Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Introini_GiseleOrlandi_D.pdf: 4339953 bytes, checksum: 12ffc20df8da4d8930c265634e22d822 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Aplicações de Microscopias Eletrônicas de Transmissão (TEM) e Varredura (SEM) têm contribuído para a sistemática de moluscos bivalves e classificações de táxons mais abrangentes. Em muitos casos, os resultados dessas ferramentas metodológicas têm notavelmente complementado os estudos comparativos da anatomia interna e dos caracteres conquiliológicos, contribuindo para uma ampla compreensão das relações filogenéticas entre os representantes da classe Bivalvia. A morfologia dos espermatozóides de inúmeros táxons importantes das subclasses Pteriomorphia e Heterodonta permanece pouco ou nada estudada. A análise de espécies dessas subclasses pode corroborar estudos que abordam taxonomia e filogenia. No presente trabalho, foi realizado o estudo da ultraestrutura dos espermatozóides de espécies de bivalves das famílias Veneridae, Donacidae, Tellinidae (Ordem Veneroida, Subclasse Heterodonta,), Mytilidae (Mytiloida), Isognomonidae (Pterioida) e Ostreidae (Ostreoida) (pertencentes à Subclasse Pteriomorphia). Os espermatozóides de todas as espécies de bivalves analisadas, com exceção da espécie Tellina lineata, apresentaram uma morfologia típica de animais marinhos que liberam seus gametas fertilizando seus ovos na água do mar. A microscopia eletrônica de transmissão forneceu importantes caracteres que auxiliaram na diferenciação entre os espermatozóides das espécies Isognomon bicolor e I. alatus (única coletada em território estrangeiro); Donax hanleyanus e D. gemmula; Macoma biota e M. constricta. A célula gamética masculina de Tellina lineata foi considerada modificada, portadora de acrossomo cônico e curto, núcleo longo e helicoidal, mitocôndrias alongadas que se estendiam sobre a periferia da base nuclear, estruturas longas que se dispunham ortogonalmente (mas que não apresentavam o padrão convencional dos centríolos) e um flagelo simples. Na literatura acerca dos Bivalvia, considerase a cabeça alongada mais eficiente na penetração de óvulos que possuem ampla camada gelatinosa. O espermatozóide de Tivela mactroides (em comparação com aquele produzido por Anomalocardia brasiliana) possibilitou a descrição de determinadas características que podem contribuir para vantagens adaptativas nos ambientes nos quais os bivalves ocorrem. Uma característica interessante da cabeça alongada dos espermatozóides dos membros da família Veneridae é a presença de curvatura. Populações de Mytella podem ocorrer tanto em costões rochosos quanto em bancos de sedimento areno-lamoso. Não houve diferença entre essas populações e foi sugerido que ambas se tratam de M. charruana. A presença de perforatorium no espermatozóide de Mytella charruana permite sua alocação na subfamília Mytilinae. As descrições disponíveis na literatura sobre a morfologia do gameta masculino de ostras mostram uma significativa semelhança entre as espécies investigadas, corroborando o status monofilético da família Ostreidae. Segundo os resultados apresentados é possível afirmar que a espécie Crassostrea brasiliana ocorre na região de Cananéia. Conclui-se que os dados da tese mostraram-se especialmente importantes por revelarem os detalhes internos mais sutis dos espermatozóides, ampliando o crescente entendimento da estrutura, biologia e desenvolvimento dos espermatozóides de bivalves das famílias Isognomonidae, Veneridae, Donacidae, Tellinidae, Mytilidae e Ostreidae. / Abstract: The ultrastructure of bivalve spermatozoa can be species-specific and often provide valuable taxonomic traits for systematic reviews and phylogenetic reconstructions. Transmission and scanning electron microscopy was an efficient tool to differentiate the spermatozoan structure of species sharing many conchological characters, which could lead to equivocal identification. We analyzed sperm ultrastructural features that were useful for taxonomic issues with regard to Isognomon bicolor and Isognomon alatus (Isognomonidae); Macoma constricta, Macoma biota and Tellina lineata (Tellinidae); Donax hanleyanus and Donax gemmula (Donacidae). The data revealed that the bivalve species studied here, except T. lineata, produce primitive-type spermatozoa, typical of marine invertebrates in which eggs are fertilized in the surrounding water. We, also, compared the ultrastructure of spermatozoa from the bivalves Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides (Veneridae). The spermatozoa of both species contain a curved nucleus with a short cone-shaped acrosome. There were six mitochondria and glycogen clusters in the middle piece of the T. mactroides sperm cell. Possibly, the glycogen clusters and the higher mitochondria number correspond to an adaptive advantage in turbulent waters. Increasing the sperm life expectance also increases the odds of finding the eggs and accomplishing fertilization. Oysters of the genus Crassostrea and mussels of the genus Mytella, commercially important in Brazil, were also investigated in this thesis. The sperm ultrastructure of the specimens described herein and molecular studies, confirm the presence of Crassostrea brasiliana (Ostreidae) in Cananéia. Spermatozoa of mussel specimens of the genus Mytella, from two populations living in distinct habitats (muddy-sand sediment and rocky shores), were examined by transmission electron microscopy. The spermatozoa of all specimens shared the same ultrastructural pattern suggesting that the analyzed specimens, which live in distinct habitats, indeed belong to a same species, which was identified as M. charruana (Mytilidae) based on conchological analysis. The presence of an axial rod in sperm cells upholds the inclusion of M. charruana in the subfamily Mytilinae. In conclusion the electron microscopy was an efficient method to solve some particular taxonomic issues. The present spermatozoan ultrastructural studies have provided new and welcome data about the families Isognomonidae, Veneridae, Tellinidae, Donacidae, Ostreidae and Mytilidae. The results showed in this thesis could be valuable in future phylogenetic analyses. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sonia Nair Bao / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T17:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fiorillo_BrunoSilva_M.pdf: 2862348 bytes, checksum: 42cb5c70d4103ce2bdba326ff2ae1788 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As vespas da família Agaonidae, são as únicas entre as vespas de figo que polinizam as figueiras possuindo uma identidade espécie-específica em relação à planta. A relação de polinização das vespas do figo com as figueiras é de um mutualismo obrigatório: a planta necessita das vespas para a dispersão do pólen e para a polinização e, por sua vez, as vespas são completamente dependentes dos figos para que seu ciclo de vida se complete. Essa interação representa talvez o melhor exemplo de mutualismo integrado à polinização que se tem conhecimento. Trabalhos de sistemática com estas vespas são de fundamental importância para estudos de ecologia e evolução. Inúmeros estudos têm demonstrado que a estrutura e a ultra-estrutura do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em Hymenoptera apresentam variações suficientes para gerar caracteres adicionais para as análises cladísticas. Sendo assim, análises estruturais e ultra-estruturais foram realizadas a fim de descrever a morfologia do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em três espécies do gênero Pegoscapus. Para tanto, utilizamos as seguintes metodologias: microscopia de luz utilizando campo claro, contraste de fase e fluorescência para DAPI; microscopia eletrônica de transmissão convencional e citoquímica com E-PTA e microscopia eletrônica de varredura. As espécies de Pegoscapus apresentaram o trato reprodutivo interno e a estrutura básica dos espermatozóides similares a outros Chalcidoidea. Os espermatozóides de duas espécies demonstraram as mesmas características enquanto a terceira apresentou diferenças em relação ao comprimento e à espessura da camada extracelular. Além dessas diferenças, todas as espécies analisadas compartilharam de algumas características: vesícula seminal sem divisões de câmaras; ausência de estruturas acrossomais no espermatozóide; comprimento da camada extracelular e os microtúbulos centrais sendo os primeiros a terminar na seqüência de desmontagem do axonema em sua porção final. Essas características permitem o estabelecimento de um padrão para o gênero Pegoscapus que será útil para futuros estudos filogenéticos do grupo Chalcidoidea / Abstract: The wasps of the family Agaonidae, are the only among fig wasps which pollinate figs, they are also species-specific to their host. The relationship of the pollinating fig wasps with their host fig tree is an obligate mutualism: the tree relies on the wasps for pollen dispersal and pollination, and in turn the wasps are completely dependent on the fig for the completion of their life cycle. This interaction represents perhaps the most tightly integrated pollination mutualism that is known. Systematic works on these wasps are of fundamental importance to ecological and evolutionary studies. Numerous investigations have demonstrated that structure and ultrastructure of the male reproductive tract and spermatozoa in Hymenoptera furnish sufficient variations to provide additional characters for cladistic analysis. Thus, structural and ultrastructural studies were carried out to describe the morphology of the male reproductive tract and the spermatozoa in three species of the genus Pegoscapus. For this study, we employed the methods: light microscopy using bright-field, phase-contrast and DAPI fluorescence; transmission electron microscopy with conventional preparations and cytochemistry (E-PTA) and scanning electron microscopy. Pegoscapus species presented the internal reproductive tract features and the basic sperm structure similar to that of other Chalcidoidea. The spermatozoa of two Pegoscapus species showed the same features while the other presented differences in length and in extracellular sheath thickness. Besides these differences, all species analyzed share some characteristics: the seminal vesicle not divided in chambers; the absence of acrosomal structures in the spermatozoa; the length of the extracellular sheath and the central microtubules being the firsts to terminate in the sequence of microtubular cutoff at the final axonemal portion. These characteristics permit the establishment of a pattern for the genus Pegoscapus that will be useful for phylogenetic studies in Chalcidoidea / Mestrado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

