipid peroxidation and their decomposition generates more reactive and toxic compounds, such as peroxyl radicals. These radicals play an important role in the propagation of lipid peroxidation and may also generate singlet molecular oxygen (1O2) by the combination of two peroxyl radicals. In this study we have investigated the possibility of LOOH, in particular linoleic acid hydroperoxide (LAOOH), to be a source of 1O2 in the presence of biologically relevant oxidants such as, metal ions, peroxynitrite or hypochlorous acid. The formation of 1O2 was clearly demonstrated in the reaction of LAOOH with all the three tested oxidants by detecting: (i) the dimol light emission in the red spectral region (λ>570 nm), (ii) the monomol light emission in the near-infrared region (λ=1270 nm), (iii) the infrared light emission spectrum, and (iv) the enhancing effect of deuterium oxide and the quenching effect of azide on light emission. Furthermore, the mechanism was studied using LAOOH labeled with 18-oxygen isotope (LA18O18OH) and specific 1O2 chemical traps in combination with HPLC coupled to mass spectrometry detection. The results have showed the formation of 18-oxygen labeled 1O2 [18(1O2) ] in the reaction of LA18O18OH with the three oxidants, indicating that oxygen atoms in 1O2 are derived from the hydroperoxide. Altogether, the obtained evidences lead to the conclusion that LOOH may serve as a potential source of 1O2 in biological systems, in situations where LOOH can interact with metals, peroxynitrite or hypochlorous acid.

As propriedades fotofísicas e fotoquímicas de cristal violeta (CV) foram investigadas em soluções isotrópicas e verificou-se que solventes com constante dielétrica pequena favorecem a formação do par iônico, já o aumento na viscosidade do meio restringe a movimentação rotacional dos anéis aromáticos, resultando em um aumento no tempo de vida de fluorescência e, portanto no rendimento quântico de fluorescência (Φf) (Oliveira 2002). Os experimentos com CV foram conduzidos em micelas reversas do tensoativo aniônico bis-2-etilhexil sulfoccinato de sódio (AOT) em isooctano. A localização interfacial do CV nas micelas reversas de AOT em valores da razão molar entre água e surfactante (W0)pequenos e grandes foram encontrados através da técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de próton e de carbono 13. Utilizando-se espectroscopia UV-Vis identificou-se que pares iônicos de contato estão presentes a valores pequenos de W0 e com o aumento do W0 pares iônicos separados por solventes são as espécies que predominam em solução. A comparação da eficiência de fotodegradação de CV em micelas reversas de AOT em função do W0 indicou que a fotoreatividade é maior em baixos valores de W0 . Este efeito deve estar relacionado à restrição da movimentação dos anéis aromáticos de CV devido ao ambiente restrito no qual este se localiza na micela reversa de OAT a W0 pequenos. A formação de intermediários reativos foi verificada através de Fotólise de Relâmpago a Laser e Emissão no infra-vermelho próximo, indicando a presença de espécies triplete, radical e oxigênio singlete com valor de rendimento quântico menor que 1%. Os produtos de fotólise foram identificados por técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Na presença de oxigênio, houve maior formação de cetona de Michler. Com baixa concentração de oxigênio, o produto observável foi leuco-CV. Destes estudos propomos o mecanismo de CV neste meio. Após os estudos com micelas reversas, células cancerosas HeLa foram empregadas para comparar fotoatividade do CV com o azul de metileno (MB). As proporções de CV e MB dentro das células são altas, incorporando 70% e 80% da concentração da solução de incubação, respectivamente. Com o aumento da concentração de MB, um favorecimento da formação de dímero foi identificada. Já CV não sofre agregação nas condições estudadas. Nenhum dos fotossensibilizadores estudados tem um efeito danoso sobre as células HeLa em concentrações abaixo de 10µM. Após irradiação, MB causou uma diminuição de cerca de duas vezes maior na taxa de sobrevivência celular comparado com CV. A formação de formação de oxigênio singlete após incorporação dos fotossensibilizadores foi investigada. Há formação de oxigênio singlete em células incubadas com MB, já com CV a geração de oxigênio singlete é pouco significativa sugerindo um mecanismo radicalar. O processo de morte celular foi estudado por citometria de fluxo e verificou-se que MB induz apoptose depois da irradiação em células HeLa. A absorção de luz por ambos fotossensibilizadores é similar, o que indica que a diminuição na sobrevivência não se deve à diferença de absorção luminosa. As diferenças de sobrevivência observadas com células incubadas com