Prokaryotic and eukaryotic organisms respond to various stresses with the production of heat shock proteins (HSPs). HSPs are molecular chaperones that bind to unfolded proteins and inhibit their aggregation as well as maintaining their solubility until they can be refolded to their original conformation. Stress-inducible hsp gene transcription is mediated by the heat shock element (HSE), which interacts with heat shock transcription factor (HSF). In this study, we examined the effect of KNK437 (N-formyl-3,4-methylenedioxy-benzylidene-g-butyrolactam), a benzylidene lactam compound, on heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A-induced hsp gene expression in Xenopus laevis A6 kidney epithelial cells. In studies limited to mammalian cultured cells, KNK437 has been shown to inhibit HSE-HSF1 binding activity and stress-induced hsp gene expression. In the present study, western and northern blot analysis revealed that exposure of A6 cells to heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A induced the accumulation of HSP30 protein and hsp30 mRNA, respectively. Western blot analysis also determined that exposure of A6 cells to heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A induced the accumulation of HSP70 protein. Pre-treatment of A6 cells with 100 µM KNK437 inhibited stress-induced hsp30 mRNA as well as HSP30 and HSP70 protein accumulation. Immunocytochemistry and confocal microscopy were used to confirm the results gained from western blot analysis as well as determine the localization of HSP30 accumulation in A6 cells. A 2 h heat shock at 33°C resulted in the accumulation of HSP30 in the mostly in the cytoplasm with a small amount in the nucleus. Heat shock at 35°C resulted in substantial HSP30 accumulation in the nucleus. This is in contrast with A6 cells treated for 14 h with 10 µM sodium arsenite, 100 µM cadmium chloride and 1 µg/mL herbimycin A, where HSP30 accumulation was found only in the cytoplasm and not in the nucleus. A 6 h pre-treatment with 100 µM KNK437 completely inhibited the accumulation of HSP30 in A6 cells heat shocked at 33 or 35°C as well as cells treated with 1 µg/mL herbimycin A. The same pre-treatment with KNK437 resulted in a 97-100% decrease in HSP30 accumulation in A6 cells treated with 10 µM sodium arsenite or 100 µM cadmium chloride. These results show that KNK437 is effective at inhibiting both heat shock and chemical induced hsp gene expression in amphibian cells.

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics. / Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the -crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole -crystallin domain in E. coli cells shows that most of the -crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the -crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.

Die erfolgreiche Synthese und Faltung von Proteinen ist eine Voraussetzung der Zellfunktion und ein Versagen der Proteinhomöostase führt zu Krankheit oder Tod. In der Zelle sichern molekulare Chaperone die korrekte Faltung der Proteine oder tragen zur Entsorgung unwiederbringlich fehlgefalteter Proteinsubstrate bei. Unter diesen Chaperonen sind kleine Hitzeschockproteine (sHsp) ein ATP-unabhängiger Teil des Proteostasenetzwerks. In dieser Arbeit habe ich das bisher wenig erforschte sHsp HSP-17 aus C. elegans untersucht. Im Gegensatz zu anderen sHsps zeigte HSP-17 nur eine geringe Aktivität beim Verhindern der Aggregation von Proteinsubstraten. Stattdessen konnte ich in vitro zeigen, dass HSP-17 die Aggregation von Modellsubstraten fördert, was hier für Metazoen-sHsps erstmals gezeigt wurde. HSP-17 kopräzipitiert mit Substraten und modifiziert deren Aggregate möglicherweise. HSP-17 kolokalisiert in vivo mit Aggregaten, und seine aggregationsfördernde Aktivität konnte ich für das physiologische Substrat KIN-19 und heterolog exprimierte polyQ-Peptide validieren. Durch ex vivo Analysen konnte ich zeigen, dass die Aktivität von HSP-17 für die Fitness relevant ist  In einem zweiten Projekt habe ich zur Entwicklung eines neuen Modelles für Aß-Pathologie in C. elegans beigetragen, welches substöchiometrische Markierungen verwendet, um eine zeitnahe Visualisierung der Aß-Aggregation in spezifischen Zelltypen zu ermöglichen. Das Modell spiegelt bekannte Phänotypen der Aß-Proteotoxizität aus Menschen und bestehenden C. elegans Aß-Stämmen wider. Interessanterweise zeigt eine Untergruppe der Neuronen, die IL2-Neuronen, eine höhere Anfälligkeit für die Aggregation und Proteotoxizität von Aß1-42. Eine gezielte Reduktion von Aß1-42 in IL2 Neuronen führt zu einer systemischen Reduktion der Pathologie. Somit bietet das Modell eine neue Plattform, um die Bedeutung molekularer Chaperone, wie z. B. der sHsps, für Amyloidosen zu untersuchen, auch im Hinblick auf menschliche Erkrankungen. / Successful synthesis and folding of proteins is a prerequisite for cellular function and failure of protein homeostasis leads to disease or death. Within the cell, molecular chaperones ensure correct protein folding or aid in the disposal of terminally misfolded protein substrates. Among these chaperones, small heat shock proteins (sHsps) are ATP-independent members of the proteostasis network. In this work, I analyzed the so far under-researched C. elegans sHsp HSP-17. Unlike other sHsps, HSP-17 exhibited only weak activity in preventing aggregation of protein substrates. Instead, I could show in vitro that HSP-17 can promote the aggregation of protein substrates, which is the first demonstration for metazoan sHsps. HSP-17 co-precipitates with substrates and potentially modifies the aggregates.  HSP-17 colocalizes with aggregates and pro-aggregation activity is present in vivo, which I demonstrated for the physiological substrate KIN-19 and heterologously expressed amyloidogenic polyQ peptides. By physiological, biochemical and proteomic analysis I showed that HSP-17 activity is relevant for organismal fitness In a second project, I contributed to the development and characterization of a novel model of Aß pathology in C. elegans. This new AD model employs sub-stoichiometric labeling to allow live visualization of Aß aggregation in distinct cell types. The model mirrors known phenotypes of Aß proteotoxicity in humans and existing C. elegans Aß strains. Interestingly, a subset of neurons, the IL2 neurons, is shown to be more vulnerable to Aß proteotoxicity and targeted depletion of Aß in these neurons systemically ameliorates pathology. Thereby, the model presents a new platform to assess the relevance of molecular chaperones such as sHsps in amyloidosis with a perspective on human disease.

