A criação de aves em cativeiro pode ser uma ferramenta importante de auxílio à conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a reprodução natural em cativeiro nem sempre é viável, e os animais que se encontram pareados muitas vezes não oferecem descendentes geneticamente interessantes para a manutenção da espécie em longo prazo. Na tentativa de contornar tais problemas, biotécnicas como a colheita de sêmen, inseminação artificial e criopreservação de gametas podem ser ferramentas interessantes no manejo genético de populações ex situ e in situ. Nesse sentido, a padronização de uma técnica de colheita de sêmen, bem como o conhecimento sobre parâmetros seminais das diferentes espécies são de extremo valor para programas de reprodução assistida. Por se tratar de espécies silvestres, a colheita por eletroestimulação encaixa-se bem às necessidades devido ao fato de não exigir treinamento prévio dos animais e ser de rápida execução. Neste trabalho verificamos a importância deste método na colheita de sêmen de animais não condicionados, visto que a pré-estimulação resultou em amostras seminais apenas em Anseriformes, e, já a eletroestimulação, possibilitou a obtenção de sêmen em todas as ordens em que foi testada, em pelo menos uma espécie de cada ordem. Observou-se uma tendência a sazonalidade da produção espermática para a maioria das espécies em que foi possível obter amostras de sêmen, sendo que apenas urubu rei, cisne do pescoço preto e pato coscoroba tiveram amostras em três ou quatro estações do ano. Por fim, oferecemos alguns dados a respeito das características seminais encontradas nessas espécies. Acreditamos que os resultados dessa pesquisa servirão como base não apenas para o estabelecimento de programas de inseminação artificial, como também para a formação de bancos de germoplasma para espécies raras ou ameaçadas no Brasil. / Breeding birds in captivity can be an important tool to aid conservation of endangered species. However, the natural reproduction in captive is not always viable, and animals that are matched often do not offer genetically interesting offspring to maintain the species in the long term. In the attempt to overcome these problems, biotechniques such as semen collection, artificial insemination and gamete cryopreservation can be interesting tools for the genetic maintenance of ex situ and in situ populations. In this regard, the standardization of a semen collection technique and the knowledge of seminal parameters for different species are extremely valuable for assisted reproduction programs. Since those are wild species, semen collection by electro stimulation fits well into the needs due to the fact that it does not require prior training of animals and the execution is fast. In this work we verified the importance of this method in the collection of semen from unconditioned animals, since pre-stimulation resulted in seminal samples only in Anseriformes, and the electrical stimulation enables obtaining semen of all orders that were tested in at least one species of each order. Seasonality of sperm production was observed for most of the species from which it was possible to obtain semen samples. Only vulture king, black neck swan and coscoroba duck had samples at three or four seasons of the year. Finally, we offer some data about the seminal characteristics found in these species. We believe that the results of this research will serve as a basis not only for the establishment of artificial insemination programs, but also for the formation of germplasm banks for rare or endangered species in Brazil..

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-08T14:39:09Z No. of bitstreams: 1 Felipe Costa Almeida.pdf: 906567 bytes, checksum: 56e2db3d9385785462dcff3582c0c339 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T14:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felipe Costa Almeida.pdf: 906567 bytes, checksum: 56e2db3d9385785462dcff3582c0c339 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / This work aimed to study fertility of sperm obtained from epididymis tail of Nelore bulls and subjected to cryopreservation in extenders with three different concentrations of glycerol, and stabilization times at 5 °C and antioxidants addition to semen extender. Epididymides were obtained from slaughterhouse up to one hour after the death of the animal, placed in individual plastic bags and transported in box at room temperature (28 °C). At the laboratory, spermatozoa were recovered from epididymis tail using flotation technique and then diluted in Tris-yolk egg. In experiment 1 three concentrations of glycerol (3%, 5% and 7%) was evaluated at different stabilization times (0h, 2h and 4h). In the second experiment was evaluated the effect of adding enzymatic antioxidants in epididymal spermatozoa cryopreservation, resulting in following experimental groups: (Control; CAT 50 and 100 U/mL, and SOD 50 and 100 U/mL) at a concentration of 60 x 106 sperm/mL, packaged in straws (0.25 mL) and frozen in automated system. In both experiments, semen samples were thawed at 37 °C/30 sec was evaluated for plasma membrane integrity (PMi), acrosomal integrity (Aci), mitochondrial membrane potential (MMP) and sperm kinematics. In Experiment 1, PMi and Aci analyzes demonstrated values lower (P<0.05) for glycerol 3%, at stabilization time at 4h compared to other times. In kinematic evaluation, sperm values were lower (P<0.05) for BCF parameter in glycerol 3% and 7% groups at 2h of stabilization time compared to glycerol 5%; for ALH, glycerol 3% group in stabilization time at 4h demonstrated lowest (P<0.05) compared to other groups. Glycerol 5% group, settling time 0h, showed lower values (P <0.05) for the hPMM and Aci parameters, when compared to other groups. For IVF experiment, only glycerol 5% at stabilization time at 4h was used. Forty percents of embryonic viability were obtained from oocytes used. In experiment 2, parameters of MT, MP, VCL, VSL, VAP, STR, ALH and BFC did not differ (P> 0.05) between control and treated groups. However, significant differences (P <0.05) were observed between groups for Linearity (LIN) and oscillation index (WOB), being less than 100 SOD treatment (P<0.05) than other groups. Addition of SOD 100 determined lower (P<0.001) percentages of blastocysts post-cleavage. Based on results of kinematic and in vitro fertilization, it is possible to conclude that spermatozoa cryopreservation obtained from epididymis tail of bulls should be performed using extender with glycerol at 5% of concentration and stabilization time at 5 °C during 4h. Addition of CAT concentrations of 50 and 100 U/mL and SOD at concentration of 50 U/mL did not affect the sperm quality. Addition of SOD at a concentration of 100 U/mL reduces fertility of epididymal sperm after cryopreservation. However, it is noteworthy that sperm obtained from epididymis tail of bulls can be successfully used in IVF programs. / Este trabalho teve como objetivo estudar a fertilidade de espermatozoides obtidos da cauda do epidídimo de touros da raça Nelore e submetidos à criopreservação em diluentes com três diferentes concentrações de glicerol, tempos de estabilização a 5 °C e adição de antioxidantes ao diluidor de sêmen. Os epidídimos foram obtidos em matadouro, até uma hora após a morte do animal, colocados em sacos plásticos individuais e transportados em caixa térmica em temperatura ambiente (28 ºC). No laboratório, os espermatozoides foram recuperados da cauda do epidídimo utilizando a técnica de flutuação e, a seguir, diluídos em Tris-gema. No experimento 1 foi avaliado diferentes concentrações de glicerol (3%, 5% e 7%) em diferentes tempos de estabilização (0h, 2h e 4h). No experimento 2 foi avaliado o efeito da adição de antioxidantes enzimáticos na criopreservação de espermatozoides epididimários, constituindo os seguintes grupos experimentais: (Controle; CAT 50 e 100 U/mL; SOD 50 e 100 U/mL), na concentração de 60 x 106 espermatozoides/mL, acondicionados em palhetas (0,25 mL) e congelados em método automatizado. Em ambos os experimentos, as amostras de sêmen foram descongeladas a 37 °C/ 30 s e avaliadas quanto a integridade de membrana plasmática (iMP), integridade acrossomal (iAc), potencial de membrana mitocondrial (PMM) e cinética espermática. No experimento 1, as análises de iMP e iAc apresentaram valores inferiores (P<0,05) para o glicerol 3%, no tempo de 4h em comparação aos demais tempos de estabilização. Na avaliação da cinética espermática, foram encontrados valores inferiores (P<0,05) para o parâmetro BCF nos tratamentos glicerol 3% e 7%, no tempo de 2h em comparação ao do glicerol 5%; para ALH, o grupo glicerol 3%, no tempo 4h de estabilização apresentou menor valor (P<0,05) em relação aos demais grupos. O grupo glicerol 5%, no tempo de estabilização 0h, apresentou valores inferiores (P<0,05) para os parâmetros de aPMM e iAc, quando comparado aos demais grupos. Para a FIV foi utilizado o grupo glicerol 5%, no tempo de estabilização 4h. Foram obtidos 40% de viabilidade embrionária dos oócitos utilizados. No experimento 2, os parâmetros de MT, MP, VCL, VSL, VAP, STR, ALH e BFC não diferiram (P>0,05) entre o grupo controle e os grupos tratados. Todavia, diferenças significativas (P<0,05) foram observadas entre os grupos para Linearidade (LIN) e no índice de oscilação (WOB), sendo o tratamento SOD 100 inferior (P<0,05) aos demais grupos. A adição de SOD 100 determinou ainda menores (P<0,001) porcentagens de blastocistos pós-clivagem. Com base nos resultados de cinética e fertilização in vitro, é possível concluir que a criopreservação de espermatozoides obtidos da cauda do epidídimo de touros deve ser realizada utilizando diluidor com glicerol na concentração de 5% e tempo de estabilização a 5 °C de 4h. A adição de CAT nas concentrações de 50 e 100 U/mL e SOD na concentração de 50 U/mL não influencia na qualidade espermática. A adição de SOD na concentração de 100 U/mL reduz a fertilidade dos espermatozoides epididimários pós-criopreservação. Todavia, ressalta-se que espermatozoides obtidos da cauda do

La finalidad del presente estudio fue evaluar en 2 tiempos la calidad espermática de muestras de semen de ovino tratadas por la técnica de gradiente de densidad con respecto a muestras no tratadas. Se utilizó un total de 102 eyaculados de carnero que presentaron en promedio un volumen de 1.12 ± 0.34 ml, color blanquecino, aspecto cremoso, pH de 6.73 ± 0.25, concentración inicial de 3.54 x 109 ± 5.30 x 108 esp/ml y motilidad masal alrededor del grado 4. Posteriormente, cada eyaculado se dividió en un grupo control y experimental de volúmenes iguales. El semen del grupo control fue diluido con Triladyl® y el experimental, tratado con la técnica de gradiente de densidad. La tasa de recuperación espermática después del tratamiento fue del 31.50 ± 10.89%. Se encontró un aumento significativo (p<0.05) en la motilidad individual progresiva, el porcentaje de espermatozoides vivos y de espermatozoides con membrana intacta en las muestras tratadas con respecto al grupo control (92.07 ± 1.81% vs. 85.74 ± 1.75%, 78.42 ± 5.13% vs. 75.19 ± 4.59%, 78.55 ± 4.34% vs. 73.37 ± 4.48%, respectivamente); así como una disminución significativa (p<0.05) en el porcentaje de espermatozoides anormales en las muestras del grupo experimental con respecto al grupo control (8.41 ± 1.33% vs. 9.94 ± 1.73%). El resto de muestras de ambos grupos fue distribuido en pajillas de 0.25 ml y enfriadas hasta alcanzar los 5°C para su refrigeración por 24 horas. Las muestras tratadas con gradiente de densidad presentaron un aumento significativos (p<0.05), con respecto al grupo control, en motilidad individual progresiva, el porcentaje de espermatozoides vivos y el porcentaje de espermatozoides con membrana intacta (86.94 ± 3.14% vs. 82.44 ± 2.26%, 71.24 ± 4.11% vs. 68.82 ± 4.15%, 70.87 ± 3.11% vs. 67.98 ± 4.42%, respectivamente). En conclusión, la técnica de gradiente favoreció la obtención de un mayor número de espermatozoides vivos, de mejor motilidad y con membrana intacta, así como la disminución del número de espermatozoides anormales tanto en muestras frescas como refrigeradas. The purpose of the present study was to assess at 2 evaluation times the sperm quality from ram semen treated with the density gradient technique and to compare it against non-treated ram semen. A total of 102 ejaculates were evaluated. The mean macroscopic parameters were: volume of 1.12 ± 0.34 ml, creamy white color, creamy-dense appearance, pH of 6.73 ± 0.25, initial concentration of 3.54 x 109 ± 5.30 x 108 spz/ml and mass motility around grade 4. Then, each ejaculate was divided into two equal volume groups: the control and experimental group. For the control group, the sample was diluted in Triladyl®. The experimental group was treated with the density gradient technique. The recovery rate after treatment was 31.50 ± 10.89%.The results showed that, at zero hour, samples treated undergo a significant increase (p <0.05), compared with the control group, in individual progressive motility, percentage of living spermatozoa and the percentage of spermatozoa with intact membrane (92.07 ± 1.81% vs. 85.74 ± 1.75%, 78.42 ± 5.13% vs. 75.19 ± 4.59%, 78.55 ± 4.34% vs. 73.37 ± 4.48%, respectively). There was also a significant decrease (p <0.05) in the percentage of abnormal in samples from the experimental group compared to control group spermatozoa (8.41 ± 1.33% vs. 9.94 ± 1.73%). The remaining samples, from both the control and experimental group, were distributed in 0.25 ml straws and cooled to 5°C for 24 hours refrigeration. Then, the samples were evaluated. After 24 hours at 5°C, the samples treated with the density gradient technique showed significantly greater values (p <0.05), compared with the control group, in individual progressive motility, percentage of living spermatozoa and the percentage of spermatozoa with intact membrane (86.94 ± 3.14% vs. 82.44 ± 2.26%, 71.24 ± 4.11% vs. 68.82 ± 4.15%, 70.87 ± 3.11% vs. 67.98 ± 4.42%, respectively). In conclusion, in the present study, the density gradient technique allowed to obtain better a greater number of living spermatozoa with better motility, intact membrane and with lower abnormalities in fresh and refrigerated samples.

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 &#61; 0,9356; p &lt; 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p &lt; 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p &gt; 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p &lt; 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p &gt; 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 &#61; 0.9356; p &lt; 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p &lt; 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p &gt; 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p &lt; 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p &gt; 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30&omicron; dia do ciclo espermático comparado a 7&omicron; dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes&#39; activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

O processo de fertilização está intimamente relacionado ao íon cálcio. Há relatos que bloqueadores de canais de íons cálcio voltagem-dependentes, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar à infertilidade masculina, mas poucos relatos são os de seus efeitos sobre o oócito. O objetivo deste experimento foi verificar a influência dos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, sobre os gametas masculino e feminino. Machos e fêmeas hamsters foram utilizados em testes in vivo e in vitro. Foram realizados tratamentos in vitro no Experimento I: espermatozóides foram capacitados em meios contendo três concentrações de bloqueadores de canais de cálcio e avaliados quanto à capacitação espermática, hiperatividade e fertilidade in vitro. Oócitos foram tratados previamente por 30 minutos com quatro concentrações de antagonistas de canais de cálcio e submetidos a teste de fertilização in vitro e à avaliação do comportamento dos grânulos corticais. No Experimento II, os bloqueadores de canais de cálcio foram administrados, duas vezes ao dia, por 60 dias nos machos e por 30 dias nas fêmeas, que foram analisados pela fertilidade in vivo, capacitação e hiperatividade espermáticas, fecundação in vitro e exocitose dos grânulos corticais, e microscopia eletrônica de transmissão nos oócitos tratados in vivo. No Experimento III, a concentração intracelular de cálcio foi mensurada em espermatozóides e oócitos na presença dos bloqueadores de canais de cálcio. Como resultados, no Experimento I, os fármacos atuaram de forma dose-dependente, os espermatozóides tratados apresentaram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fecundação in vitro. Os oócitos tratados mostraram menor taxa de fertilização in vitro em relação ao controle e, nos grupos verapamil e diltiazem, exocitose parcial dos grânulos corticais e ativação não completa dos oócitos. O Experimento II demonstrou que os machos dos grupos tratados tiveram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fertilidade in vitro em relação ao grupo controle, e nos grupos verapamil e nifedipina houve uma redução da fertilidade refletida no número de fêmeas paridas em relação ao grupo controle e diltiazem. A fecundação in vivo das fêmeas tratadas não variou entre os grupos; porém, a taxa de fertilização in vitro dos oócitos de fêmeas tratadas in vivo com os antagonistas foi menor em relação ao controle; tanto a exocitose dos grânulos corticais quanto a microscopia eletrônica não foram detectadas diferenças entre os grupos. As ninhadas de fêmeas que receberam a terapia no início da gestação apresentaram menor peso ao nascimento e maior taxa de mortalidade. No Experimento III, notou-se que os fármacos causaram um bloqueio do influxo de cálcio extracelular tanto em espermatozóides como em oócitos. Concluiu-se que, tanto espermatozóides como oócitos, possuem em sua membrana plasmática canais de íons cálcio sensíveis aos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L. Nos tratamentos in vitro, estes fármacos atuaram negativamente na capacidade de fecundação dos espermatozóides e dos oócitos. A terapia com os bloqueadores de canais de cálcio reduziu a fertilidade nos machos, mas não nas fêmeas. A administração dos bloqueadores no início da gestação causou efeitos teratogênicos / Fertilization process is closely related with calcium ion. There are reports about voltage-dependent calcium ion channel blockers of anti-hypertension therapeutic use causing male infertility, but there are few reports about such effects on the oocyte. The main goal of this experiment was to check the influence of verapamil, nifedipine and diltiazem (L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers) on spermatozoa and oocytes. Male and female hamsters were used for in vivo and in vitro experiment. In vitro treatments were preformed in the Experiment I, in which: spermatozoa were capacitated in three concentrations of the three calcium ion channel blockers and they were evaluated for sperm capacitation, hyperactivity and in vitro fertility. Oocytes were incubated for 30 minutes in four concentrations of the same calcium channel antagonists and submitted to in vitro fertilization and evaluation of cortical granules exocytosis. In the Experiment II, calcium channel blockers were supplied twice per day to males during 60 days and to females during 30 days. After this period, drug effects on the animals were evaluated through in vivo fertility, sperm capacitation and hyperactivity, in vitro fertilization, cortical granules exocytosis and transmission electronic microscopy of in vivo treated oocytes. In the Experiment III, the intracellular calcium concentrations were measured in spermatozoa and oocytes in the presence of calcium ion channel blockers. As results, in the Experiment I, the antagonists presented dose-dependent effects, affecting sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate on treated spermatozoa. Treated oocytes presented lower in vitro fertilization rate when compared to the control group and, in the verapamil and diltiazem groups, cortical granules exocytosis was partial and oocyte activation was not concluded. Experiment II showed that male hamsters of treatment groups presented lower sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate and there were fewer pregnant females, demonstrating a reducing male fertility in verapamil and nifedipine groups when compared to the control and diltiazem groups. In vivo fertility of treated females did not change among groups; however, in vitro fertilization rates in oocytes of calcium antagonists in vivo treated females were lower. Nor cortical granules exocytosis neither electronic microscopy detected differences among groups. Progeny of females that received the therapy in the beginning of pregnancy presented lower birth weight and higher mortality rate. In the Experiment III, the antagonists blocked extracellular calcium influx in spermatozoa and in oocytes. It is concluded that, there were calcium ion channels with sensibility to L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers in the plasmatic membrane of spermatozoa and oocytes. In in vitro treatments, these antagonists influenced negatively spermatozoa and oocytes capacity of fertilization. Calcium channel blocker therapy reduced the fertility in males, but not in females. Calcium channel blockers supplied in the beginning pregnancy caused teratogenic effects

A preservação do sêmen suíno refrigerado para fins de inseminação artificial é a forma mais utilizada no mundo. Para tal, os espermatozoides são diluídos em meios que forneçam substratos para nutrir e proteger estas células. Porém, a faixa de temperatura de armazenamento do sêmen suíno refrigerado não é capaz de cessar completamente os mecanismos metabólicos dos espermatozoides, que em ambiente aeróbico da dose inseminante, produzem e liberam continuamente produtos do metabolismo do oxigênio. A ação das espécies reativas de oxigênio sobre o espermatozoide é uma das razões do declínio na população de células espermaticas estrutural e funcionalmente aptas à fertilizarem os gametas femininos. Portanto, a adição de um composto antioxidante ao meio diluidor poderia melhorar ou manter constante o número de espermatozoides viáveis ao longo do período de conservação da dose inseminante. Neste contexto, este trabalho objetivou verificar se a adição do antioxidante resveratrol geraria modificações positivas em parâmetros celulares relacionados à qualidade do sêmen suíno refrigerado à 15-17°C avaliados por sistema computadorizado da motilidade espermática e citometria de fluxo (experimento in vitro), e se este antioxidante melhoraria os índices de fertilidade na inseminação artificial intrauterina (IAIU) através da recuperação, contagem e identificação dos embriões (experimento in vivo). As concentrações testadas no experimento in vitro não superaram os resultados do tratamento controle (p&lt;0,05), sendo a concentração de 1,0 mM prejudicial ao espermatozoide suíno (p&lt;0,05). A utilização da concentração de 0,01 mM de resveratrol para inseminação das fêmeas suínas no experimento in vivo não apresentou efeito positivo nos índices de taxa de prenhez e fertilidade ajustada total (p&gt;0,05), além de ter resultado em uma baixa taxa de embriões viáveis (p&lt;0,05), quando comparados ao tratamento controle. Deste modo, pode concluir que não é indicado a adição do antioxidante resveratrol ao meio diluidor para inseminação artificial, uma vez que compromete a qualidade das células espermáticas do reprodutor suíno e impacta negativamente na fertilidade das fêmeas. / The preservation of chilled boar semen for artificial insemination is the most performed worldwide. For this, the sperm are extended in medium that provides substrates to nourish and protect these cells. However, the storage temperature range of chilled semen is not able to completely stop the metabolic mechanisms of sperm, which keeps producting and releasing oxygen reactive products in aerobic environment of insemination doses. The action of reactive oxygen species on the sperm is one of the reasons for decreasing sperm population with structural and functional capacity to fertilize the female gamete. Therefore, the addition of antioxidant compound to the extender medium could improve or maintain the number of viable spermatozoa throughout the conservation time of insemination doses. In this context, this work aimed to determine whether addition of antioxidant resveratrol would generate positive changes in cell parameters related to the quality of boar semen cooled to 15-17 °C assessed by computered analysis of sperm motility and flow citometry (in vitro experiment) and whether this antioxidant would improve fertility rates using intrauterine insemination (IUI) by the recovery, counting and embryos identification (in vivo experiment). The concentrations tested in vitro experiment have not exceed control treatment results (p &lt;0.05), with the concentration of 1.0 mM being detrimental to the boar spermatozoa (p &lt;0.05). The concentration of 0.01 mM of resveratrol used for gilts insemination in experiment in vivo has not shown positive effect on pregnancy rate and the total adjusted fertility (p&gt; 0.05) and have resulted in a low rate viable embryos (p &lt;0.05) compared to control. Thus, we conclued that the addition of resveratrol antioxidant in boar extender medium is not suitable for artificial insemination, once it compromises the quality of boar sperm cells and impairs on female fertility.

A criopreservação, como já conhecido, causa danos da função celular podendo, com isso, apresentar redução da fertilidade. O desenvolvimento de técnicas para avaliar a viabilidade espermática, que visam aperfeiçoar o processo de avaliação seminal tem sido meta de muitas pesquisas. Este trabalho foi dividido em dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para o desenvolvimento e validação de técnicas práticas e de alta repetibilidade para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial de espermatozóides bovinos pela associação de sondas fluorescentes. O experimento 2 foi realizado para avaliar os efeitos que a criopreservação pode causar sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (pela técnica desenvolvida no experimento 1) e estrutura da cromatina de espermatozóides bovinos frente a dois diluidores diferentes, bem como verificar a existência de correlações entre alterações nas membranas e características de motilidade em espermatozóides bovinos criopreservados. No experimento 1 as associações das sondas iodeto de propídio (PI, para avaliar integridade da membrana plasmática) e aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA, para avaliar a integridade acrossomal), foram divididas em quatro protocolos, nos quais foram testadas diferentes sondas para avaliar a função mitocondrial. Rodamina 123 (R123, protocolo 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocolo 2), CMXRos ou MitoTracker red (protocolo 3) e no: iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1, protocolo 4). Estes protocolos foram testados e validados. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância, teste de Fisher e à análise de regressão linear pelo programa Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998). O protocolo 1 não apresentou resultados satisfatórios, não sendo possível validar, enquanto, os protocolos 2, 3 e 4 foram validados e apresentaram resultados bastante consistentes. O protocolo 4 foi escolhido para a utilização no experimento 2. Para o experimento 2 foram realizadas sete colheitas de sêmen de oito touros puros da raça Simental. Após a colheita, o sêmen foi avaliado quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor visualmente, motilidade por sistema computadorizado (CASA), características morfológicas por microscopia de interferência diferencial, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, pela associação de FITC-PSA, PI e JC-1, e integridade da estrutura da cromatina, pela técnica da acridina laranja. Após as análises, o sêmen foi dividido em duas alíquotas, sendo uma das alíquotas diluída com o diluidor Bioxcell&reg; e a outra com o diluidor Botu-Bov&reg;, envasado em palhetas e submetido a congelação com um sistema automatizado. Duas palhetas cada tratamento foram descongeladas e o sêmen foi avaliado quanto a motilidade e vigor visualmente, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial e estrutura da cromatina. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1985), os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey. Foram calculadas correlações lineares de Pearson. O nível de significância foi fixado em 5%. Foram observados efeitos da criopreservação e do diluidor sobre motilidade e vigor visual, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial. De forma que, após a criopreservação houve aumento dos danos nas estruturas espermática e o diluidor Botu-Bov&reg; apresentou a maioria das características melhores quando comparado ao diluidor Bioxcell&reg; / The process of cryopreservation causes damages in the sperm cellular function which may lead to a reduction in fertility. New techniques to evaluate sperm viability may improve the process of semen evaluation. The present work was divided in two experiments. Experiment 1 aimed the development and validation of practical techniques with high repetibility for simultaneous evaluation of integrity of plasmatic and acrosomal membrane and mitochondrial function of bovine spermatozoa by the strategic association of fluorescent probes. Objective of experiment 2 was to validate the effects of cryopreservation using two differents diluents on sperm motility, plasmatic, acrosomal, mitochondrial membranes integrity and chromatin structure of bovine spermatozoa. A second objective was to verify the correlations between alterations in membranes and motility characteristics in cryopreserved bovine spermatozoa. In experiment 1 propidium iodide (PI, to evaluate plasmatic membrane integrity) and the Pisum sativum agglutinin conjugated with fluorescein isothicyonate- (FITC-PSA, to evaluate acrosomal integrity). Probes were associated to evaluate mitochondrial function in four protocols: Rhodamine 123 (R123, Protocol 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocol 2), CMXRos or MitoTracker red (protocol 3), and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1, protocol 4). Results were submitted to analysis of variance, Fisher’s test and linear regression analysis by the program Stat-View&reg; ( SAS Institute, Inc.1998). It was not possible to validate protocol 1, while the protocols 2, 3 and 4 were validated and showed consistent results. Protocol 4 was used in experiment 2. For experiment 2 seven ejaculates were collected from eight Simental bulls. Volume, concentration, motility and vigour of semen were evaluated subjectively, motility by computer system (CASA), morphological characteristics by differential interference microscopy, plasmatic and acrosomal membranes integrity and, mitochondrial function with FITC-PSA, PI and JC-1 association, and chromatin integrity by acridine orange technique. Then, semen was divided in two aliquots. One was diluted with Bioxcell&reg; and the other with Botu-Bov&reg; diluent, packaged in 0.5 mL straws and frozen using na automated system. Two straws of sêmen from each treatment were thawed and the semen parameter evaluated, as described above. The statistical analysis was performed using the Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 1985). Data were submitted to analysis of variance and Tukey’s test. Pearson’s linear correlations were calculated. Cryopreservation increased damages in spermatic structures. Botu-Bov&reg; diluent was better in preserve the motility and membrane integrity (P&it;0,05) when compared to Bioxcell&reg; diluent