CV e MB e irradiadas foram relacionadas às diferenças das propriedades fotoquímicas destes fotossensibilizadores. A localização celular de CV e MB em células foram caracterizadas por microscopia de fluorescência. Verificou-se que ambos localizam-se em mitocôndrias. O aumento na concentração de CV não alterou o seu perfil de localização. Já para MB ao aumentar a concentração de MB, observa-se que o mesmo localiza-se além das mitocôndrias, em lisossomos. A comparação das propriedades fotoquímicas e de localização foram consideradas para explicar as diferenças de atividade fotodinâmica do CV e do MB em células HeLa / The photophysical and photochemical properties of crystal violet (CV) were investigated in isotropic solutions and it was found that solvents with small dielectric constants favor the formation of the ion pair and that the increase in viscosity of the medium restricts the rotational movement of the aromatic rings, resulting in an increase in fluorescent lifetime and therefore in the fluorescence quantum yield (Φf) (Oliveira 2002). CV experiments were conducted in reverse micelles of the anionic tensoactive sodium bis-2-ethylhexyl-sulfosuccinate (AOT) in isooctane. The interfacial localization of CV in the AOT reverse micelles at low and high values of molar ratio between water and surfactant (W0 was found through the proton and carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance techniques (NMR). Using UV-Vis spectroscopy, it was identified that contact ion pairs are present in low W0 values and with the increase in the W0 solvent separated ion pairs are the species that predominate in solution. The comparison of the photobleaching efficiency of CV in AOT reverse micelles as a function of W0indicated that the photoreactivity is high with low W0 values. This effect must be related to the restrict environment in which CV is located. The reactive intermediate formation was found through the Laser Flash Photolysis and Near Infra-Red Emission, indicating the presence of triplet, radical and singlet oxygen species with a yield quantum of less than 1%. The photolysis products were identified through the chromatographic and spectroscopic techniques. In the oxygen presence, there was high Michler ketone formation. With the low oxygen concentration, the observable product was leuco-CV. With these studies we hypothesized a mechanism of CV in these proposed media. After the reverse micelles studies, the HeLa cancerous cells were used, in order to compare the CV and methylene blue (MB) photoactivity. The CV and MB proportion inside the cell was high, reaching 70% and 80% of concentration of the incubation solution, respectively. With the increase of MB concentration, a favoring of dimmer formation was identified. CV does not suffer aggregation in the studied conditions. None of the studied photosensitizers has a damaging effect upon the HeLa cells in concentrations below 10µM. After irradiation, MB caused a decrease about twice higher in the cellular survival rate compared to CV. The singlet oxygen formation after the photosensitizer incorporation was investigated. There is a singlet oxygen formation in the cells incubated with MB, though with the CV the singlet oxygen generation is significantly low suggesting the radicalar mechanism. The cellular death process was studied by Fluorescence Activated Cell Sorting and MB-induced apoptosis was found after MB irradiation in HeLa cells. The light absorption by both photosensitizers is similar, which means that the survival decrease is not because of the light absorption difference. The survival differences observed with the cells incubated with CV and MB and irradiated were related to the differences in the photosensitizer photochemical properties. The cellular location of the CV and MB in cells were characterized by fluorescence microscopy. Both photosensitizers are located in mitochondrias. An increase in the CV concentration does not alter its local profile. However, with an increase in the MB concentration, MB was located not only in mitochondrias but also in lysosomes. The comparison of the photochemical and localization properties was considered in order to explain the differences in the photodynamic activity of CV and MB in HeLa cells