É sabido das vantagens da utilização do sêmen criopreservado na reprodução eqüina, mas também é de conhecimento que o entendimento desta biotecnologia ainda é carente. Não se tem concordância quanto à dose e concentração espermáticas ideais para se obter bons resultados de fertilidade. Assim, este experimento teve o intuito de avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA), a morfologia espermática, além da integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, com sondas fluorescentes, em espermatozóides eqüinos criopreservados nas concentrações de 100, 200, e 400x106sptz/mL e nos volumes 0,50 e 0,25mL. Foram utilizados quatro garanhões sendo oito colheitas de cada animal, através de vagina artificial. Após a colheita, o sêmen foi diluído em extensor à base de leite desnatado (1:1), centrifugado 500xg por 10 minutos, o sobrenadante retirado, e o pellet ressuspendido em diluidor Botu-Crio® nas concentrações de 100 (C100), 200 (C200) e 400x106sptz./mL (C400). Em seguida, envasado em palhetas de 0,50 e 0,25mL. Para criopreservação do sêmen utilizou–se aparelho automatizado (TK3000®), com curvas de resfriamento -0,25ºC/min e de congelação -15ºC/min até -80ºC e -10ºC/min, até atingir -120ºC, quando as palhetas foram mergulhadas em N2 líquido (-196 ºC) e armazenadas em botijões criogênicos. Foram descongeladas duas palhetas de cada tratamento em banho-maria (37ºC por 30s). Uma amostra do sêmen foi diluída em formol salino para avaliação da morfologia espermática e outra em TALP sperm à concentração de 25x106sptz/mL. Logo após, uma amostra desta solução foi submetida à análise computadorizada do movimento espermático. As características analisadas foram: motilidade total (MTCA, %), motilidade progressiva (MPRO, %), velocidade progressiva (VSL, &#956;m/s), velocidade curvilinear (VCL, &#956;m/s), deslocamento lateral de cabeça (ALH, &#956;m) e freqüência de batimento flagelar (BCF, Hz). Em seguida, uma outra amostra foi avaliada quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando PI, JC-1 e FITC-PSA, por microscopia de epifluorescência. Foram determinados os percentuais de espermatozóides com membranas plasmáticas intactas (MPI), acrossomais intactas (MAI) e mitocondriais de alto potencial (APM) e membranas plasmática e acrossomal intactas e com alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). Foi utilizada análise de variância (ANOVA) (p<0,05) e teste de médias SNK (p<0,05), pelo método SAS®. Não houve efeito da interação entre volume da palheta e concentração espermática para as características estudadas. As características do movimento espermático foram influenciadas pela concentração, de forma que C100>C200>C400, exceto em LIN e STR. O volume somente alterou os valores de STR e VCL. Quanto à integridade e funcionalidade das membranas, não houve efeito do volume, enquanto que as concentrações alteraram somente MPI (C100>C200>C400) e APM (C100=C200>C400). Na morfologia espermática, a concentração somente afetou a percentagem de cauda dobra ou enrolada (C100>C200=C400) e o volume de armazenamento somente as quantidades de cabeça isolada normal e patológica (0,50>0,25mL). Assim, o melhor método de congelação, neste experimento, foi em C100, seguido por C200 e por último C400, em ambos os volumes. Portanto, a qualidade seminal pós-descongelação está diretamente relacionada com a quantidade de agentes crioprotetores por unidade celular, independente do volume da palheta. / It has been known the advantages of cryopreserved semen utilization in equine reproduction, but the understanding of this biotechnology is uncertain yet. There was not agreement of the ideal spermatic dose and concentration to optimize fertility results. Thus this experiment had the objective to evaluate spermatic motion by computed analysis (CASA), spermatic morphology and the plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential with fluorescence probes of equine cryopreserved spermatozoa on 100, 200 and 400x106sptz/mL concentrations and 0.50 and 0.25mL volumes. Eight ejaculates from four stallions were collected in artificial vagina. The semen was diluted in skim-milk extender (1:1), centrifuged at 500xg for ten minutes, the supernatant was removed and the freezing extender Botu-Crio® was added in the pellet to a final concentrations of 100 (C100), 200 (C200) and 400x106sptz/mL (C400); after that, it was packed in 0.50 and 0.25mL straws. The cryopreservation of semen utilized an automatic system (TK3000®), with cooling slope -0.25°C/minute and freezing slope of -15°C/minute, until -80°C, and -10°C/minute, until -120°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C), and stored in cryogenics tank. They were thawed for 30s in a 37°C waterbath. A sample of semen was diluted in saline formol to morphology spermatic evaluation and another diluted in TALP sperm at 25x106sptz/mL. After, a sample was submitted to CASA evaluation. The analyzed characteristics were: total motility (TMCA, %), progressive motility (PROM, %), progressive velocity (VSL, µm/s), track speed (VCL, µm/s), beat cross frequency (BCF, Hz) and lateral amplitude of head (ALH, µm). Afterward, another sample was evaluated about plasmatic and acrosomal membranes integrity and mitochondrial potential membrane, using PI, JC-1 and FITC-PSA by epifluorescence microscope. It was determined the spermatozoa percentage with intact plasmatic membranes (IPM), intact acrosomal membranes (IAM), and high potential mitochondrial membrane (HPM) and intact plasmatic and acrosomal membranes and with high potential mitochondrial membrane (IPIAH). For statistical analysis were utilized variance analysis (ANOVA - p<0.05) and SNK test (p<0.05) with standard deviation, by SAS® system. There was not effect of straw volume and spermatic concentration interaction in the studied characteristics. The spermatic motion characteristics were influenced by concentration (C100>C200>C400), except LIN and STR. The volume changed the values of percentage of STR e VCL. In membrane integrity and functionality there was no volume effect, however the concentrations changed only IPM C100>C200>C400) e HPM (C100=C200>C400). In spermatic morphology, the concentration affected the percent of folded or coiled tail (C100>C200=C400) and the volume only affected the loose normal and abnormal head (0.50>0.25mL). Thus, the better freezing method, in this experiment, was C100, followed by C200, and C400, in both straws volumes. The seminal quality post-thawed is related with the cryoprotector quantity by cell, free of the straw volume.