Strukturelle Untersuchungen mittels Lösungs-NMR Spektroskopie sind für supramolekulare Maschinen mit Molekulargewichten von mehr als 150 kDa nur beschränkt möglich. Die Festkörper-NMR mit Probenrotation im sogenannten magischen Winkel (MAS) stellt dagegen eine molekulargewichtsunabhängige Methode dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, die die MAS NMR Spektroskopie an supramolekularen Komplexen in Lösung erlaubt. Proteinlösungen bilden demnach durch MAS und dessen Ultrazentrifugationseffekt homogene Proteinsedimente aus, in denen die rotatorische Diffusion großer Proteinkomplexe überwiegend aufgehoben ist. Auf diese Weise können klassische Festkörper-NMR Methoden angewandt werden, ohne dass Präzipitations- oder Kristallisationsverfahren erforderlich sind. In Kombination mit Proteindeuterierung, Protonendetektion sowie paramagnetischer Relaxationsverstärkung ermöglichte diese neuartige Methode die Zuordnung von Rückgrat-Amidresonanzen des 20S Proteasoms mit einem Molekulargewicht von 1,1 MDa. Weiterhin wurde diese Methode zur Untersuchung des kleinen Hitzeschockproteins alpha-B-Crystallin und dessen Cu(II)-Bindungseigenschaften genutzt. Das Chaperon (600 kDa) spielt eine wesentliche Rolle in der zellulären Proteinhomeostase. Verschiedenste NMR Techniken und andere biophysikalische Methoden zeigen, dass die konservierte alpha-Crystallin-Domäne ein Cu(II)-Ion nahe der Monomer-Monomer Interaktionsfläche mit pikomolarer Affinität bindet. Die Cu(II)-induzierte Freilegung von Substrat-Interaktionsflächen und Veränderungen in der dynamischen Quartärstruktur modulieren so die oligomere Architektur und die Chaperonaktivität von alpha-B-Crystallin. Die hier erstmals beschriebene MAS NMR Spektroskopie von sedimentierten Biomolekülen legt einen wichtigen Grundstein für zukünftige Struktur- und Dynamikuntersuchungen an großen molekularen Maschinen. / Structural investigations of large biomolecules by solution-state NMR are challenging in case the molecular weight of the complex exceeds 150 kDa. Magic-angle-spinning (MAS) solid-state NMR is a powerful tool for the characterization of biomolecular systems irrespective of their molecular weight. In this work, an approach was developed, which enables the investigation of supramolecular modules by MAS NMR. Protein solutions can yield fairly homogeneous sediments due to the ultracentrifugal forces during MAS. Since rotational diffusion is impaired, typical solid-state NMR techniques can thus be applied without the need of precipitation or crystallization. This new approach in combination with protein deuteration, proton-detection and paramagnetic relaxation enhancement enabled the observation and the assignment of backbone amide resonances of a 20S proteasome assembly with a molecular weight of 1.1 MDa. Similarly, the approach was used to characterize the small heat-shock protein alpha-B-crystallin with respect to its Cu(II)-dependent chaperone activity. The chaperone (600 kDa) plays an essential role in cellular protein homeostasis. We show that the conserved alpha-crystallin core domain is the elementary Cu(II)-binding unit specifically coordinating one Cu(II) ion near to the dimer interface with picomolar binding affinity. We suggest that Cu(II)-binding unblocks potential client binding sites and alters quaternary dynamics of both the dimeric building block as well as the higher-order assemblies of alpha-B-crystallin. In summary, MAS NMR employed to biomolecules in solution is a very promising tool to explore structural and dynamic properties of large biological machines with no upper size limit.