O estudo do processo da peroxidação de lipídios tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido à implicação dos hidroperóxidos de lipídios (LOOH) em diversos processos patológicos. A decomposição destes LOOH é capaz de gerar subprodutos capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. No presente trabalho, utilizando hidroperóxidos de ácido linoléico isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 (LA18O18OH), fomos capazes de demonstrar que estas moléculas gerararam oxigênio singlete marcado [18(1O2)] em células em cultura. A detecção de tal espécie foi possível através da utilização de uma nova metodologia utilizando um derivado antracenico. Para este propósito foi utilizado o derivado de antraceno 3,3\'-(9,10-antracenodiil) bisacrilato (DADB), cujo produto especifico da reação com o 1O2 (o endoperóxido do DADB DADBO2) do pode ser facilmente detectado por HPLC-MS/MS. De forma a expandir a compreensão dos efeitos tóxicos desses LOOH, investigamos o efeito destes compostos gerados intracelularmente. Para tal, foi utilizado o Rosa bengala (RB), um fotosensibilizador que tem afinidade por espaços apolares como membranas e lisossomos. A fotosenssibilização deste composto foi capaz de induzir a morte celular, e esta morte estaria relacionada a uma maior formação de 1O2 e a um maior acumulo de peróxidos. Nestes estudos foi possível demonstrar que carotenóides e sistemas antioxidantes dependentes de glutationa foram capazes de proteger contra os efeitos tóxicos da fotosensibilização na presença de RB. Adicionalmente foram avaliados os efeitos da hemoglobina (Hb) e do hidroperóxido do ácido linoléico (LAOOH) em uma série de parâmetros toxicológicos, como citotoxicidade, estado redox, a peroxidação lipídica e dano ao DNA. Nós demonstramos que a pré-incubação das células com Hb e sua posterior exposição à LAOOH (Hb + LAOOH) levou a um aumento na morte celular, a oxidação do DCFH, formação de malonaldeído e fragmentação do DNA e que esses efeitos estavam relacionados com o grupo peróxido e ao heme presentes na Hb. Foi demonstrado que as células incubadas com LAOOH e Hb apresentaram um nível maior das lesões de DNA; 8-oxo-7,8-diidro-2 \'desoxiguanosina e 1,N2-etheno-2\'-desoxiguanosina. Além disso, as incubações com Hb levaram a um aumento nos níveis de ferro intracelular, e este alto nível de ferro correlacionada com a oxidação do DNA, avaliadas através da medida de sitios EndoIII e Fpg sensíveis. Nossos resultados comprovam que os LAOOHs apresentaram efeito citotóxico e genotóxico, mesmo em concentrações muito baixas, podendo contribuir para o desencadeamento de processos patologicos como o câncer e doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. / The study of the process of lipid peroxidation has increased in recent years, mainly due to the involvement of lipid hydroperoxide (LOOH) in a series of pathological processes. The decomposition of LOOH is able to generate products that can promote damage to biomolecules, including proteins and DNA. In the present work, using linoleic acid hydroperoxide isotopically labeled with 18O2 (LA18O18OH), we demonstrate that these molecules were able to generate labeled singlet oxygen [18(1O2)] in cultured cells. The detection of such species was possible using a new methodology using an anthracene derivative .For this purpose we used the anthracene derivative of 3,3\'-(9,10-antracendiil) bisacrilate (DADB), whose specific reaction product with 1O2 (DADB endoperoxide DADBO2) can be easily detected by HPLC-MS/MS. In order to expand the understanding of the toxic effects of LOOH, we investigated the effect of these compounds generated intracellularly. For this porpoise, we used Rose Bengal (RB), a photosensitizer that has affinity for apolar spaces such as membranes and lysosomes. The photosensitization of this compound was able to induce cell death, and this death was related to increased formation of 1O2 and a higher accumulation of peroxides. In these studies we have shown that carotenoids and glutathione-dependent antioxidant systems were capable of protecting against the toxic effects of photosensitization in the presence of RB. Additionally, we evaluated the effects of hemoglobin (Hb) and linoleic acid hydroperoxide (LAOOH) in a series of toxicological endpoints such as cytotoxicity, redox status, lipid peroxidation and DNA damage. We demonstrated that preincubation of cells with Hb and its subsequent exposure to LAOOH (Hb + LAOOH) led to an increase in cell death, DCFH oxidation, formation of malonaldehyde and DNA fragmentation, and that these effects were related to the peroxide and the heme group. It was demonstrated that cells incubated with LAOOH and Hb showed a higher level of the DNA lesions, 8-oxo-7,8-dihydro-2\'deoxyguanosine and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine. Furthermore, incubations with Hb led to an increase in intracellular iron levels, and this high level of iron correlates with the oxidation of DNA, measured as EndoIII and Fpg-sensitive sites. Our results show that the LOOHs showed cytotoxic and genotoxic, even at very low concentrations and may contribute to the onset of chronic malignancies like cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases.

O oxigênio molecular eletronicamente excitado ao estado singlete 1Δg (1O2) é bastante reativo frente a moléculas orgânicas com alta densidade eletrônica. As reações do 1O2 com o ácido desoxirribonucleico (DNA) têm sido estudadas extensivamente, uma vez que, provocam lesões que têm sido relacionadas com diversos processos citotóxicos e patológicos. Esse trabalho visou estudar os mecanismos pelos quais ocorrem os processos de oxidação de bases do DNA por 1O2. Para isso, um parâmetro essencial foi a identificação dos produtos de oxidação gerados na reação dessa biomolécula com 1O2. Foi desenvolvida uma fonte de 1O2, com caráter não-iônico, preparada com oxigênio-18 molecular e a N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1 ,4-naftilideno) dipropanamida (DHPN18O2 ). A fonte é capaz de gerar 1O2 isotopicamente marcado (18[1O2]). A incubação de DNA de timo de bezerro e células de fibroblastos com os endoperóxidos hidrofílicos do 3,3\'-(1 ,4-naftilideno)dipropanoato de sódio (NDPO2) e da N, N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\' -( 1,4-naftilideno )dipropanamida (DHPNO2), como fontes puras de 1O2, mostrou que a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é a lesão majoritária. Quando o DHPNO2 foi usado, níveis mais altos de 8-oxodGuo foram detectados devido ao seu maior rendimento de formação de 1O2 e por ser capaz de penetrar em células. O uso do DHPN 18O2 na incubação de células demonstrou que o 1O2 lesa diretamente o DNA nuclear e forma 8-oxodGuo com oxigênio-18 incorporado. A identificação dos principais produtos de oxidação da 8-oxodGuo por 1O2 ou 18[1O2] foi feita usando análises de HPLC e espectrometria de massas em tandem com ionização por electrospray. Dessa forma, a imidazolona, oxazolona e os diastereoisômeros da espiroiminodihidantoína marcados com oxigênio-18 foram detectados. Além disso, foi caracterizado um nucleosídeo modificado que exibe as características da guanidinohidantoína oxidada. O uso do EAS para captação de 1O2 em sistemas aquosos e detecção do produto EASO2 por HPLC e espectrometria de massas possibilitou mostrar que a decomposição espontânea de ONOO- não gerava 1O2. O trabalho desenvolvido contribuiu na elucidação de algumas propostas fundamentais para esclarecer os mecanismos que envolvem a geração do 1O2 e sua interação com o DNA. A compreensão desses processos é importante para desvendar fenômenos biológicos importantes como envelhecimento e câncer. / Singlet oxygen (1O2) exhibits a substantial reactivity towards electron-rich organic molecules. Since DNA damage has been related to aging, cancer and other cytotoxic effects, its reaction with 1O2 have been extensively studied. Although, the mechanism and products of these reactions are not yet completely elucidated. The aim of the present work was to study the mechanism of DNA oxidation by 1O2. Emphasis was placed on the identification of the main products generated by the reaction of 1O2 with DNA. For this purpose, we developed a water-soluble naphthalene endoperoxide, the DHPN18O2, whose thermodecomposition leads to the formation of isotopically labeled singlet oxygen (18[1O2]). Calf thymus DNA and fibroblast cells were incubated with the hydrophilic endoperoxides NDPO2 and DHPNO2, as chemical generators of pure 1O2. It was found that 8-oxodGuo is the major 1O2-mediated DNA damage product. In order to demonstrate that 1O2 is directly involved in the formation of 8-oxodGuo, the DHPN18O2 was used. Incubation of the cells with such a generator of 18[1O2] resulted in the formation of 18O-labeled 8-oxodGuo in the nuclear DNA, clearly demonstrating that 1O2, when released within cells, is able to directly oxidize cellular DNA. The qualitative identification of the 1O2-oxidation products of 8-oxodGuo was achieved using HPLC coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry. Thus, the [18O]-labeled and unlabeled imidazolone, oxazolone, together with the diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides, were detected as the main degradation products. In addition, a modified nucleoside that exhibits similar features than those of the oxidized guanidinohydantoin molecule was also produced. In this way, we contributed in the elucidation of some proposals of great importance to clarify the mechanisms that are involved in the interaction of 1O2 with DNA.

Neste trabalho avaliamos a formação de oxigênio singlete in vitro em fagócitos, (células mononucleares e neutrófilos) isolados de sangue periférico humano, e eosinófilos, de lavado bronco alveolar de camundongos balb/c, ativados por estímulo partículado: zimosan opsonizado contendo o 9,10difenilantraceno (DPA) adsorvido como sonda captadora de 1O2. Por este método, a formação do 1O2 pode ser verificada pela formação do 9,10-difenilantraceno endoperóxido (DPAO2), que é detectado por HPLC. Observamos, que os fagócitos formam 1O2 e que esta formação parece ocorrer de forma diferenciada para os dois tipos celulares (neutrófilos e células mononucleares). Visando ampliar os estudos anteriores sobre o papel da melatonina (MLT) no processo inflamatório, foi testado seu efeito em fagócitos e a relação na produção de 1O2 destas células. Observamos que MLT inibe a formação de 1O2 totalmente no caso de neutrófilos e parcialmente no caso de células mononucleares e eosinófilos. Paralelamente, foi desenvolvida a síntese de um novo captador químico de 1O2, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE), cuja finalidade principal é o acúmulo no interior da célula, depois de sofrer hidrólise enzimática. Esta sonda, terá facil acesso ao interior das células em sua forma ester. Este novo captador de 1O2 foi testado em células mononucleares e neutrófilos estimulados de formas diferentes: via receptor independente e dependente. Os resultados demonstraram produção equivalente de 1O2 nestes fagócitos. / In this study, we evaluated the singlet oxygen (1O2) formation in vitro from phagocytes (neutrophils and mononuclear cells) isolated from human blood cells and eosinophils isolated from bronchoalveolar lavage fluid of mice balb/c activated, by opsonized zymosan. To determine whether singlet oxygen is produced by phagocytes, zymosan particles were coated with a specific chemical trap for 1O2, 9,10-diphenylanthracene (DPA). The production of 1O2 was followed using HPLC, to measure its product, 9,10-diphenylanthracene endoperoxide (DPAO2). We also noticed that the 1O2 production occurs at different levels of for two cell types, neutrophils and mononuclear cells. In order to broaden previous studies on the role of melatonin (MLT) in inflammatory processes, its effect was tested in phagocytes was tested in relation to 1O2 formation by these cells. We observed that MLT inhibits the 1O2 formation totallymt neutrophils and partiallym mononuclear cells and eosinophils. At the some time, it was also developed the synthesis of a new probe for 1O2, the 9,10-anthracene-bis-3-ethyl-propionate (ABEP), with the purpose to accumulate inside the cells, after its enzymatic hydrolysis. This probe presents easy acess to the inferior of the cells in its ester form. This new probe for trapping 1O2 was tested in mononuclear cells and neutrophils stimulated in two ways: via independent and dependent receptor. The results showed equivalent production of 1O2 for both cell types.

Neste trabalho são apresentados estudos do efeito de interfaces nas propriedades fotofísicas e fotoquímicas do azul de metileno (AM) e de derivados fenotiazínicos com o intuito de avaliar o potencial destes compostos como fotossensibilizadores (FS) em terapia fotodinâmica. As propriedades físico-químicas do AM foram estudadas em soluções de SOS e observou-se que a presença do AM em solução altera o equilíbrio entre as micelas de SOS, diminuindo o valor da concentração micelar crítica de 7mmolL-1 para 70µmoIL-1. A presença das micelas em solução também interfere nas propriedades do AM. Em baixas concentrações de SOS há formação de dímeros de AM, constatados pelo aumento da absorbância em 580nm e diminuição da emissão de fluorescência. A caracterização das espécies transientes mostrou a existência de moléculas de azul de metileno no estado triplete (3AM) e de oxigênio singlete em soluções com altas concentrações de SOS e a formação de espécies radicalares do AM em baixas concentrações do tensoativo. Esta observação sugere que o mecanismo fotoquímico do AM é dependente da sua concentração local próxima de interfaces carregadas. As interações do AM e de alguns de seus derivados fenotiazínicos (tionina, azure A e azure B) com vesículas e com células HeLa foram estudadas e em ambos os casos observou-se que as moléculas com estruturas assimétricas são incorporadas em maior extensão. Em estudos de fototoxicidade, os compostos assimétricos apresentaram maior nível de morte celular do que o verificado para os compostos simétricos. Entretanto, ao se considerar a incorporação em células, os compostos simétricos se mostraram mais eficientes por molécula. Foi desenvolvido um método para determinação do 10gP dos fotossensibilizadores (FS) por voltametria com microeletrodos que se mostrou reprodutível. Novos FSs assimétricos derivados do Azure A com duas caudas hidrofóbicas de 4, 6 e 8 carbonos (AzC4, AzC6 e AzC8) foram sintetizados. Esses novos compostos possuem eficiências de fluorescência semelhantes ao AM. O composto AzC4 apresenta eficiência de geração de oxigênio singlete bem próxima à do AM (0,56), enquanto os outros dois compostos têm uma eficiência de geração de oxigênio singlete cerca de duas vezes menor. Este comportamento se deve ao fato dos FSs com cadeias carbônicas maiores interagirem mais fortemente entre si, apresentando maior grau de agregação. Os compostos sintetizados apresentam maior incorporação em vesículas que os compostos anteriormente estudados, indicando que a assimetria da molécula favorece a incorporação, assim como, o comprimento da cadeia hidrofóbica. Resultados de incorporação em células HeLa, mostraram que o composto AzC4 interage mais facilmente com a membrana celulare apresenta maior nível de morte celular devido à sua maior incorporação. / The effect of interfaces on photophysical and photochemical properties of methylene blue (MB) and its derivatives was studied in this work, aiming to emploit their potencial as photosensitizers (PS) in photodynamic therapy.The presence of MB in SDS solutions affect the micelle equilibrium decreasing the apparent critical micelle concentration of SDS from 7mmolL-1 to 70µmoIL-1. The properties of MB were also affected. At low SDS concentrations the formation of MB dimers was detected by the increase in the absorption in 580 nm and decrease of fluorescence emission. The characterization of transient species of MB showed the existence of MB molecules in the triplet state and emission of singlete oxygen at large SDS concentration and the formation of MB radicals in small surfactant concentration. These observations suggest that the photochemical mechanism of MB depends on its local concentration close to charged interfaces.The interactions of MB as well as other phenotiazine derivatives with synthetic vesicles and HeLa cells were studied. In both cases, the PS with asymmetrical structure presented higher degrees of incorporation. Studies of phototoxicity showed that the PS with asymmetrical structures present higher degree of cell death than the symmetrical compounds. However, if one consider the degree of incorporation the symmetrical compounds are more efficient per molecule. A method to determinate logP by voltammetry with microelectrodes was developed, showing good repeatability. New asymmetric photosensitizers derived from Azure A with two hydrophobic chains of 4, 6 or 8 carbons (AZC4, AZC6 e AzC8) were synthesized in order to study structure/activity relationship. These new compounds presented similar fluorescence efficiency to MB. The oxygen singlet generation efficiency of AZC4 is similar to MB, while the efficiency of the other PSs was twice smaller. This behavior was explained in terms PS aggregation, due to their longer hydrophobic chains. The synthesized PSs presented larger degree of incorporation than the commercial PSs, showing the role of asymmetry and hydrophobicity in incorporation yields. Incorporation in HeLa cells showed that AZC4 interacts more strongly with cells than the other synthesized PSs due to the rigidity of plasmatic membrane. Under the same illumination conditions, AzC4 was the PS that presented higher degree of cell death as a result of its larger incorporation in cells.

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luz / Electronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to light

O oxigênio molecular eletronicamente excitado ao estado singlete 1Δg (1O2) é bastante reativo frente a moléculas orgânicas com alta densidade eletrônica. As reações do 1O2 com o ácido desoxirribonucleico (DNA) têm sido estudadas extensivamente, uma vez que, provocam lesões que têm sido relacionadas com diversos processos citotóxicos e patológicos. Esse trabalho visou estudar os mecanismos pelos quais ocorrem os processos de oxidação de bases do DNA por 1O2. Para isso, um parâmetro essencial foi a identificação dos produtos de oxidação gerados na reação dessa biomolécula com 1O2. Foi desenvolvida uma fonte de 1O2, com caráter não-iônico, preparada com oxigênio-18 molecular e a N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1 ,4-naftilideno) dipropanamida (DHPN18O2 ). A fonte é capaz de gerar 1O2 isotopicamente marcado (18[1O2]). A incubação de DNA de timo de bezerro e células de fibroblastos com os endoperóxidos hidrofílicos do 3,3\'-(1 ,4-naftilideno)dipropanoato de sódio (NDPO2) e da N, N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\' -( 1,4-naftilideno )dipropanamida (DHPNO2), como fontes puras de 1O2, mostrou que a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é a lesão majoritária. Quando o DHPNO2 foi usado, níveis mais altos de 8-oxodGuo foram detectados devido ao seu maior rendimento de formação de 1O2 e por ser capaz de penetrar em células. O uso do DHPN 18O2 na incubação de células demonstrou que o 1O2 lesa diretamente o DNA nuclear e forma 8-oxodGuo com oxigênio-18 incorporado. A identificação dos principais produtos de oxidação da 8-oxodGuo por 1O2 ou 18[1O2] foi feita usando análises de HPLC e espectrometria de massas em tandem com ionização por electrospray. Dessa forma, a imidazolona, oxazolona e os diastereoisômeros da espiroiminodihidantoína marcados com oxigênio-18 foram detectados. Além disso, foi caracterizado um nucleosídeo modificado que exibe as características da guanidinohidantoína oxidada. O uso do EAS para captação de 1O2 em sistemas aquosos e detecção do produto EASO2 por HPLC e espectrometria de massas possibilitou mostrar que a decomposição espontânea de ONOO- não gerava 1O2. O trabalho desenvolvido contribuiu na elucidação de algumas propostas fundamentais para esclarecer os mecanismos que envolvem a geração do 1O2 e sua interação com o DNA. A compreensão desses processos é importante para desvendar fenômenos biológicos importantes como envelhecimento e câncer. / Singlet oxygen (1O2) exhibits a substantial reactivity towards electron-rich organic molecules. Since DNA damage has been related to aging, cancer and other cytotoxic effects, its reaction with 1O2 have been extensively studied. Although, the mechanism and products of these reactions are not yet completely elucidated. The aim of the present work was to study the mechanism of DNA oxidation by 1O2. Emphasis was placed on the identification of the main products generated by the reaction of 1O2 with DNA. For this purpose, we developed a water-soluble naphthalene endoperoxide, the DHPN18O2, whose thermodecomposition leads to the formation of isotopically labeled singlet oxygen (18[1O2]). Calf thymus DNA and fibroblast cells were incubated with the hydrophilic endoperoxides NDPO2 and DHPNO2, as chemical generators of pure 1O2. It was found that 8-oxodGuo is the major 1O2-mediated DNA damage product. In order to demonstrate that 1O2 is directly involved in the formation of 8-oxodGuo, the DHPN18O2 was used. Incubation of the cells with such a generator of 18[1O2] resulted in the formation of 18O-labeled 8-oxodGuo in the nuclear DNA, clearly demonstrating that 1O2, when released within cells, is able to directly oxidize cellular DNA. The qualitative identification of the 1O2-oxidation products of 8-oxodGuo was achieved using HPLC coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry. Thus, the [18O]-labeled and unlabeled imidazolone, oxazolone, together with the diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides, were detected as the main degradation products. In addition, a modified nucleoside that exhibits similar features than those of the oxidized guanidinohydantoin molecule was also produced. In this way, we contributed in the elucidation of some proposals of great importance to clarify the mechanisms that are involved in the interaction of 1O2 with DNA.