A composição dos lipídeos de membrana está entre os fatores que podem influenciar a capacidade fecundante do espermatozoide. Sabidamente os lipídeos desempenham papéis indispensáveis na membrana dos espermatozoides, participando dos processos de interação entre gametas e influenciando o comportamento físico-químico dos espermatozoides durante os procedimentos de criopreservação. Estas moléculas apresentam uma ampla gama de propriedades químicas que tornam complexa a sua análise. Atualmente a espectrometria de massas (MS) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) representa uma potente ferramenta para a análise de lipídeos. Assim, a proposta deste trabalho buscou verificar a ocorrência de diferença no perfil lipídico de espermatozoides bovinos obtidos por MALDI utilizado técnica de análise direta dos espermatozoides e análise após a extração lipídica pelo método de Bligh e Dyer. Além disso, este trabalho analisou o perfil lipídico de espermatozóides bovinos que receberam ou não suplementação de antioxidantes. Após coleta, lavagem e separação dos espermatozoide, estes foram submetidos à extração lipídica ou destinados íntegros à obtenção do perfil lipídico (método direto). O perfil lipídico do extrato lipídico ou de espermatozoides íntegros foi adquirido por MALDI em modo positivo e com matriz DHB (ácido dihidroxibenzoico). A análise dos dados foi realizado com o software Metaboanalist utilizando ferramentas de análise multivariada (análise de componentes principais - PCA) e de identificação de íons com intensidade diferencial entre grupos de comparação (teste t, volcano plot). Com essas análises foi possível identificar que ocorre diferença no perfil lipídico dos espermatozoides bovinos quando obtidos a partir de análise direta ou extração de lipídeos. Não foram observadas diferentes entre grupos submetidos ou não à suplementação com vitaminas. O método direto é capaz de proporcionar um perfil lipídico representativo e de fácil aquisição. / The membrane lipid composition is amongst the factors that influence the fertilization competence of the spermatozoa. It is also known that lipids play fundamental roles at spermatozoa membranes, participating in many processes, such as spermatozoaoocyte interaction and determining the physical-chemical behavior of spermatozoa membranes during cryopreservation. These molecules show a wide range of chemical properties, making complex its analysis. Currently, mass spectrometry (MS) through matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) represents a powerful tool for lipids analysis. Hence, this proposal aimed to evaluate differences in bovine spermatozoa lipid profile obtained through MALDI using direct sample analysis of spermatozoa or analysis of spermatozoa lipid extract obtained by Bligh-Dyer technique. Moreover, this proposal evaluated lipid profile of spermatozoa from bull that received or not antioxidant supplementation. After collection, washing and separation, the spermatozoa were submitted to lipid extraction or straightforward destined to lipid profile acquisition (direct method). The lipid profiles of spermatozoa lipid extracts or from whole spermatoloza were obtained by MALDI in positive mode with DHB matrix (dihydrozybenzoic acid). Data analysis was performed with Metaboanalyst software using multivariated analysis (Principal component analysis - PCA) and tools for identification of differential ions between comparison groups (t-test, volcano plot). Results show differences in spermatozoa lipid profile obtained by direct method or after lipid extraction. No differences were observed in bovine spermatozoa derived from bulls supplemented or not with vitamins. The direct method can generate a representative and easily obtained lipid profile.

Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SiqueiraJunior_Sergio_D.pdf: 45553042 bytes, checksum: e8a175ee3eabcc8492c6fdbca5adf69a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Terrarana é atualmente o maior táxon da ordem Anura, possuindo cerca de 900 espécies. Recentemente, esse grupo de anuros foi alvo de uma série de modificações taxonômicas. Primeiramente essas espécies foram removidas da família Leptodactylidae e colocadas na sinonímia de Brachycephalidae, e mais tarde alocadas em um novo táxon chamado Terrarana. Atualmente as espécies deste grupo estão distribuídas nas famílias, Eleutherodactylidae, Craugastoridae, Strabomantidae e Brachycephalidae. Embora tenha sido bastante estudado, alguns dos relacionamentos inter- e intragenéricos permanecem não esclarecidos. Devido ao baixo número de espécies amostradas nos estudos filogenéticos, os clados da América do Sul, Strabomantidae e Brachycephalidae, são os grupos que têm as relações filogenéticas menos desvendadas. Neste trabalho foram realizados estudos citogenéticos e da ultra-estrutura dos espermatozóides de algumas espécies de Terrarana dos gêneros, Pristimantis, Ischnocnema, Barycholos, Haddadus e Brachycephalus. As metáfases foram obtidas por suspensão do epitélio intestinal e coradas com Giemsa ou submetidas a técnicas de impregnação por prata (Ag-NOR) e hibridação in situ (FISH) para a detecção das regiões organizadoras do nucléolo e bndamento-C, para a localização da heterocromatina. Os dados da ultra-estrutura dos espermatozóides foram analisados ao microscópio eletrônico de transmissão. As espécies estudadas foram Pristimantis fenestratus (Borba e Manaus, Reserva Florestal Adolfo Ducke, Amazonas e Rio Branco, Acre), P. dundeei (Chapada dos Guimarães, Rondonópolis e Aripuanã, Mato Grosso), P. crepitans (Chapada dos Guimarães e São Vicente, Cuiabá, Mato Grosso), Ischnocnema paulodutrai (Ilhéus, Bahia); I. juipoca (Atibaia e Campos do Jordão, São Paulo), I. guentheri e I. parva (Mogi das Cruzes, São Paulo), Brachycephalus ephippium (Mogi das Cruzes e Atibaia, São Paulo, Barycholos ternetzi (Uberlândia, Minas Gerais e Porto Nacional, Tocantins), e Haddadus binotatus (Mogi das Cruzes e Ilhabela, São Paulo). Os dados citogenéticos foram importantes na caracterização cromossômica das espécies P. fenestratus 2n=34 cromossomos, P. crepitans 2n=22, P. dundeei 2n=28 e