Au sein des tumeurs, y compris pour le carcinome hépatocellulaire (CHC), des sous-populations de cellules néoplasiques ont révélé une grande capacité à initier de nouvelles tumeurs et à induire des métastases. Les premières études sur ces cellules ont rapidement montré que la présence de ces cellules était déterminante dans le développement tumoral et elles ont donc été renommées « cellules souches cancéreuses » (CSCs). Malheureusement les mécanismes impliqués dans la maintenance de ces CSCs ne sont que partiellement compris. Par ailleurs dans le CHC un lien a été établi entre les signaux du facteur de croissance de transformation (Transforming Growth Factor, TGF-ß) provenant du microenvironnement tumoral et certaines populations de cellules cancéreuses dont la présence est corrélée à un faible pronostic. La façon dont TGF-ß peut ainsi établir et modifier un phénotype cellulaire dans le CHC reste néanmoins obscure. La méthylation de l’ADN étant un acteur majeur dans la mise en place des programmes cellulaires, notre but a été de caractériser le méthylome de CSCs hépatiques et son lien avec la capacité de TGF-ß à induire des CSCs. Nous nous sommes appuyés sur l’expression du marqueur CD133 pour définir la population de CSCs hépatiques. Afin comprendre l’importance des marques de méthylation de l’ADN dans les CSCs hépatiques, nous avons dans un premier temps déterminé quelle était la signature des cellules CD133+ au niveau de la méthylation de l’ADN en utilisant des puces de méthylation à grande échelle. Les sites CpG différentiellement méthylés ont montré un enrichissement pour d’une part des voies de signalisation déjà identifiées dans les CSCs et, d’autre part, pour des voies de signalisation associées au processus inflammatoire dont la voie TGF-ß/SMAD. Par la suite, nous avons montré que TGF-ß pouvait induire de façon permanente les cellules CD133+ contrairement à une autre cytokine influente dans le cancer du foie, l’interleukine 6. Cette augmentation de cellules CD133+ induite par TGF-ß est associée à des changements de méthylation de l’ADN sur l’ensemble du génome et qui sont, de plus, maintenus au cours des divisions cellulaires. La comparaison entre les deux méthylomes (liés aux cellules CD133+ et à l’action de TGF-ß) a exposé une signature commune significative indiquant que TGF-ß pourrait promouvoir le phénotype de CSC via le processus de méthylation de l’ADN. Mais nous avons également déterminé qu’une grande partie des effets sur la méthylation induits par TGF-ß était totalement indépendante de l’induction de cellules CD133+. Enfin, nous avons observé que les sites de méthylation sensibles au signal de TGF-ß étaient regroupés de façon significative au niveau de régions « enhancer » qui régulent la transcription des gènes. Par ailleurs, ces sites incluaient également des gènes précédemment identifiés comme cibles de TGF-ß mais aussi des gènes codant pour des acteurs épigénétiques de premier ordre comme les méthyltransférases de l’ADN. Ces résultats constituent la première description d’une signature de méthylation de l’ADN induite par TGF-ß permettant une reprogrammation stable vers un profil épigénétique de CSC hépatiques. / Distinct subpopulations of neoplastic cells within tumors, including hepatocellular carcinoma (HCC), display a pronounced ability to initiate new tumors and induce metastasis. Investigations on theses cells rapidly described them as essential for tumor growth and based on theses observations they have been named “cancer stem cells” (CSCs). Unfortunately, the mechanisms involved in sustaining their programs are only partially known. In HCC, there is an established link between microenvironmental signals from Transforming Growth Factor beta (TGF-ß) and survival of certain cell subpopulations which is results in a bad prognosis. However, how TGF-ß establishes and modifies cell behavior in HCC is not fully understood. As DNA methylation is involved in establishing cellular programs, our aim was to characterize the methylome of putative liver CSCs, and its link to the ability of TGF-ß to induce liver CSCs. We used CD133 expression as a positive marker for liver CSC. To understand the relevance of DNA methylation programs in liver CSCs, we first defined the methylome signature of CD133+ cells in liver cancer cells using methylation bead arrays. Differentially methylated CpG sites were enriched in known pathways related to CSC survival and to inflammation, including the TGF-ß/SMAD pathway. Next, we showed that TGF-ß persistently induces CD133+ cells in opposition to another cytokine related to HCC, interleukin 6. We observed that this increase is associated with genome-wide changes in the methylome induced by TGF-ß and that are perpetuated through cell division. We observed a significant overlap between the CD133+ methylome and the methylome induced by TGF-β, indicating that TGF-ß may induce CSC phenotype through DNA methylation reprogramming. Additionally, we observed genome-wide effects of TGF-ß that are independent of the induction of CD133. Finally, TGF-ß methyl-sensitive sites were significantly concentrated in enhancer regions of the genome, and include well-known targets of TGF-ß, and epigenetic players, such as de novo DNA methyl-transferases. In conclusion our results are the first indication of the ability of TGF-ß to induce genome-wide changes of DNA methylation, leading to a stable switch to a liver cancer stem cell epigenetic program.

Pour étudier le rôle de c-Jun dans les macrophages, nous avons développé deux modèles murins présentant une délétion spécifique de Jun dans la lignée de cellules myéloïdes. Le 1er modèle (JunΔCsf1r) a une délétion de c-Jun dans les cellules myéloïdes et leurs progéniteurs. Le 2nd modèle (JunΔLyz2) a une perte de c-Jun dans les cellules myéloïdes matures. L'analyse de ces modèles a montré que l'expression de c-Jun n'est pas nécessaire à l'homéostasie des macrophages tissulaires, mais est essentiel à l'expansion des macrophages de la MO et des progéniteurs de la rate. De plus, l'absence d'expression de c-Jun dans les macrophages inhibe leur prolifération induite par le facteur de croissance Csf1 in vitro. Et nous avons montré que ce défaut de prolifération était indépendant de JNK. Par ailleurs, mes travaux ont révélé que c-Jun est nécessaire pour inhiber l'expression basale des inhibiteurs du cycle cellulaire dans les macrophages, en particulier p16 qui joue un rôle important dans la sénescence cellulaire et dans la perte de la capacité de prolifération.Enfin, l'absence de c-Jun induit l'accumulation de cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans la MO des souris JunΔCsf1r, mais aussi une diminution des progéniteurs myéloïdes (GMP/CMP). Des expériences effectuées sur des souris chimériques reconstituées avec un mélange de cellules précurseurs de MO de souris JunΔCsf1r et de souris contrôles en proportions égales ont montré que les HSCs n'exprimant pas c-Jun présentent un défaut de reconstitution de toutes les lignées hématopoïétiques, suggérant ainsi un rôle important de c-Jun dans l'homéostasie et dans la fonction des cellules souches hématopoïétiques. / To study the role of c-Jun in macrophages we have generated mice with a targeted deletion of Jun in the myeloid lineage. We used two transgenic mice: (JunΔCsf1r) where c-Jun is deleted in all myeloid cells and their progenitors, or the (JunΔLyz2) mice where c-Jun is deleted in mature myeloid cells. My analysis showed that c-Jun expression is not required for the maintenance of tissue macrophages, however it is critical for macrophage expansion from BM and splenic progenitors. There was a strong reduction in accumulation of monocyte-derived macrophages in mice where c-Jun expression was deleted in myeloid progenitors (JunΔCsf1r), compared to littermate control mice or the deletion of c-Jun in mature myeloid cells (JunΔLyz2). My further experiments showed that the deletion of c-Jun in macrophages inhibited Csf1-mediated proliferation in vitro. Activation of c-Jun is regulated by Jun N-terminal kinase (JNK), I showed in my experiments that the role of c-Jun in macrophage proliferation was JNK-independent. I show that c-Jun in macrophages is required to repress basal expression of cell cycle inhibitors, as p16, which is linked to cell senescence and loss of proliferative capacity.Finally, we observed that loss of c-Jun results in accumulation of hematopoietic stem cells (HSC) in the BM of JunΔCsf1r mice, but associated with a decrease in myeloid progenitors (GMP and CMP). Furthermore, competitive radiation-chimera experiments showed c-Jun deficient HSC are defective in their ability to repopulate all haematopoietic lineages, suggesting c-Jun has an important role in HSC homeostasis and function.

La thérapie cellulaire pour le traitement de l'insuffisance cardiaque post-infarctus semble prometteuse même si le bénéfice fonctionnel observé actuellement en recherche clinique reste souvent limité. Parmi les différent types cellulaires utilisables, les cellules souches mésenchymateuses (MSC) reconnues pour leur capacité d'immunomodulation, de transdifférenciation et de sécrétion paracrine représentent un outil intéressant pour la régénération myocardique.L'objectif de ce travail a été de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les MSC pour réparer le myocarde lésé afin de développer ensuite une stratégie visant à optimiser les effets thérapeutiques de la greffe de MSCs dans le cadre expérimental de l'insuffisance cardiaque post-infarctus. Pour cette étude, nous avons réalisé des cocultures entre cardiomyocytes adultes et les MSC dérivées du tissu adipeux, les cellules hMADS (human Multipotent Adipose Derived Stem cells) afin de mimer le microenvironnement cardiaque in vitro. Des travaux antérieurs à ma thèse réalisés au laboratoire avaient montré que la communication intercellulaire entre ces deux types cellulaires grâce à des structures nanotubulaires aboutissait à la reprogrammation du cardiomyocyte vers le stade progéniteur. Durant ma thèse, nous avons ensuite pu montrer in vitro, toujours grâce au système de coculture, que ce meme type de communication hetérologue via des connexions nanotubulaires constituées de f-actine et de tubuline, modifiait la sécrétion paracrine des cellules souches hMADS. Les cellules souches ainsi reprogrammées, par les échanges intercellulaires de matériel cardiaque améliorent de façon significative leur potentiel angiogénique et de chémoattraction in vitro. Le bénéfice sur les MSCs de la coculture a été confirmé dans le traitement de l'insuffisance cardiaque post-infarctus chez la souris. Dans ce modèle nous avons pu montré que les cellules souches cocultivées avaient un capacité de régénération myocardique nettement supérieures aux cellules souches naives et que l'amélioration fonctionnelle était associée à une stimulation de la vascularisation et de la mobilisation des progéniteurs cardiaques endogènes. Enfin, des résultats similaires ont été observés dans notre modèle préclinique d'ischémie-reperfusion myocardique porcin encourageant la poursuite des travaux de recherche basés sur la communication intercellulaire afin d'optimiser l'efficacité thérapeutique des cellules souches dans la reconstruction cardiaque..En conclusion, nos travaux ont mis en évidence que la communication intercellulaire entre les cardiomyocytes souffrants et les cellules souches conditionnent de façon importante les effets thérapeutiques des cellules souches et que la manipulation ex vivo de ces phénomènes pourrait constituer une approche pour optimiser la thérapie cellulaire cardiaque chez l'homme. / Cell therapies represent one of the most promising approaches to rebuild damaged heart particularly those based on mesenchymal stem cells (MSC). These cells are known for their plasticity, immune privilege and strong self-renewal ability. Intramyocardial delivery of MSC ameliorates heart function after infarction in clinical studies but mechanisms by which MSC exert their therapeutic action is far from being understood and further investigations are required for improving the modest efficiency observed.The objective of this work was to better understand mechanisms by which MSC repair damaged myocardium in order to develop strategies optimizing their therapeutic effects. To mimic in vitro the microenvironment of an injured heart, we developed a species mismatch co-culture system consisting of terminally-differentiated cardiomyocytes (CM) and MSC from adipose tissue called hMADS for human Multipotent Adipose Derived Stem cells. Previous works in the laboratory showed that cell-to-cell communication processes between CM and hMADS involving tunnelling nanotubes (TNT) reprogram adult CM toward a progenitor-like state.During my PhD, we found that crosstalk between hMADS and CM through TNT altered the secretion by hMADS of cardioprotective soluble factors and thereby maximized the capacity of stem cells to promote angiogenesis and chemotaxis of bone-marrow multipotent cells. Additionally, engraftment experiments into mouse infracted hearts revealed that in vitro preconditioning of hMADS with CM increased the cell therapy efficacy of naive stem cells. Functional improvement was associated with higher angiogenesis and homing of bone marrow progenitor cells at the infarction site. Finally, similar results were observed in our preclinical study using a porcine model of myocardial infarction.In conclusion, our findings established the relationship between the paracrine regenerative action of MSC and the nanotubular croostalk with CM and emphasize that ex vivo manipulation of theses communication processes might be of interest for optimizing current cardiac cell therapies.

Les différents génotypes de Coronavirus canins (CCoV-I/II) et félins (FCoV-I/II) sont phylogénétiquement proches, suggérant des transmissions inter-espèces entre chiens et chats. Lors d’analyses de séquences menées sur des chats infectés, des souches félines atypiques ont pu être mises en évidence, contenant un gène S de type FCoV-I, un gène N de type CCoV-I, ainsi que la présence du gène ORF3, spécifique à CCoV-I. Dans ces souches, le gène ORF3 est présent avec une ou deux délétions toujours identiques, conduisant à la synthèse de protéines tronquées gp3-Δ1 et gp3-Δ2. Les délétions de protéines accessoires étant déjà impliquées dans les transmissions inter-espèces, une étude de caractérisation de la protéine gp3 et de ses différentes formes a été menée. Les trois protéines s’oligomérisent de manière covalente et sont retenues dans le réticulum endoplasmique, en absence de signal spécifique de rétention. Les délétions influencent le niveau d’expression des protéines en cellules félines, où seule l’expression de gp3-Δ1 est visible, alors qu’elles conservent toutes une expression optimale en cellules canines. En l’absence de souches de Coronavirus cultivables en laboratoire contenant le gène ORF3, des cellules canines exprimant l’une des protéines gp3 ont été infectées par une souche CCoV-II. Dans ce modèle, les protéines gp3 ne modifient pas le cycle viral. Dans un contexte d’émergence de nouveaux Coronavirus, la compréhension des mécanismes moléculaires de changement d’hôte est cruciale et les Coronavirus félins et canins peuvent représenter un modèle d’étude utile. / The different genotypes of canine (CCoV-I/II) and feline (FCoV-I/II) Coronaviruses share a close phylogenetic relationship, suggesting inter-species transmissions between cats and dogs. Through sequence analyses of cat samples, atypical FCoV strains, harbouring an S gene related to FCoV-I, an N gene close to the CCoV-I cluster and the ORF3 gene, peculiar to CCoV-I, were discovered. This ORF3 gene was systematically truncated in feline samples, displaying either one or two identical deletions, leading to the translation of gp3-Δ1 and gp3-Δ2. As deletions in accessory proteins have already been involved in host-switch, studies of the different variants of gp3 were conducted. Results demonstrate that all proteins oligomerize through covalent bonds and are retained in the ER, without any specific retention signal. Deletions influence the expression level with a proper expression of the three proteins in canine cells, whereas only gp3-Δ1 expression is sustained in feline cells. As no isolates of Coronavirus harbouring the ORF3 gene exists, cells expressing the different gp3 proteins have been infected with a CCoV-II strain. In this model, the gp3 proteins do not influence the viral life cycle. In the light of emergence of new Coronaviruses, investigations on their molecular mechanisms during the host-switch are crucial and canine and feline Coronaviruses could represent a useful model.

L’huître creuse Crassostrea gigas est un mollusque hermaphrodite alternatif dont le cycle dereproduction est annuel. Sa gamétogenèse est soutenue par des réserves énergétiques, stockées dansun tissu conjonctif de réserve entourant la gonade. Des travaux antérieurs ont montré l’implication dusystème insuline dans ce processus liant étroitement alimentation, énergie stockée et gamétogenèse.Le fonctionnement des étapes précoces de gamétogenèse reste encore méconnu chez l’huître. Cetravail a permis d’identifier les cellules germinales souches (GSC) et les progéniteurs potentiels en sebasant sur une approche d’histologie quantitative couplée au marquage des cellules germinales par unanticorps homologie anti-Oyvlg (Oyster vasa-like gene). Certains éléments constitutionnels de la nichegerminale ont également été identifiés, notamment la présence d’une cellule somatique associée à lacellule germinale souche potentielle qui présente un marquage par un anticorps hétérologue anti-BMP2/4. En amont de l’étude concernant la régulation des étapes précoces de gamétogenèse par lesvoies des insulines, le criblage in silico des bases de données a permis d’identifier des ligands, unrécepteur et de nombreux effecteurs du signal insuline conservés chez C. gigas. Six IRPs (InsulinRelated Peptides) ont été caractérisés ce qui a permis de retracer l’histoire évolutive des IRPs chez lesmollusques. D’après leur profil d’expression en qPCR et HIS, Cg-mip123 et Cg-ilp sont susceptiblesd’être impliqués dans le contrôle de la reproduction. Ces IRPs peuvent se lier à un récepteur CIR (C.gigas Insulin Receptor) dont la séquence complète a été décrite. Les acteurs des voies de signalisationde l’insuline sont également conservés chez l’huître et exprimés dans la gonade. Pour aller plus loin surle rôle de ces IRPs dans les étapes précoces de gamétogenèse, un conditionnement alimentaire (à jeunvs alimentés en Isochrysis galbana) a été réalisé sur des huîtres en première gamétogenèse. Lesrésultats de ce conditionnement montrent que l’apport nutritif augmente la différenciation des GSCainsi que les proliférations goniales. L’implication du signal insuline dans ce contrôle devra êtreprécisée. / The Pacific oyster Crassostrea gigas is an alternative hermaphrodite mollusc with an annualreproduction cycle. Its gametogenesis is supported by energy reserves, store in a conjunctive storagetissue surrounding the gonad. Previous studies have shown the insulin system involvement in thisprocess closely connecting diet, energy reserves and gametogenesis. The functioning of earlygametogenetic stages stays unknown in the oyster. This work allows the identification of putative germstem cells (GSC) et progenitors on the basis of histological quantitative approach combined with agerm cells labelling by homologous antibody against Oyvlg (Oyster vasa-like gene). The maincomponents of the germinal niche have also been identified including a somatic cell, associated to theputative germ stem cell, with a heterologous antibody against BMP2/4 labelling. Above the study ofthe early gametogenetic stages regulation by insulin signalling, the genomic and transcriptomic-widescreening allows the identification of ligands, receptor et several effectors conserved in C. gigas. SixIRPs (Insulin Related Peptides) have been characterized which inform about the evolutionary history ofmolluscan IRPs. According to the expression profiles, in qPCR and ISH, Cg-mip123 and Cg-ilp may beinvolved in the reproduction process. These IRPs are able to bind the CIR (C. gigas Insulin Receptor)receptor whose sequence has been described. The insulin signalling effectors are also conserved in C.gigas and expressed in the gonad. To better understand the involvement of IRPs in the early stagesfunctioning, a food conditioning (unfed vs fed with Isochrysis galbana) has been done with oysters intheir first gametogenesis. The results showed that nutrient intake increases GSC and gonial mitosis.The involvement of insulin signalling has to be clarified.

Le cartilage articulaire est composé de chondrocytes et d'une matrice extracellulaire organisés de manière stratifiée dans l'épaisseur du tissu. Ce tissu ne se régénère pas de manière efficace après une lésion. L'objectif de ce travail est de construire par pulvérisation des hydrogels à base d'alginate et de film multicouches de polyélectrolytes pour créer in vitro un néotissu pouvant combler des lésions de cartilage articulaire. La méthode a été validée en observant une bonne viabilité et une synthèse matricielle par les cellules, et de meilleures propriétés mécaniques des hydrogels pulvérisés à 0,9 bar par rapport au moulage. Après la pulvérisation de cellules souches mésenchymateuses, les résultats ont montré une bonne viabilité et une différenciation des cellules. Puis, des hydrogels bistratifiés ont été construits et cultivés jusqu'à 56 jours sans dissociation des couches et sans migration des cellules. Enfin, les hydrogels ont été fonctionnalisés en modifiant la composition des couches et en y appliquant des stimulations mécaniques. Les propriétés mécaniques des hydrogels varient en fonction de leur composition et sont meilleures pour ceux stratifiés. De plus, leur stimulation mécanique a permis de potentialiser l'effet du biomatériau sur la différenciation des cellules. En conclusion, cette étude montre que des cellules souches mésenchymateuses ensemencées dans un hydrogel bistratifié pulvérisé sont fonctionnelles en termes de différenciation chondrocytaire et de synthèse matricielle. Les propriétés mécaniques des hydrogels stratifiés ne sont pas altérées. De plus, la stimulation mécanique a potentialisé la différenciation des cellules / The articular cartilage is composed of chondrocytes and of a specific extracellular matrix which are organized depth-dependently. The tissue did not have an efficient self-renewal of defects. The purpose of this study is to build up layer-by-layer a stratified hydrogel by alternating gels and multilayers polyelectrolytes film spraying, in order to obtain a neotissu in vitro to fill lesions. First, the process was validated by observing a good cells viability and matrix synthesis, and stronger mechanical behaviors of sprayed hydrogels compared to molded one. Secondly, after their spraying, mesenchymal stem cells still have a good viability and their differentiation potential. Then, bistratified scaffolds were built up and cultured up to 56 days without layers dissociation and without cells migration between layers. Finally, scaffolds were functionalized by changing biomaterial composition and by applying mechanicals stimulations. Results show us not only that the composition influences the mechanical behavior of the hydrogel, but that the stratification did not affect it. Furthermore, mechanicals stimulations improve stem cells differentiation in function of biomaterials compositions. In conclusion, this study proves not only that we are able to build up stratified scaffold seeded with mesenchymal stem cells which still have their differentiation capability and synthesize matrix, but that mechanical behaviors are improved after the biomaterial spraying and not alter by the stratification. Moreover, mechanical stimulation applied to the scaffold improves the differentiation of mesenchymal stem cells to a chondrogenic phenotype

En ingénierie tissulaire, les biomatériaux, les cellules et l'induction de la différenciation, sont des facteurs à prendre en compte. L'objectif de cette étude est de connaitre l'effet de la nature des biomatériaux et leurs propriétés mécaniques sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet d'un biomatériau de nature protéique (le collagène de type I) supplémenté en microparticules d'hydroxyaptatite (HAP). Nous avons constaté que l'ajout d'HAP améliore les propriétés mécaniques de ce biomatériau et engage la différenciation des cellules vers des phénotypes ostéoarticulaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'effet d'un biomatériau à base d'alginate supplémenté par de l'acide hyaluronique ou des microparticules d'HAP, en utilisant un plan d'expériences pour choisir les matrices convenables pour l'étude biologique en fonction de leurs propriétés mécaniques. Nous avons constaté que les composants de ce biomatériau ont un effet sur l'élasticité de ce dernier et sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses. En conclusion, cette étude montre que les cellules souches mésenchymateuses sont sensibles à la composition du biomatériau et ses propriétés mécaniques / In tissue engineering, biomaterials, cells and the induction of cell differentiation are factors to be studied. The aim of this study is to know the effect of biomaterials composition and mechanical properties on the differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow. At first, we studied the effect of a protein biomaterial (collagen type I) supplemented with hydroxyaptatite (HAP) particles. We found that the addition of HAP improves the mechanical properties of the biomaterial and conditione cell differentiation towards osteoarticular lineages. In a second step, we studied the effect of biomaterial composed of alginate supplemented with hyaluronic acid or HAP particles, using an experimental design to select suitable matrices for biological study based on their mechanical properties. We found that the components of this biomaterial have an effect on elasticity of the latter and the differentiation of mesenchymal stem cells. In conclusion, this study shows that mesenchymal stem cells are sensitive to the composition of the biomaterial and its mechanical properties

Il existe plus de 100 formes de pathologies hépatiques causées par divers facteurs et touchant une grande quantité de personnes. Mais, le seul traitement pour les maladies du foie en phase terminale est la greffe du foie. Cependant, la greffe de foie échoue souvent à cause du déficit en donneurs hépatiques. Récemment, une nouvelle alternative innovante pour traiter les maladies du foie apparaît : les organes auto-construits. En ingénierie tissulaire du foie, la source de cellules, l’échafaudage décellularisé du foie et les bioréacteurs, sont des facteurs à prendre en compte. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier deux étapes nécessaires au développement d’un foie artificiel : les cellules et la décellularisation de l’organe. Tout d’abord, nous avons prélevé et caractérisé les cellules souches mésenchymateuses de la gelée de wharton (CSMs-GW) CSMs-GW et nous avons étudié leur potentiel de différenciation en hépatocytes. La deuxième étape du travail est consacrée à la décellularisation du foie. Nous avons obtenu des scaffolds acellulaires par la perfusion continue avec du SDS 1% et triton-X100 1%. En conclusion, cette étude montre la capacité de CSM-GW de se différencier en hépatocytes et la faisabilité de la décellularisation du foie. Ceci ouvre des perspectives intéressantes pour le développement d’un foie artificiel et le traitement des pathologies hépatiques / There are over 100 forms of liver diseases caused by various factors and affecting a lot of people. Unfortunately, the only treatment of a terminal liver disease is liver transplantation. However, liver transplantation often fails because of the deficit in human liver donors. Recently, a new innovative alternative for treating end-stage liver disease appears: self-built organ. In liver tissue engineering the source of cells, the decellularized liver scaffold and circular culture bioreactor, are essential factors to be taken into account. The objective of this thesis is to study two steps needed for the development of an artificial liver : cells and organ decellularization. In the first stage, we collected and characterize Wharton’s-Jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs), and their differentiation potential into hepatocytes. In the second stage of the work, we developed a method for liver decellularization. We were able to get acellular scaffolds by continuous perfusion with 1% SDS and Triton X100 1%. In conclusion, this study shows the capability of WJ-MSC to be differentiated into hepatocytes and the feasibility to obtain acellular livers. That open perspectives toward the development of an artificial liver and the treatment of liver diseases

Certaines cellules cancéreuses sont méthionine dépendantes cependant les mécanismes de cette méthionine dépendance sont inconnus. Les cellules initiatrices de tumeur, qui représentent un faible pourcentage des cellules d’une tumeur, sont impliquées dans la récidive du cancer, phénocopient les cellules souches cancéreuses et forment des sphéroïdes 3D ou «tumor spheres (TS)» dans des conditions de culture non adhérentes. Nous montrons que, contrairement aux cellules monocouches adhérentes U251, les TS dérivées de cellules de glioblastome U251 ont besoin de méthionine exogène pour se développer. Cette méthionine-dépendance est caractérisée par une courbe en forme de cloche dans laquelle la croissance des TS est ralentie par des concentrations élevées de méthionine (> 0,01mM). Pendant la restriction en méthionine, le 5-méthyle-tétrahydrofolate restaure la formation des TS. Si les TS sont privées de méthionine pendant 24h, puis supplémentées en acide folique, elles présentent des concentrations d'isoformes des folates significativement inférieures à celles retrouvées dans les cellules adhérentes maintenues dans les mêmes conditions. Ceci suggère que le cycle des folates est réprimé dans les TS comparativement aux cellules adhérentes. L'annotation fonctionnelle des données ARN-Seq montre des changements nets dans plusieurs fonctions moléculaires et dévoile dans les TS un cycle cellulaire réduit, une augmentation du caractère « stemness » et une diminution du métabolisme des folates affectant particulièrement DHFR, SHMT et MTFHD. L'analyse du méthylome révèle des changements de méthylation dans le cycle cellulaire, la signature « stemness » et le cycle des folates, malgré des profils globaux de méthylation de l'ADN qui restent stables. Cependant, contrairement à la méthylation importante des promoteurs observée pour le cycle cellulaire et les gènes « stemness » (+ 25%), seuls 10 gènes du cycle des folates sur 139 gènes impliqués dans le métabolisme des mono-carbones sont significativement modifiés. En conclusion, un cycle des folates avec activité réduite fait partie de la reprogrammation métabolique qui déclenche la dédifférenciation en cellules souches cancéreuses et cette répression ne s'explique qu’en partie par la modification de méthylation des promoteurs / Some cancer cells are methionine dependent however little is known about the mechanisms of this dependency. Tumor initiating cells are a rare population of cancer cells, implicated in disease recurrence, that phenocopy cancer stem cells and form 3D spheroids or ‘tumor spheres (TS)» under non adherent conditions. We show that, unlike U251 adherent monolayer cells, TS derived from U251 glioblastoma cells need exogenous methionine to grow. This methionine dependency is characterized by a bell shape curve in which high methionine concentrations (>0.01mM) slow down TS growth. During methionine restriction, 5- methyltetrahydrofolate restores TS formation. When TS are deprived from methionine for 24h, then supplemented with folic acid, they exhibit lower levels of folate isoforms than adherent cells maintained in the same conditions, suggesting that folate cycle is repressed in TS relative to adherent cells. Functional annotation of the RNA-seq data shows clear changes in several molecular functions and reveals in TS a reduced cell cycle, an increased stemness and a diminished folate metabolism affecting particularly DHFR, SHMT and MTFHD. Methylome analysis shows methylation changes in cell cycle, stemness and folate cycle, despite global DNA methylation patterns remaining stable. However, unlike the important promoter methylation observed for cell cycle and stemness genes (+25%), only 10 folate cycle genes out of 139 genes involved in one-carbon metabolism are significantly altered. In conclusion, reduced folate cycle is part of the metabolic reprogramming triggering dedifferenciation into cancer stem cells and this repression is only partly explained by the alteration of promoter methylation

Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs. / The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations.