Ce travail de thèse s’est focalisé sur le développement des approches génériques de spectrométrie de masse (MS) pour la quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) et de leurs produits dérivés dans des études précliniques. Premièrement, le développement des protocoles de préparation d’échantillons basée sur la digestion directe à partir de sérum ou comportant une étape d’immuno-précipitation spécifique par anticorps a permis la quantification des mAbs couvrant une large gamme d'étalonnage de cinq ordres de grandeur. En outre, l'emploi de peptides provenant de la région constante du mAb a démontré la polyvalence de telles approches génériques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS/MS). Deuxièmement, les instruments de MS à haute résolution (HRMS) ont étés évalués dans le cadre de cette thèse en tant qu'alternative aux spectromètres de masse de type triple quadripôle traditionnellement utilisés pour l’analyse bottom-up quantitative. L’avantage majeur de l’intégration des analyseurs de HRMS a été associé à la possibilité de l’analyse quantitative simultanée des mAbs et leurs produits associés directement au niveau de la protéine fournissant un niveau d'informations bien au-delà de celui obtenu avec des approches bottom-up. Par conséquent, l’apport essential de la HRMS pour les analyses qualitative et quantitative des protéines thérapeutiques de type mAbs et produits associés a été démontré dans cette thèse. / This PhD thesis focused on the development of generic mass spectrometry (MS)-based workflows for monoclonal antibody (mAb)-related therapeutic protein quantification in pre-clinical species. First, the development of bottom-up sample preparation protocols either based on direct serum digestion or immuno-capture allowed mAb-related therapeutic protein quantification over five orders of magnitude whereas the employment of peptides from the constant region of the mAb demonstrated the versatility of such generic liquid chromatography tandem MS (LC-MS/MS)-based approaches. Second, high-resolution MS (HRMS) instruments were evaluated as an alternative to triple quadrupole mass analyzers, traditionally utilized for bottom-up mAb quantification by LC-MS/MS. The major benefit of HRMS incorporation into the workflow was associated with the possibility to quantify simultaneously mAb-related therapeutic proteins directly at an intact level, providing an information level far beyond the one obtained with bottom-up LC-MS/MS methodologies. Hence, the pivotal role of HRMS for the qualitative and quantitative analyses of mAb-related therapeutic proteins was further outlined throughout this doctoral work.

Le cancer de la vessie représente le 4ième cancer de l'homme en Europe. Dans la majorité des cas, les primo-tumeurs sont traitées facilement par résection mais dans 60% des cas, il y a récidives sous formes plus agressives. Il est donc nécessaire de détecter au plus tôt ces récidives. A ce jour, l'examen de référence pour le diagnostic d'un cancer de la vessie est la cystoscopie. Cet examen permet d'examiner l'intérieur de la vessie à l'aide d'un système optique introduit via l'urètre. Cette méthode est spécifique et sensible mais inconfortable et invasive pour le patient. Il est donc important de trouver de nouvelles méthodes de diagnostic de tumeurs de la vessie et, de surveillance aussi sensibles et spécifiques pour réduire l'inconfort chez le patient et par la même occasion, le coût associés à la cystoscopie. La recherche de biomarqueurs protéiques dans l'urine représente une alternative majeure pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique de patients atteints de pathologies uro-génitales. Dans le cas présent du cancer de la vessie, la vessie joue le rôle de réservoir de cellules relarguées par la tumeur, ce qui fait de l'urine, fluide dit "proximal", le fluide idéal pour la recherche de biomarqueurs protéiques. Ces dernières années, la recherche de biomarqueurs protéiques a bénéficié de progrès spectaculaires dans le domaine de la spectrométrie de masse et de la biochimie, permettant d'accéder à une large variété de protéines sur une large gamme dynamique de concentration. De plus, l'apparition de nouvelles approches de protéomique quantitatives, telle que la stratégie "Accurate Mass and Time (AMT) tags" couplée à la quantification « label free », permet la comparaison de protéomes d'états physiologiques distincts par mesures d'abondances des protéines. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons ainsi développé un protocole expérimental couvrant l'ensemble du processus de découverte de nouveaux biomarqueurs associés au cancer de la vessie dans l'urine, i.e., de la collecte et préparation des échantillons d'urine à l'évaluation de méthodes de fractionnement pour la caractérisation la plus exhaustive possible du protéome urinaire, en utilisant des méthodes de protéomiques quantitatives et des méthodes de statistiques dédiées. Ce travail nous a permis de constituer une base de données contenant 2014 protéines urinaires. Des variations d'abondances ont été mesurées pour plus de la moitié d'entre elles, au travers d'une cohorte de 98 patients constituée de patients atteints de cancers de la vessie et de patients contrôles. Une liste finale composée de 97 candidats biomarqueurs du cancer de la vessie a été établit. Cette liste contient un grand nombre de protéines exosomales potentiellement sécrétées de façon spécifique par la tumeur. / Bladder cancer is the 4th type of cancer causing man death in Europe. In most cases, primary tumors can be easily removed by resection but in 60% of the cases, the tumors regrowth in more aggressive forms. Therefore, it is essential to detect early recurrence of bladder cancer. To date, the gold standard for the diagnosis of bladder cancer is cystoscopy. It allows the examination of the inside of the bladder using an optical system which is inserted in the urethra. This method is sensitive and specific but extremely uncomfortable and invasive for the patient. Therefore, it is crucial to find new diagnosis and monitoring methods for bladder tumour more comfortable for the patient, in a cost efficient way. The search for clinically useful protein biomarkers in the urine is a major alternative for the diagnosis, the prognostic and the therapeutic treatment of patients with urea-genital pathologies. In the specific case of the bladder cancer, the bladder contains the cells left by the tumour, and subsequently urine becomes the ideal fluid for biomarker investigation as a “proximal fluid”. In the last few years, the search for protein biomarkers has benefited of significant progress in the field of mass spectrometry and bio-chemistry, allowing the detection of a wide variety of proteins in a large dynamic range of concentrations. In addition, new approaches of quantitative proteomic, such as the “Accurate Mass and Time (AMT) tags” approach, coupled with the “label free” quantification, allows the comparison of proteomes from distinct physiological state by measuring protein abundances. During this thesis, we developed an experimental protocol covering the whole process of discovering new biomarkers associated to bladder cancer in urines, i.e., from the collection and preparation of urine samples, to the evaluation of the best fractioning method to define the urinary proteome using quantitative approaches and dedicated statistical methodologies. This work enables the population of a database containing 2014 urinary proteins. Abundance variations were measured for more than the half through a cohort of 98 healthy and bladder cancer patients. A final list of 97 biomarker candidates has been established. This list holds a significant number of exosomal proteins that are potentially secreted by the tumour.

Ce travail a eu pour objectif d’améliorer notre compréhension des processus de formation et d’évolution des aérosols organiques secondaires (AOS) en étudiant les réactions susceptibles d’expliquer la présence d’espèces « mixtes » organosoufrées observées récemment dans l’aérosol atmosphérique. Les composés organiques volatils et en particulier les monoterpènes ont été identifiés comme étant des précurseurs potentiellement importants d’organosulfates dans l’atmosphère. Cependant, les mécanismes de formation de ces derniers ne sont pas encore bien compris. Seule une étude au niveau moléculaire et ciblée sur une réaction multiphasique unique, peut donner accès à des mécanismes réactionnels détaillés. Ainsi, les réactions entre l’α-pinène et quatre produits d’oxydation associés (α-pinène oxyde, myrténal, isopinocamphéol et pinanediol), avec des particules modèles de sulfate d’ammonium ont été étudiées individuellement dans le but de documenter la formation d’organosulfates. L’effet de l’humidité relative et celui de l’acidité des particules sur ces réactions ont été étudiés. La quantification en ligne des composés organiques volatils a été effectuée à l’aide d’un spectromètre de masse à transfert protonique. L’identification des structures moléculaires des organosulfates, formés en phase particulaire, a été effectuée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Deux approches complémentaires, impliquant des expériences en réacteur quasi-statique et en chambre de simulation atmosphérique, ont permis de mettre en évidence la formation d’organosulfates mais également de proposer des mécanismes réactionnels pour l’ensemble des composés oxydés étudiés. / This work deals with the formation and aging processes of secondary organic aerosol (SOA). More precisely, the objective was to document organosulfate formation, recently identified in ambient aerosol. Volatile organic compounds (VOCs) such as monoterpenes have been recognized as potentially important precursors of organosulfates in the atmosphere. However, organosulfate formation is not yet well understood. Reliable chemical mechanisms can only be accessible when studying individual reactions at the molecular level. In this work, organosulfate formation was studied for the reactions of α-pinene and associated oxidized species (α-pinene oxide, myrtenal, isopinocampheol and pinanediol) with acidified ammonium sulfate particles. On-line quantification of VOCs was carried out using proton-transfer-reaction mass spectrometry. Identification of products in the particulate phase has been performed using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Experiments from quasi-static reactor and atmospheric simulation chamber experiments are compared and discussed, allowing to propose chemical mechanisms explaining organosulfate formation for the heterogeneous reactions of interest.

L'étude de nombreux composés exogènes (composés étrangers à l'organisme) ne pose pas de difficultés lorsqu'ils sont isolés, purifiés et en quantités suffisantes pour les seuils de détection des appareils de mesure usuels utilisés en biologie (Chromatographie, RMN, Spectrométrie de masse, etc.). Lorsqu'ils se retrouvent dans un fluide biologique (sang, urines, extraits d'organe...), ils sont souvent en quantités telles que l'effet matrice ou le bruit de fond des appareils rend leur détection et leur dosage très délicats. L'utilisation de standards internes marqués uniformément au carbone 13 et/ou à l'azote 15 permet d'obtenir un signal plus facilement reconnaissable et identifiable grâce à la présence des isotopes (pics de masse décalés, massifs isotopiques identifiables en spectrométrie de masse par exemple). C'est pourquoi, en complément des études analytiques et biochimiques du métabolisme de la zéaralénone (ZEN), nous nous sommes intéressés aux calculs prévisionnels de spectres de masse de molécules enrichies à des taux variables (entre 0 et 1) de différents isotopes (13C, 15N, 18O et 2H). Parallèlement nous avons étudié l'influence d'un enrichissement au 13C sur la réactivité d'une molécule donnée, d'un point de vue théorique et expérimental.

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L'optimisation des procédés CVD et CVI, en vue d'accroître la vitesse de dépôt et d'améliorer leur qualité, nécessite une bonne connaissance de la nature et de la concentration des espèces présentes en phase gazeuse. Deux types de dépôts de carbone ont été considérés au cours de ce travail : les films diamant obtenus à partir de phases gazeuses activées par plasma micro-onde et les pyrocarbones (laminaires lisses et rugueux) issus de la pyrolyse du propane. La spectrométrie de masse avec prélèvement par faisceau moléculaire a été utilisée pour l'analyse des espèces présentes : atomes, radicaux et molécules. L'influence de la composition du mélange réactif (en PACVD), du débit total et de la présence de surfaces solides ou poreuses sur les espèces gazeuses a été particulièrement étudiée pour identifier les précurseurs des films diamant et des pyrocarbones.

La kinésine mitotique humaine HsEg5 est essentielle à la division cellulaire. Ce moteur moléculaire permet la séparation des centrosomes et la mise en place du fuseau mitotique, structure nécessaire au partage équitable de l'information génétique. La suppression de la fonction d'HsEg5 bloque les cellules en pré-métaphase avec un fuseau mitotique monoastral caractéristique constitué des deux centrosomes non séparés entourés d'un anneau de chromosomes et de microtubules. Le maintien de ce phénotype peut conduire à la mort cellulaire programmée via l'activation du point de contrôle du fuseau mitotique (transition métaphase-anaphase). HsEg5 est ainsi considérée comme une cible anticancéreuse particulièrement intéressante. <br />Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés aux interactions entre le domaine moteur d'HsEg5 et plusieurs inhibiteurs. Les zones d'interaction et de modifications conformationnelles ont été étudiées par échanges hydrogène/deutérium–spectrométrie de masse et mutagenèse dirigée. Cette approche expérimentale nous a permis d'identifier un « point chaud » d'inhibition sur le domaine moteur et de caractériser les mécanismes de deux inhibiteurs : le monastrol et le S-trityl-l-cystéine.

La mesure des masses des noyaux permet d'obtenir l'énergie de liaison qui reflète toutes les interactions régnant au sein du noyau atomique. Pour les noyaux N=Z, l'énergie de liaison présente une singularité qui peut être reproduite par l'ajout d'un terme de Wigner dans les formules de masses. Cet effet est étudié par l'intermédiaire de l'interaction neutron-proton qui présente un excédent pour les noyaux N=Z qui tend à disparaître pour les noyaux pair-pair lorsque le nombre de masse A augmente. Cependant, pour les noyaux N=Z impair-impair, l'interaction neutron-proton tend à se stabiliser au delà de A=40 avec un excédent d'environ 2 MeV. Une mesure de la masse atomique du noyau N=Z=37 74Rb a été réalisée avec le spectromètre à radiofréquence MISTRAL qui est installé au CERN. La fréquence cyclotron du 74Rb à l'intérieur d'un champ magnétique est mesurée en la synchronisant avec la fréquence d'un champ électrique, qui module l'énergie cinétique des ions. Cette fréquence cyclotron est comparée à celle d'un noyau de référence, de masse bien connue, à l'intérieur du même champ magnétique et le rapport des deux fréquences donne le rapport des deux masses atomiques. Cette mesure dont la précision obtenue est de 116 keV, a confirmé la stabilisation de l'interaction neutron-proton pour les noyaux N=Z impair-impair. Différentes formules de masses ont été étudiées et l'interaction neutronproton a été calculée à partir des masses prédites par ces formules puis comparée aux valeurs expérimentales. En particulier, le modèle IBM-4, basé sur la symétrie SU(4) a été utilisé pour calculer les masses des noyaux N=Z et des noyaux pair-pair et ainsi en déduire l'interaction neutron-proton pour les noyaux N=Z pair-pair. Un autre point intéressant du 74Rb est sa décroissance super-permise vers le 74Kr dont l'énergie et la demi-vie permettent de calculer la constante de couplage vecteur de la théorie électrofaible, qui est supposée indépendante du noyau par l'hypothèse CVC.

L'exploration de la vallée de stabilité dans la direction des isospins est actuellement un enjeu très important en physique nucléaire. Dans ce cadre, les mesures de masses sont de très bonnes indications des changements de structures nucléaires et permettent la contrainte, loin de la stabilité, des modèles existants. Ce travail est consacré à l'étude de la région riche en neutrons autour de ^32_12Mg_20, nucléide radioactif de très courte durée de vie (95 ms). MISTRAL est un spectromètre à radiofréquence et à transmission en ligne installé au CERN à ISOLDE au cours de l'été 1997. La mesure de masse s'effectue par la mesure de la fréquence cyclotron de l'ion tournant dans un champ magnétique homogène comparée à celle d'un ion de référence. Cette méthode permet des mesures de masse très rapides et très précises (quelques 10−7). Des mesures de la masse de 25,26Ne et 32Mg ont été effectuées en 1999. L'analyse a été rendue complexe par la présence de nombreux isobares dans le faisceau radioactif. La masse de 32Mg a été trouvée plus liée de 280 keV par rapport aux tables. Les valeurs de MISTRAL pour les trois nucléides sont plus précises et ont donc le plus grand poids dans la nouvelle évaluation. La zone de déformation de la région étudiée est renforcée. La fermeture de couche à N = 20 semble disparaître pour ces nucléides. Une nouvelle méthode de mesure de masse avec le spectromètre MISTRAL ainsi que des comparaisons à des modèles classiques en physique nucléaire (modèle en couche, modèle de champ moyen, etc.) ont également été étudiées.

La spectrométrie de masse fait partie des technologies haut débit et offre à ce titre un regard inédit, à une échelle nouvelle, sur les protéines contenues dans divers échantillons biologiques. Les études biomédicales utilisant cette technologie sont de plus en plus nombreuses et visent à détecter de nouveaux biomarqueurs de différents processus biologiques, notamment de processus pathologiques à l'origine de cancers. Cette utilisation comme outil de criblage pose des questions quant à la capacité même des expériences de spectrométrie de masse dans cette détection. La puissance statistique traduit cette capacité et rappelle que les études doivent être calibrées pour offrir des garanties suffisantes de succès. Toutefois, cette exploration de la puissance statistique en spectrométrie de masse n'a pas encore été réalisée. L'objet de cette thèse est précisément l'étude des déterminants de la puissance pour la détection de biomarqueurs en spectrométrie de masse. Une revue de la littérature a été réalisée, reprenant l'ensemble des étapes nécessaires du traitement du signal, afin de bien comprendre les techniques utilisées. Les méthodes statistiques disponibles pour l'analyse du signal ainsi traité sont revues et mises en perspective. Les situations de tests multiples, qui émergent notamment de ces données de spectrométrie de masse, suggèrent une redéfinition de la puissance, détaillée par la suite. La puissance statistique dépend du plan d'expérience. La taille d'échantillon, la répartition entre groupes étudiés et l'effet différentiel ont été investigués, par l'intermédiaire de simulations d'expériences de spectrométrie de masse. On retrouve ainsi les résultats classiques de la puissance, faisant notamment ressortir le besoin crucial d'augmenter la tailles des études pour détecter des biomarqueurs, particulièrement lorsque ceux-ci présentent un faible effet différentiel. Au delà de ces déterminants classiques de la puissance, des déterminants propres à la spectrométrie de masse apparaissent. Une chute importante de puissance est mise en évidence, due à l'erreur de mesure des technologies de spectrométrie de masse. Une synergie péjorative existe de plus entre erreur de mesure et procédure de contrôle du risque de première espèce de type FDR. D'autre part, les méthodes de détection des pics, par leurs imperfections (faux pics et pics manqués), induisent un contrôle suboptimal de ce risque de première espèce, conduisant à une autre chute de puissance. Ce travail de thèse met ainsi en évidence trois niveaux d'intervention possibles pour améliorer la puissance des études : la meilleure calibration des plans d'expérience, la minimisation de l'erreur de mesure et l'amélioration des algorithmes de prétraitement. La technologie même de spectrométrie de masse ne pourra conduire de façon fiable à la détection de nouveaux biomarqueurs qu'au prix d'un travail à ces trois niveaux.