I. paulodutrai 2n=30 e ainda B. ternetzi e I. juipoca 2n=22. Os dados citogenéticos revelaram diferenças no bandamento-C e Ag-NOR, sugerindo a existência de espécies ainda não descritas de Pristimantis nas localidades de Manaus, Rio Branco, e Aripuanã, e de Barycholos (Tocantins) identificadas incorretamente como P. fenestratus, P. dundeei e B. ternetzi. A análise citogenética indicou ainda que o baixo número cromossômico em P. crepitans é único dentro do gênero e sugere que esta a mesma não seja proximamente relacionada a espécies congenéricas. As similaridades cariotípicas entre I. paulodutrai e P. dundeei indicam que estas espécies podem ser proximamente relacionadas. Além disso, foi encontrado um caso incomum de variação intra-individual cromossômica no número fundamental de células somáticas de P. fenestratus, que pode estar relacionada com a segregação anômala de cromatides irmãs durante a mitose. A ultra-estrutura dos espermatozóides das espécies brasileiras de P. fenestratus, P. dundeei, P. crepitans, B. ternetzi, B. ephippiun, I. guentheri, I. parva, I. juipoca e H. binotatus revealaram diferenças na estrutura básica do acrossomo, peça intermediária e flagelo, apresentando características distintas dentro da família Brachycephalidae e subfamília trabomantinae, assim como dentro do gênero Pristimantis. Como característica marcante da ultra estrutura dos espermatozóides, observou-se a presença de um bastão paraxonemal em H. binotatus, B. ephippium, B. ternetzi e P. crepitans e a ausência desta estrutura em P. fenestratus, P. dundeei e todos os Ischnocnema amostrados. A divergência ultra-estrutural no bastão paraxonemal é coerente com dados recentes de filogenia molecular, que suportam transferência de H. binotatus do gênero Ischnocnema para um novo táxon e também agrupa as espécies I. guentheri, I. parva e I. juipoca em um mesmo clado. Além disso, a ultra-estructura dos espermatozóides indicou que B. ephippium não é proximamente relacionado as espécies de Ischnocnema, e que a taxonomia das espécie de Brachycephalidae deve ser reexaminada. As análises da ultra-estructura dos espermatozóides também corroboram os dados cromossômicos que indicam que P. crepitans estão erroneamente alocados no gênero Pristimantis e que as espécies I. paulodutrai e P. dundeei são proximamente relacionadas. Apesar do pequeno número de espécies amostradas, os dados citogenéticos e da ultra-estrutura dos espermatozóides de espécies das três famílias dos Terrarana do Brazil, apresentaram características inter- e intragenéricas não conservadas, levantamento de novos questionamentos e fortes evitências da existência de novas espécies. / Abstract: The Terrarana is the largest taxon of the Anura order, comprising 900 species. Recently this anuran group has undergone a series of taxonomical rearrangements. At first, these species were removed from the Leptodactylidae family and transferred to the synonymy of Brachycephalidae, and lately they were placed into a new taxon named Terrarana. Currently, the Terrarana species are distributed in the families, Eleutherodactylidae, Craugastoridae, Strabomantidae and Brachycephalidae. Despite being intensively studied, many aspects of their inter- and intrageneric relationships remain unclear. The South American Strabomantidae and Brachycephalidae are the least known clades regarding molecular phylogeny. In the present work, Brazilian Terrarana species of Pristimantis, Ischnocnema, Barycholos, Haddadus and Brachycephalus were studied by means of cytogenetical and sperm ultrastructural characteristics. Metaphases obtained from suspensions of intestinal epithelium were stained with Giemsa or submitted to silver staining (Ag- NOR) and fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques, in order to detect the nucleolus organizing region, and to C-banding for heterochromatin localization. Sperm ultrastructure was analyzed by transmission electron microscopy. The studied species were P. fenestratus (Borba and Manaus at Reserva Florestal Adolfo Ducke, Amazonas, and Rio Branco, Acre), P. dundeei (Chapada dos Guimarães, Rondonópolis, and Aripuanã, Mato Grosso), P. crepitans (Chapada dos Guimarães and São Vicente, Cuiabá, Mato Grosso), Ischnocnema paulodutrai (Ilhéus, Bahia), I. juipoca (Atibaia and Campos do Jordão, São Paulo), I. guentheri and I. parva (Mogi das Cruzes, São Paulo), B. ephippium (Mogi das Cruzes and Atibaia, São Paulo), Barycholos ternetzi (Uberlândia, Minas Gerais, and Porto Nacional, Tocantins), and Haddadus binotatus (Mogi das Cruzes and Ilhabela, São Paulo). The cytogenetical analyses allowed chromosomal characterization of the species P. fenestratus 2n=34 chromosomes, P. crepitans 2n=22, P. dundeei 2n=28 and I. paulodutrai 2n=30, which have not been previously analyzed in phylogenetical studies, in addition to B. ternetzi and I. juipoca 2n=22. The data revealed differences in C-banding and Ag-NOR, which indicated the existence of not yet described Pristimantis species in the Manaus, Rio Branco, and Aripuanã localities, and of Barycholos (from Tocantins) uncorrectly identified as P. fenestratus, P. dundeei and B. ternetzi. The cytogenetical analysis also indicates that the low chromosome number in P. crepitans is unique within this genus and suggests that this species is not closely related to its congeneric species. The karyotypical similarities between I. paulodutrai and P. dundeei indicate that these species could be close relatives. Moreover, an unusual case of intra-individual chromosomal variation in the fundamental number of several somatic cells was found in the P. fenestratus species, which may be a consequence of anomalous segregation of sister chromatids during mitosis. The sperm ultrastructure of the Brazilian species P. fenestratus, P. dundeei, P. crepitans, B. ternetzi, B. ephippiun, I. guentheri, I. parva, I. juipoca and H. binotatus revealed differences in the basic structures of the acrosome, midpiece and flagellum, showing distinct characteristics within the family Brachycephalidae and subfamily Strabomantinae, as well as within the genus Pristimantis. The most remarkable sperm characteristic was an axonemal fiber in H. binotatus, B. ephippium, B. ternetzi and P. crepitans, which has not been observed in P. fenestratus, P. dundeei and in all of the analyzed Ischnocnema specimens. The ultrastructural divergence in the axonemal fiber is in accordance with recent molecular data, which supported the transfer of H. binotatus from the Ischnocnema genus to a new taxon and also grouped the species I. guentheri, I. parva and I. juipoca in a same clade. In addition, the sperm ultrastructure showed that B. ephippium is not closely related to the Ischnocnema species, and that the taxonomy of the Brachycephalidae species should be reexamined. Furthermore, the sperm ultrastructure analysis corroborated chromosomal data indicating that P. crepitans is misallocated in the Pristimantis genus and that the I. paulodutrai and P. dundeei species are close relatives. Despite the small number of studied species, the cytogenetical and ultrastructural data on sperm ultrastructure of the three Brazilian Terrarana families revealed inter- and intrageneric non-conservative characteristics that generate new taxonomic questions within this anuran group and provide strong evidence of the existence of undescribed species in this taxon. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Irani Quagio Grassiotto, Luiz Roberto Malabarba / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baicere-Silva_ClariannaMartins_D.pdf: 11314225 bytes, checksum: beda03a1ee3e0b2d960e66de41e95061 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A família Characidae apresenta 16 subfamílias e noventa e dois gêneros não assinalados a nenhuma subfamília e, portanto, considerados incertae sedis. Neste grupo são inúmeros os problemas taxonômicos/filogenéticos. A maior parte destes gêneros encontravam-se alocados na subfamília Tetragonopterinae, mas dada à falta de evidências de que Tetragonopterinae constitui um grupo monofilético, manteve-se na subfamília apenas o gênero Tetragonopterus. Os gêneros incertae sedis, em Characidae, constituem um grupo imenso e heterogêneo de peixes, predominantemente pequenos, abundantes nos rios e em outros habitats aquáticos da região neotropical. O conhecimento das relações de parentesco entre os Characidae e, consequentemente, entre os antigos Tetragonopterinae, tem por base principalmente características osteológicas, de anatomia de partes moles e, mais recentemente, dados de seqüência molecular. Sabe-se que as características reprodutivas podem conter importantes sinais filogenéticos. Portanto, procedeu-se uma análise filogenética a partir de dados reprodutivos como a estrutura testicular, o tipo de espermiogênese e a ultraestrutura dos espermatozoides de representantes de alguns dos gêneros incertae sedis em Characidae, anteriormente alocados em Tetragonopterinae e outros Characiformes utilizados como grupo externo. A topologia da árvore obtida, foi parcialmente congruente com as hipóteses existentes para o grupo, comprovando a utilidade deste tipo de dado no que se refere à elucidação dos padrões evolutivos em Characidae / Abstract: The family Characidae presents 16 subfamilies and ninety-two genera not reported to any subfamily and therefore considered incertae sedis. In this group there are numerous taxonomic / phylogenetic problems. Most of these genera were allocated in the subfamily Tetragonopterinae, but given the lack of evidence that Tetragonopterinae constitute a monophyletic group, remains the only genus Tetragonopterus in the subfamily. Genera incertae sedis in Characidae are a vast and heterogeneous group of fish, mostly small, abundant in rivers and other aquatic habitats of the Neotropics. Researches of relationships among the Characidae and consequently between the old Tetragonopterinae is based mainly in external morphollogical and osteological features and, more recently, molecular sequence data. It is known that reproductive characteristics may contain significant phylogenetic signals. So we proceeded from a phylogenetic analysis of reproductive data such as testicular structure, the type of spermiogenesis and sperm ultrastructure of representatives of some of the genera incertae sedis in Characidae, previously allocated to Tetragonopterinae and other Characiformes used as outgroup. The tree topology obtained was parcially congruent with the hypotheses exist for the group proving the usefulness of this type of data in relation to elucidate the evolutionary patterns in characid / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Magister Scientiae (Medical Bioscience) - MSc(MBS) / Introduction: Mondia whitei commonly known as "White Ginger" is a highly acclaimed medicinal plant that is extensively used across Africa. M. whitei is used as treatment for sexual dysfunction and is considered to be an aphrodisiac by traditional medicine practitioners. Yet, scientific evidence to support these claims are minimal and those that are published possess ambiguity. To date, only one study reporting the in vitro effect of the aqueous rhizome extract of M. whitei on human sperm motility is available. Therefore, the aim of the study was to determine the in vitro effects of M. whitei in human sperm functions. Materials and Methods: Roots of Mondia whitei obtained from the tropical Kakamega rain forest, located in the Western Province of Kenya, were cleaned and chopped into smaller segments. These pieces were ovendried at 25℃ for 3 days and milled to form a powdery substance which was infused with hot (about 70℃) distilled water for 1 hour. After cooling and filtration, the extract was frozen at -20℃ and subsequently freeze-dried. The dried extract was then stored at 4℃ in a closed container until experimentation. A total of 60 semen samples were collected: 28 of them represented healthy sperm donors and 32 infertile patients. Among these subjects, oligozoospermic and asthenozoospermic semen samples were identified and analysed separately. Sperm were washed using human tubular fluid medium supplemented with bovine serum albumin (HTF-BSA) and incubated for 1 hour at 37℃ with different concentrations of M. whitei (0.0185, 0.185, 1.85, 18.5 and 185 μg/ml). A sample without M. whitei served as control. Sperm cell motility, vitality, reactive oxygen species (ROS) production, mitochondrial membrane potential (MMP), capacitation, acrosome reaction and DNA fragmentation were assessed. Results: Total motility and the percentage of sperm with intact MMP showed significant dose-dependent increases in both groups (patient and donor), while, the percentages of progressively motile sperm only revealed significant increases in the patient group. Besides, the percentage of ROS-positive spermatozoa showed significant trend towards higher concentrations in the patient group only. Conversely, a trend towards reduced sperm DNA-fragmentation could be observed in the patient, but not the donor group. Similar tendencies were noted in oligozoospermic and asthenozoospermic, but not for normozoospermic subjects. Yet, sperm vitality, capacitation, acrosome reaction and kinematic parameters were not affected. Conclusions: Phytochemicals present in M. whitei root extract maintains spermatozoa total motility, progressive motility and intact-MMP and DNA integrity. However, at therapeutic concentration (<1.85 μg/ml) it does not trigger sperm intrinsic superoxide production nor increase ROS by causing oxidative stress, that leads to DNA fragmentation. / National Research Foundation (NRF)

Melatonin is a product of the pineal gland and is postulated to play an antigonadotropic role in the reproductive system of mammals. The reproductive system of non-seasonally breeding mammals is believed to be not as responsive to melatonin treatment as that of seasonally breeding mammals. Recently, there has been increasing support from in vivo and in vitro studies, for the hypothesis that melatonin has negative effects on sperm physiology, especially on sperm motility. High and/or low seminal concentrations of melatonin have been associated with abnormalities in human sperm motility and concentration. In this study, I examined the effects of melatonin on the testis, epididymis and sperm physiology, using in vivo and in vitro experiments, in a non-seasonally breeding mammal. Treatment, in vivo, with exogenous melatonin for six weeks did not inhibit testosterone production or spermatogenesis, nor did it affect the mass of the testes and epididymides at dissection, the concentration the morphology of speimatozoa. However, melatonin in vivo had a small, but significant negative effect on sperm motility and sperm motility index. In vitro incubation of spermatozoa Fith melatonin reduced the percentage (%) of forward progressive movement (fpm), increased the % reduction in fpm, reduced the vigor or quality of sperm motility, reduced the sperm motility index, and delayed and/or prolonged the transition of one pattern of sperm motility to the subsequent patterns. Melatonin increased the pH of the culture medium, and the increased pH, and the ethanol utilized as a solvent for melatonin, both negatively affected all the sperm motility parameters that were assessed in my study. The effects of ethanol increased with time, and the effects of pH increased with both time and increasing pH. Melatonin in vitro did not inhibit capacitation and the acrosome reaction, but it delayed the onset and the progression of capacitation and the acrosome reaction. These results suggest that while melatonin did not inhibit spermatogenesis in the Wistar rat, it may influence sperm motility. Therefore, the presence of high concentrations of melatonin in the reproductive fluids may inhibit sperm motility. With further detailed research, melatonin may have a potential use as a contraceptive drug.

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Orientadores: Shirlei Maria Recco Pimentel , Gisele Orlandi Introíni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JulioSergiodos_D.pdf: 6299599 bytes, checksum: 7b5ca57cc296e80450e00cfd661976ad (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: Leiuperinae, Leptodactylinae e Paratelmatobiinae. Com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 23 espécies de leptodactilídeos buscando-se contribuir com elementos para o entendimento de incertezas filogenéticas. Em Pseudopaludicola, gênero alocado em Leiuperinae, é comparado o espermatozoide de representantes do grupo P. pusilla e de espécies dos quatro clados recuperados na filogenia molecular, os quais correspondem aos grupos cromossômicos 2n=22, 20, 18 e 16. A análise das espécies de Pseudopaludicola mostrou que as cabeças dos espermatozoides são semelhantes e contém a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal. Já as caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola apresentam diferenças marcantes. Nas espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. falcipes e P. mineira, as caudas exibem fibras acessórias (justa-axonemal, membrana ondulante e a fibra axial). Essas fibras também são observadas em P. ternetzi e P. ameghini, ambas do clado com 2n=20, mas nas suas caudas a fibra axial é mais desenvolvida. Nos indivíduos do clado com número cromossômico 2n=18, P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula e Pseudopaludicola sp. 2 e com 2n=16, P. mystacalis, a cauda apresenta a membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, o qual é mais curto do que a membrana ondulante da cauda dos Pseudopaludicola com número cromossômico 2n=22 e 20. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides indicam que esses caracteres podem ser filogeneticamente informativos, quando mapeados na filogenia molecular, pois os perfis ultraestruturais da cauda coincidem parcialmente com a formação dos quatro clados filogenéticos e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução do gênero Pseudopaludicola. A análise comparativa de espécies entre os gêneros de leiuperíneos mostra que as caudas dos espermatozoides de Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada e P. cuvieri), também exibem fibras acessórias, como a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, contudo, a membrana ondulante nesse gênero é mais longa que aquela encontrada em Pseudopaludicola. Além disso, as caudas dos espermatozoides de Physalaemus não mostram fibra axial. Do gênero Engystomops, grupo irmão de Physalaemus, foram analisadas E. petersi, E. freibergi e E. puyango, cujas caudas apresentam fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Esses gêneros diferem ainda pela membrana ondulante mais curta em Engystomops, corroborando a revalidação do gênero Engystomops. A cauda de Engystomops puyango difere de E. petersi e E. freibergi, clado Duovox, e é igual a E. pustulosus, do clado Edentulus, indicando a necessidade de ampliar os estudos desse gênero. A espécie Pleurodema diplolister, do gênero próximo a Physalaemus e Engystomops, apresenta na cauda do espermatozoide a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, as quais são semelhantes àquelas observadas nas espécies de Physalaemus, entretanto, a membrana ondulante de P. diplolister é menor que a observada em Physalaemus. A comparação dos espermatozoides de representantes das outras subfamílias de Leptodactylidae mostrou que Paratelmatobiinae, representada por P. poecilogaster, apresenta estruturas iguais àquelas observadas nos Pseudopaludicola do clado com número cromossômico 2n=22. Por outro lado, a espécie analisada, Leptodactylus natalensis, Leptodactylinae, apresenta fibra axial bem desenvolvida, diferente daquela exibida nos espermatozoides de Engystomops, Pseudopaludicola e P. poecilogaster. A outra espécie de Leptoctylinae, Adenomera marmorata, a qual era alocada em Leptodactylus, apresenta apenas o axonema na cauda do espermatozoide. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, corrobora com a re-alocação de A. marmorata como espécie válida e diferente de Leptodactylus. A descrição ultraestrutural dos gametas masculinos leptodactilídeos mostra caracteres filogenéticos informativos, principalmente aqueles das caudas dessas células, que podem ser usados para o entendimento dos relacionamentos intragenérico e intergenérico. / Abstract: The anurans of the family Leptodactylidae are distributed in three subfamilies ¿Leiuperinae, Leptodactylinae and Paratelmatobiinae. The spermatozoa of 23 leptodactylid species were analyzed under an electron microscope in order to provide evidence for the better understanding of a number of phylogenetic uncertainties. In the case of the leiuperine genus Pseudopaludicola, the sperm of the representative of the P. pusilla group and those of four clades identified in the molecular phylogeny, which correspond to well-defined chromosomal groups with 2n=22, 20, 18, and 16, were compared. The analysis of the different Pseudopaludicola species found spermatozoa with heads of similar shape, which contain an acrosomal vesicle covering the subacrosomal cone. However, the tails present marked differences. In the species with 2n=22, that is, Pseudopaludicola sp. 1 (P. pusilla group), P. saltica, P. falcipes and P. mineira the tails present accessory fibers (juxtaxonemal fiber, undulating membrane and axial fiber). Fibers of this type are also observed in P. ternetzi and P. ameghini (representatives of the 2n=20 clade), although the axial fiber is more developed. In the specimens of the 2n = 18 clade (P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula and Pseudopaludicola sp. 2) and the 2n=16 clade (P. mystacalis), the tail has a thick undulating membrane, characterized by a paraxonemal rod, which is shorter than the undulating membrane of the tail of Pseudopaludicola (2n=22 and 20). The ultrastructural morphological differences observed in the tails of the spermatozoa indicates that these traits are phylogenetically informative, given their partial correspondence to the four clades identified in the molecular studies, and provide evidence of a progressive simplification of the spermatozoa during the evolution of the genus Pseudopaludicola. The comparative analysis of the leiuperine genera indicates that in Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada and P. cuvieri), the tail of the spermatozoon also shows accessory fibers, such as the juxtaxonemal and the undulating membrane, although in this genus, the membrane is longer than that observed in Pseudopaludicola. In addition, there is no axial fiber on the tail of the spermatozoon in Physalaemus. In the case of Engystomops, sister group of Physalaemus, the species E. petersi, E. freibergi, and E. puyango the sperm tail presents all three types of fiber (juxtaxonemal, undulating membrane and axial fiber). The tail of these two genera also differ each other for the shorter undulating membrane in Engystomops, corroborating the revalidation of the genus Engystomops. Additionaly, the tail of E.puyango differs from E. petersi and E. freibergi, Duovox clade, and it is similar to E. pustulosus, Edentulus clade, indicating the need of more studies in this genus. In Pleurodema diplolister, representing the genus closest to Physalaemus and Engystomops, the sperm tail has a juxtaxonemal fiber and undulating membrane, which are similar to those found in Physalaemus, although the membrane observed in Pleurodema diplolister is shorter than that observed in Physalaemus. Comparisons with other leptodactylid subfamilies indicated that the Paratelmatobiinae, represented by P. poecilogaster, has the same structures as those observed in the 2n = 22 clade of Pseudopaludicola. On the other hand, the leptodactyline species analyzed, Leptodactylus natalensis, has a well-developed axial fiber, distinct from that found in the sperm of Engystomops, Pseudopaludicola and P. poecilogaster. However, in the other leptodactyline species analyzed, Adenomera marmorata, previously allocated to Leptodactylus, the sperm tail has only an axoneme. This ultrastructural difference in the tails of A. marmorata and L. natalensis supports the status of A. marmorata as a valid taxon distinct from Leptodactylus. Overall, then, the ultrastructural description of the male gametes of a selection of leptodactylid species provided informative phylogenetic characters, especially with regard to the morphology of the sperm tails, which can be used for understanding of the intrageneric and intergeneric relationships / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural