Made available in DSpace on 2012-05-07T14:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000046.pdf: 2202097 bytes, checksum: 1b137d680a9dec4407227e6d49587e72 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os estafilococos são bactérias oportunistas, vastamente distribuídas na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves. Staphylococcus aureus é o patógeno humano de maior importância entre os estafilococos por causar infecções severas, de origem comunitária e hospitalar. Além de infecções da pele, S. aureus pode causar intoxicação alimentar, por produzir enterotoxinas (SEs); Síndrome da Pele Escaldada, causada pela produção de toxinas esfoliativas (ETA e ETB) e síndrome do choque tóxico, causada pela toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1). Neste estudo, foram analisados oitenta isolados clínicos de S. aureus, oriundos de diversas fontes de infecção e diferentes setores de um hospital público da cidade do Recife/PE. A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi aplicada para detecção dos genes das toxinas estafilocócicas e uma variação da PCR, a PCRmultiplex, permitiu numa mesma reação detectar vários genes responsáveis pelas exotoxinas, contribuindo para o estudo da epidemiologia da bactéria mencionada e seu envolvimento em infecções humanas. Foi investigada, também, a diversidade dos isolados de S. aureus e sua distribuição no ambiente hospitalar, através da análise do polimorfismo da região 3 terminal do gene da coagulase (PCR coa) e da região intergênica 16S-23S dos operons ribossomais (ribotipagem-PCR). Os genótipos dos genes toxigênicos encontrados entre os isolados de S. aureus foram seg, isoladamente, ou em associações, seg + sec, seg + sea, seg + seb, seg + tst, seg + eta, seg + seh, seg + sec + tst, seg + sea + seh, seg + sea + seb + seh. O gene mais freqüente foi seg, presente em todas as amostras positivas, 79/79 (100 por cento), seguido por seh, 10/79 (12,7 por cento) e sea, 09/79 (11,4 por cento) / A PCR-coa revelou quatro coagulotipos (Perfil 1-4), sendo o perfil 2 (~800pb) o mais prevalente presente em 39/80 (48,75 por cento) isolados. A ribotipagem-PCR demonstrou 3 a 7 fragmentos de 390 a 680pb, distribuídos em onze ribotipos (R1-R11). R1 e R4 foram os ribotipos mais comuns, presentes em 28,75 por cento dos isolados estudados. Os coagulotipos e ribotipos foram distribuídos nos três setores do hospital (ambulatório, enfermaria e UTI). Estes dados revelaram um grande polimorfismo genético e demonstraram uma dispersão clonal dos S. aureus neste ambiente hospitalar

ANDRADE NETO, João Batista de. Atividade antimicrobiana de metabólitos secundários obtidos de leveduras ambientais do bioma cearense frente a cepas de bactérias patogênicas, incluindo Staphylococcus aureus resistentes à meticilina: atividade antibacteriana e investigação do mecanismo de ação. 2015. 79 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T13:52:40Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2015-10-26T13:54:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T13:54:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) Previous issue date: 2015 / The consequent and continuous use of antimicrobials led to the emergence of potentially lethal pathogens. ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter sp.) microorganisms group stands towards others, in which Staphylococcus aureus infections stand out as the leading cause of systemic infections, with SARM being a major responsible for these infections in Brazil. Thus, the emergence of strains with reduced sensitivity accompanied by a limited antimicrobial therapy makes the search for new therapeutic options necessary. In this study, isolate yeasts from the northeaster region of Brazil, more specifically in Ceará state, were analysed in order to find antimicrobial metabolites with anti-SARM activity, as well as to find a description of a possible mechanism of action. In this paper, 13 yeasts were isolated and conditioned in different growing conditions, in order to optimize the growth of the isolates. In addition, it was explored whether extracts from yeast produced new secondary metabolites with antimicrobial properties. 59% (11) of the obtained extracts were active against Gram positive bacteria and 32% (7) were active against Gram positive and Gram negative bacteria. These more active extracts showed activity against SARM and had MIC ranging between 34-192 µg/mL. Analysis by flow cytometer showed that these extracts were capable of causing damage to the plasma membrane and of promoting bacterial DNA fragmentation, leading the cell to cell death by apoptosis. In cytotoxic tests using the MTT test with human leukocyte cells, the secondary metabolites showed low cytotoxicity. Chemical analysis revealed structurally different secondary metabolites, including the compounds pyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione, Hexahydro-3- (phenyl methyl) Laurie acid and, as described in the literature for their properties against MSSA and SARM as well as other known metabolites were identified in the remaining extracts, suggesting that these strains can produce new molecules. Within this context, the antimicrobial activity and the low cytotoxic potential demonstrated by these extracts reveal a class of promising chemical compounds to the development of new antibiotics. However, more pharmacological studies will be done to confirm these data. / O uso consequente e contínuo dos antimicrobianos levaram ao surgimento de patógenos potencialmente letais. O grupo de micro-organismos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter sp.) se destaca perante os demais, onde as infecções por Staphylococcus aureus se sobressaem como a principal causa de infecções sistêmicas, sendo o Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (SARM) um dos principais responsáveis por estas infecções no Brasil. Dessa forma, a emergência de cepas com sensibilidade reduzida acompanhada de uma terapia antimicrobiana limitada faz com que seja necessária uma busca por novas opções terapêuticas. No presente trabalho, foram analisadas leveduras isoladas da região nordeste do Brasil, mais especificamente no estado do Ceará, com o objetivo de buscar metabólitos antimicrobianos com atividade anti-SARM, bem como a descrição de um eventual mecanismo de ação. Foram isoladas 13 leveduras as quais foram acondicionadas em condições de cultivo distintas, a fim de otimizar o crescimento dos isolados de leveduras. Em seguida os extratos acetoetílicos obtidos a partir das leveduras, foram exploradas afim de verificar se produziam metabólitos secundários com propriedades antimicrobianas. 59% (11) dos extratos obtidos foram ativos contra bactérias Gram positivas e 32% (7) contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os extratos mais ativos apresentaram atividade contra SARM e tiveram CIM que variaram de 34-192 µg/mL. A análise por citometria de fluxo revelou que esses extratos foram capazes de causar danos a membrana plasmática e promover fragmentação do DNA bacteriano, levando a célula à morte celular por apoptose. Nos ensaios citotóxicos, utilizando o teste do MTT com células de leucócitos humanos, os extratos mostraram baixa citotoxicidade. As análises químicas revelaram estruturalmente diversos metabólitos secundários, incluindo os compostos hexahidro-3-(fenilmetil)-pirrolo[1,2-a] pirazina-1,4-dione e o ácido láurico, já descritos na literatura por suas propriedades contra Staphylococcus aureus sensíveis à meticilina (MSSA) e SARM, bem como outros metabólitos conhecidos foram identificados nos extratos restantes, sugerindo que estas leveduras podem produzir moléculas promissoras. Dentro deste contexto, a atividade antimicrobiana e o baixo potencial citotóxico demonstrado por esses extratos revelaram uma classe de compostos químicos promissores para desenvolvimento de novos antibioticos. No entanto, mais estudos farmacológicos serão feitos para confirmar estes dados.

As naftoquinonas são amplamente distribuídas na natureza e várias destas moléculas tem um papel importante na produção de energia, através da fotossíntese e respiração celular. No entanto, a atividade biológica de naftoquinonas com grupamentos amino é pouco investigada em células procarióticas e eucarióticas. No presente trabalho nós estudamos a atividade biológica da 5-amino-8-hidroxi-1,4- naftoquinona (ANQ) em comparação com a 1,4-naftoquinona (NQ) na bactéria Staphylococcus aureus. ANQ e NQ inibem o crescimento do S. aureus nas concentrações de 50 e 10 μg/mL, respectivamente. O efeito antimicrobiano das naftoquinonas diminui na presença de ascorbato de sódio, por outro lado o ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benzeno-sulfônico (Tiron), um antioxidante especifico para o ânion superóxido foi capaz de proteger o S. aureus somente dos efeitos da ANQ. A ANQ e NQ bloqueiam o consumo de oxigênio e com a cadeia respiratória bloqueada com cianeto induzem o consumo de oxigênio. Os ensaios realizados com a presença das naftoquinonas se verificou que estes compostos induzem peroxidação de lipídios, sendo demonstrado pela formação de substancias reativas ao ácido tiobabitúrico. Estes resultados mostram que estes compostos atuam como aceptores de elétrons e induzem a formação de espécies reativas de oxigênio, que são tóxicas para o S. aureus. Com a proposta de elucidar a atividade mutagênica da ANQ e da 5-amino—2,8-dihidroxi- 1,4-naftoquinona (ANQ-OH) em comparação com a NQ, nós utilizamos o ensaio Salmonella/microssoma. A genotoxicidade e o potencial recombinogênico foram analisados nas linhagens haplóide e diplóide da levedura Saccharomyces cerevisiae. No ensaio Salmonella/microssoma a NQ não foi mutagênica, enquanto as aminonaftoquinonas apresentaram uma fraca mutagênese nas linhagens TA98 e TA102. Na linhagem haplóide, somente NQ induziu mutagênese. Na diplóide, as naftoquinonas não induziram eventos recombinacionais. Os resultados sugerem que as aminonaftoquinonas são fracos agentes mutagênicos em células procarióticas. Além disto, a genotoxicidade destes compostos foi determinada utilizando o ensaio Cometa (single cell gel – SCG) e o ensaio Cometa modificado com as enzimas formamidopirimidina DNA-glicosilase (FPG) e endonuclease III (ENDOIII) em células de fibroblasto de pulmão de hamster Chinês (células V79). Em nosso estudo foi demonstrado que ANQ e NQ induzem danos oxidativos no DNA das células V79, como apresentado no ensaio na presença de enzimas. O pós-tratamento com ENDOIII e FPG não reconhecem danos promovidos pela ANQ-OH, quando comparado com o ensaio cometa padrão. Além disso, todas as naftoquinonas apresentaram genotoxicidade nas células V79 em presença de ativação metabólica. Nas células de mamíferos, NQ e ANQ são agentes genotóxicos, enquanto ANQ-OH é genotóxico somente com metabolização. O conjunto destes resultados reforça que ANQ e NQ produzem o radical superóxido e demonstra que o grupamento amino na posição 5 não elimina a capacidade da ANQ em produzir espécies reativas de oxigênio. Por fim, nós podemos afirmar que a citotoxicidade e genotoxicidade destes compostos é pela produção de danos oxidativos em todos os sistemas celulares. / Naphthoquinones are widely distributed in nature and some of these molecules have an important role in the biochemistry of microbial energy production, by means of photosynthesis and respiratory chain. However, the biological activity of naphthoquinones amino derivates on prokaryotic and eukaryotic cells is poorly investigated. In the present work we have studied the biological activity of 5-amino-8-hydroxi-1,4- naphthoquinone (ANQ) on Staphylococcus aureus in comparison with unsubstituted 1,4- naphthoquinone (NQ). Complete inhibition of microbial growth was observed with ANQ and NQ at 50 and 10 μg/mL, respectively. The antibacterial effect of naphthoquinones decrease in presence of sodium ascorbate, but the superoxide scavenger 4,5-dihydroxi-1,3- benzene-disulfonic acid (Tiron) was able to protect S. aureus only from the harmful effect of ANQ. Naphthoquinones blocked oxygen uptake and induced-cyanide insensitive oxygen consumption. Assays in presence of naphthoquinones induced an increase of lipid peroxidation in S. aureus, as determined by thiobarbituric acid reactive substances. These results showed that 1,4-naphthoquinones effectively act as electron acceptor and induced an increase in reactive oxygen species that are toxic to S. aureus cells. In order to elucidate the mutagenic activity of ANQ and 5-amino-2,8-dihydroxy-1,4- naphthoquinone (ANQ-OH) in comparison with the unsubstituted 1,4-naphthoquinone (NQ) we have employed the Salmonella microssoma/assay. The genotoxic and recombinogenic potencial effects were analysed in haploid and diploid yeast Saccharomyces cerevisiae strains. In Salmonella microssoma/assay the NQ was not mutagenic while the aminonaphthoquinones were weakly mutagenic in TA98 and TA102 stains. In haploid yeast, only NQ showed a mutagenic response. In diploid yeast, the naphthoquinones did not induce any recombinogenic events. All these results suggest that aminonaphthoquinones are weak mutagenic agents only in prokaryotic cells. Moreover, the genotoxicity of these compounds was determined using standard Comet assay (single-cell gel – SCG) and modified Comet assay with bacterial enzymes formamidopyrimidine DNAglycosylase (FPG) and endonuclease III (ENDOIII) in V79 Chinese hamster lung fibroblast cells. Our study demonstrated that ANQ and NQ induced oxidative DNA damage in V79 cells as shown in comet assay with the lesion-specific enzymes. Post-treatment with ENDOIII and FPG proteins had not significant effect on ANQ-OH-induced oxidative DNA damage when compared to standard alkaline comet assay. Besides, all naphthoquinones showed genotoxic effect on V79 cells in presence of metabolic activation. In mammalian cells, NQ and ANQ are genotoxic agents and ANQ-OH is genotoxic only in presence of metabolic activation. Taken together these results reinforce that ANQ and NQ produce superoxide radicals and reveal that amino group in position 5 does not abolish the ability of ANQ in producing reactive oxygen species. Finally, we were able to affirm that cytotoxicity and genotoxicity of these compounds is promoted by oxidative damage despite the cell system.

Introdução: a colonização de indivíduos com HIV/aids por microrganismos patogênicos tem sido associada a maior risco de morbidade e mortalidade, principalmente quando esse microrganismo é o Staphylococcus aureus. Identificar precocemente esta condição permite implementar medidas preventivas do adoecimento a ele relacionado, em nível individual e coletivo. Objetivo: avaliar a prevalência de colonização por Staphylococcus aureus em indivíduos com HIV/aids internados em um hospital escola. Metodologia: estudo de corte transversal, tendo como sujeito pessoas vivendo com HIV/aids, internadas em duas unidades especializadas em HIV/aids de um Hospital Escola do município de Ribeirão Preto- SP. Todos os preceitos éticos foram criteriosamente respeitados. No período de Agosto/2011 a Julho/2012, todos os indivíduos internados foram abordados e para aqueles que aceitaram participar, procedeu-se a coleta de amostra de saliva e secreção nasal, além da coleta de dados sociodemográficos, clínicos e imunológicos, obtidos por meio do prontuário e entrevista individual. As amostras foram encaminhadas e processadas pelo Laboratório de Microbiologia e Sorologia da instituição em estudo. Foram semeadas em meios de cultura ágar sangue e manitol, e após, transferidas para o sistema automatizado Vitek® 2 (BioMérieux(TM)), por meio dos cartões GP Test Kit Vitek® 2, para bactérias gram-positivas. Foram empregados cartões AST-P585 para avaliar a sensibilidade dos Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) aos antibióticos. Os dados foram armazenados em planilhas do Microsoft Office Excel 2011 for Mac e organizados por meio do software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão 17.0 for Windows. Resultados: De 229 indivíduos com HIV/aids internados nas unidades, 169 constituíram os sujeitos desta pesquisa, dos quais 57,4% eram do sexo masculino, 39,6% apresentaram idade de 40 a 49 anos e 45% tinham o primeiro grau completo. Foram obtidas 338 amostras (169 de secreção nasal e 169 de saliva). A prevalência de colonização por Staphylococcus aureus foi identificada em 20,4% das amostras, com 21,7% de resistência à oxacilina, sendo em secreção nasal 66,7% e em saliva 33,3%. Apresentaram contagem de linfócitos T CD4 abaixo de 200 células/mm3 60,0% dos indivíduos com MRSA nasal e 80,0% estavam em uso de antimicrobianos. Em 40,0% dos indivíduos com MRSA na saliva carga viral foi igual ou superior a 500.001 cópias/mL, e 80,0% destes também usavam antimicrobianos, MRSA nasal e saliva foi identificado em 60,0% dos indivíduos que não estavam em uso de antirretroviral. Conclusão: a prevalência de colonização por Staphylococcus aureus em indivíduos com HIV/aids foi predominante em secreção nasal, com baixa contagem de linfócitos T CD4, com história de internação prévia, uso de antimicrobiano e ausência do uso de antirretroviral, podendo representar importante fonte de infecção. / Introduction: colonization by pathogenic microorganisms in individuals with HIV/AIDS has been associated with increased risk of morbidity and mortality, especially when that organism is Staphylococcus aureus. Early identification of this condition allows implementing preventive measures of illness related to it, both individually and collectively. Objective: to evaluate the prevalence of Staphylococcus aureus colonization in individuals with HIV/AIDS in a teaching hospital. Method: cross-sectional study; the subjects were people living with HIV/AIDS and hospitalized in two specialized HIV/AIDS care units of a Teaching Hospital in the city of Ribeirão Preto. All ethical principles were carefully observed. In the period from August 2011 to July 2012, all subjects hospitalized were approached and, for those who agreed to participate, the collection of saliva and nasal discharge sample was performed, in addition to collecting sociodemographic, clinical and immunological data, obtained through medical record and individual interviews. The samples were forwarded and processed by the Laboratory of Microbiology and Sorology of the institution. They were seeded in blood agar and mannitol-salt-agar culture medium, and thereafter, transferred to the automated system Vitek® 2 (BioMérieux(TM)) through Vitek® 2 Test Cards for Gram-positive bacteria. AST-P585 cards were used to assess the sensitivity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) to the antibiotic. Data were stored in spreadsheets of Microsoft Office Excel 2011 for Mac and organized by the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 17.0 for Windows. Results: of the 229 individuals with HIV/AIDS hospitalized in the units, 169 were the subjects in this study, of whom 57.4% were male, 39.6% were aged from 40 to 49 years, and 45% had completed elementary school. 338 samples were collected (169 of nasal discharge and 169 of saliva). The prevalence of Staphylococcus aureus colonization was identified in 20.4% of samples, with 21.7% of oxacillin resistance, being 66.7% in nasal discharge and 33.3% in saliva. 60.0% of individuals with MRSA in nasal had lymphocytes T CD4 count below 200 cells/mm3 , and 80.0% were taking antimicrobials. In 40.0% of the individuals with MRSA in saliva, the viral load was equal or higher than 500.001 copies/mL, and 80.0% of these also used antimicrobials; MRSA in nasal and in saliva were detected in 60.0% of individuals who were not taking antiretroviral. Conclusion: the prevalence of Staphylococcus aureus colonization in individuals with HIV/AIDS was prevalent in nasal discharge, had lymphocytes T CD4 low count, with a history of previous hospitalization, antimicrobial use and the absence of antiretroviral use, and it may represent an important source of infection.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:12:21Z : No. of bitstreams: 1 martins_a_me_botfm.pdf: 634920 bytes, checksum: 7df863ce968556a78e7af6c51b134a5e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A oxacilina é a principal droga de escolha no tratamento das infecções causadas por S. aureus. Contudo, a resistência a esta droga tem se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi verificar as taxas de resistência à oxacilina em amostras de S. aureus provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP e a comparação de métodos fenotípicos com o método padrão ouro (detecção do gene mecA) na detecção de amostras MRSA. Um total de 102 amostras previamente isoladas no período de 2002 a 2006 e estocadas na Coleção de Culturas do Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller-Hinton com 6 μg/mL de oxacilina e 4% de NaCl, E-test e detecção do gene mecA. Das amostras estudadas, 46 (45,1%) foram positivas para o gene mecA. A sensibilidade obtida para o disco de oxacilina foi de 86,9%, com 91,1% de especificidade. O disco de cefoxitina apresentou sensibilidade de 91,3% e especificidade de 91,1%. O método de triagem apresentou os mesmos valores de sensibilidade (91,3%) e especificidade (91,1%) verificados no método do disco de cefoxitina. A fita de E-test mostrou melhor taxa de sensibilidade, com 97,8% e a mesma especificidade encontrada nos outros métodos (91,1%). Das amostras estudadas, 93% foram produtoras de - lactamase, sendo 05 destas negativas na detecção do gene mecA. Verificou-se um aumento gradativo no número de amostras resistentes à oxacilina no período de 2002 a 2004, entretanto, de 2004 a 2006 os resultados revelaram uma redução no número de amostras resistentes, de 55% de MRSA em 2004 para 45% em 2005 e 34,6% em 2006. Os dados revelaram que o E-test obteve melhores resultados, com alta sensibilidade comparada aos outros métodos. / Oxacillin is the main drug of choice for the treatment of S. aureus infections. However, S. aureus resistance to oxacillin has become a major problem in the past decades. To assess the rates of oxacillin resistance in S. aureus samples obtained at the Botucatu Medical School Hospital - Sao Paulo State University/UNESP, Brazil, and to compare phenotypic techniques for the detection of MRSA against the gold standard method (mecA gene detection) in these samples. A total of 102 samples, previously isolated between 2002 and 2006, and kept at the Culture Collection of the Department of Microbiology and Immunology, Botucatu Institute of Biosciences, São Paulo State University/UNESP, Brazil were included. Oxacillin resistance was assessed by oxacillin and cefoxitin disk diffusion and agar dilution tests, screening tests using Mueller-Hinton agar with 6 μg/mL of oxacillin and 4% of NaCl, E-test, and mecA gene detection. Of the samples analyzed, 46 (45.1%) were mecA-positive. Oxacillin disk sensitivity and specificity were 86.9% and 91.1%, respectively. Cefoxitin disk sensitivity and specificity were 91.3% and 91.1%, respectively. The screening test showed same level of sensitivity (91.3%) e specificity (91.1%) found with the cefoxitin disk. With E-test strips, sensitivity was higher (97.8%) and specificity was comparable to that found with the other methods (91.1%). Ninety-three percent of the samples produced - lactamase, and 05 of them were mecA-negative. There was a gradual increase in the number of oxacillin-resistant S. aureus samples between 2002 and 2004. However, from 2004 to 2006, the number of resistant samples dropped from 55% of MRSA in 2004, to 45% in 2005 and 34.6% in 2006. The data obtained reveal that, among phenotypic methods, E-test yielded the best results, with higher sensitivity levels when compared to the other methods.

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Augusto Cezar Montelli / Banca: Izabel Yoko Ito / Resumo: A oxacilina é a principal droga de escolha no tratamento das infecções causadas por S. aureus. Contudo, a resistência a esta droga tem se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi verificar as taxas de resistência à oxacilina em amostras de S. aureus provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP e a comparação de métodos fenotípicos com o método padrão ouro (detecção do gene mecA) na detecção de amostras MRSA. Um total de 102 amostras previamente isoladas no período de 2002 a 2006 e estocadas na Coleção de Culturas do Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller-Hinton com 6 μg/mL de oxacilina e 4% de NaCl, E-test e detecção do gene mecA. Das amostras estudadas, 46 (45,1%) foram positivas para o gene mecA. A sensibilidade obtida para o disco de oxacilina foi de 86,9%, com 91,1% de especificidade. O disco de cefoxitina apresentou sensibilidade de 91,3% e especificidade de 91,1%. O método de triagem apresentou os mesmos valores de sensibilidade (91,3%) e especificidade (91,1%) verificados no método do disco de cefoxitina. A fita de E-test mostrou melhor taxa de sensibilidade, com 97,8% e a mesma especificidade encontrada nos outros métodos (91,1%). Das amostras estudadas, 93% foram produtoras de - lactamase, sendo 05 destas negativas na detecção do gene mecA. Verificou-se um aumento gradativo no número de amostras resistentes à oxacilina no período de 2002 a 2004, entretanto, de 2004 a 2006 os resultados revelaram uma redução no número de amostras resistentes, de 55% de MRSA em 2004 para 45% em 2005 e 34,6% em 2006. Os dados revelaram que o E-test obteve melhores resultados, com alta sensibilidade comparada aos outros métodos. / Abstract: Oxacillin is the main drug of choice for the treatment of S. aureus infections. However, S. aureus resistance to oxacillin has become a major problem in the past decades. To assess the rates of oxacillin resistance in S. aureus samples obtained at the Botucatu Medical School Hospital - Sao Paulo State University/UNESP, Brazil, and to compare phenotypic techniques for the detection of MRSA against the gold standard method (mecA gene detection) in these samples. A total of 102 samples, previously isolated between 2002 and 2006, and kept at the Culture Collection of the Department of Microbiology and Immunology, Botucatu Institute of Biosciences, São Paulo State University/UNESP, Brazil were included. Oxacillin resistance was assessed by oxacillin and cefoxitin disk diffusion and agar dilution tests, screening tests using Mueller-Hinton agar with 6 μg/mL of oxacillin and 4% of NaCl, E-test, and mecA gene detection. Of the samples analyzed, 46 (45.1%) were mecA-positive. Oxacillin disk sensitivity and specificity were 86.9% and 91.1%, respectively. Cefoxitin disk sensitivity and specificity were 91.3% and 91.1%, respectively. The screening test showed same level of sensitivity (91.3%) e specificity (91.1%) found with the cefoxitin disk. With E-test strips, sensitivity was higher (97.8%) and specificity was comparable to that found with the other methods (91.1%). Ninety-three percent of the samples produced - lactamase, and 05 of them were mecA-negative. There was a gradual increase in the number of oxacillin-resistant S. aureus samples between 2002 and 2004. However, from 2004 to 2006, the number of resistant samples dropped from 55% of MRSA in 2004, to 45% in 2005 and 34.6% in 2006. The data obtained reveal that, among phenotypic methods, E-test yielded the best results, with higher sensitivity levels when compared to the other methods. / Mestre

As naftoquinonas são amplamente distribuídas na natureza e várias destas moléculas tem um papel importante na produção de energia, através da fotossíntese e respiração celular. No entanto, a atividade biológica de naftoquinonas com grupamentos amino é pouco investigada em células procarióticas e eucarióticas. No presente trabalho nós estudamos a atividade biológica da 5-amino-8-hidroxi-1,4- naftoquinona (ANQ) em comparação com a 1,4-naftoquinona (NQ) na bactéria Staphylococcus aureus. ANQ e NQ inibem o crescimento do S. aureus nas concentrações de 50 e 10 μg/mL, respectivamente. O efeito antimicrobiano das naftoquinonas diminui na presença de ascorbato de sódio, por outro lado o ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benzeno-sulfônico (Tiron), um antioxidante especifico para o ânion superóxido foi capaz de proteger o S. aureus somente dos efeitos da ANQ. A ANQ e NQ bloqueiam o consumo de oxigênio e com a cadeia respiratória bloqueada com cianeto induzem o consumo de oxigênio. Os ensaios realizados com a presença das naftoquinonas se verificou que estes compostos induzem peroxidação de lipídios, sendo demonstrado pela formação de substancias reativas ao ácido tiobabitúrico. Estes resultados mostram que estes compostos atuam como aceptores de elétrons e induzem a formação de espécies reativas de oxigênio, que são tóxicas para o S. aureus. Com a proposta de elucidar a atividade mutagênica da ANQ e da 5-amino—2,8-dihidroxi- 1,4-naftoquinona (ANQ-OH) em comparação com a NQ, nós utilizamos o ensaio Salmonella/microssoma. A genotoxicidade e o potencial recombinogênico foram analisados nas linhagens haplóide e diplóide da levedura Saccharomyces cerevisiae. No ensaio Salmonella/microssoma a NQ não foi mutagênica, enquanto as aminonaftoquinonas apresentaram uma fraca mutagênese nas linhagens TA98 e TA102. Na linhagem haplóide, somente NQ induziu mutagênese. Na diplóide, as naftoquinonas não induziram eventos recombinacionais. Os resultados sugerem que as aminonaftoquinonas são fracos agentes mutagênicos em células procarióticas. Além disto, a genotoxicidade destes compostos foi determinada utilizando o ensaio Cometa (single cell gel – SCG) e o ensaio Cometa modificado com as enzimas formamidopirimidina DNA-glicosilase (FPG) e endonuclease III (ENDOIII) em células de fibroblasto de pulmão de hamster Chinês (células V79). Em nosso estudo foi demonstrado que ANQ e NQ induzem danos oxidativos no DNA das células V79, como apresentado no ensaio na presença de enzimas. O pós-tratamento com ENDOIII e FPG não reconhecem danos promovidos pela ANQ-OH, quando comparado com o ensaio cometa padrão. Além disso, todas as naftoquinonas apresentaram genotoxicidade nas células V79 em presença de ativação metabólica. Nas células de mamíferos, NQ e ANQ são agentes genotóxicos, enquanto ANQ-OH é genotóxico somente com metabolização. O conjunto destes resultados reforça que ANQ e NQ produzem o radical superóxido e demonstra que o grupamento amino na posição 5 não elimina a capacidade da ANQ em produzir espécies reativas de oxigênio. Por fim, nós podemos afirmar que a citotoxicidade e genotoxicidade destes compostos é pela produção de danos oxidativos em todos os sistemas celulares. / Naphthoquinones are widely distributed in nature and some of these molecules have an important role in the biochemistry of microbial energy production, by means of photosynthesis and respiratory chain. However, the biological activity of naphthoquinones amino derivates on prokaryotic and eukaryotic cells is poorly investigated. In the present work we have studied the biological activity of 5-amino-8-hydroxi-1,4- naphthoquinone (ANQ) on Staphylococcus aureus in comparison with unsubstituted 1,4- naphthoquinone (NQ). Complete inhibition of microbial growth was observed with ANQ and NQ at 50 and 10 μg/mL, respectively. The antibacterial effect of naphthoquinones decrease in presence of sodium ascorbate, but the superoxide scavenger 4,5-dihydroxi-1,3- benzene-disulfonic acid (Tiron) was able to protect S. aureus only from the harmful effect of ANQ. Naphthoquinones blocked oxygen uptake and induced-cyanide insensitive oxygen consumption. Assays in presence of naphthoquinones induced an increase of lipid peroxidation in S. aureus, as determined by thiobarbituric acid reactive substances. These results showed that 1,4-naphthoquinones effectively act as electron acceptor and induced an increase in reactive oxygen species that are toxic to S. aureus cells. In order to elucidate the mutagenic activity of ANQ and 5-amino-2,8-dihydroxy-1,4- naphthoquinone (ANQ-OH) in comparison with the unsubstituted 1,4-naphthoquinone (NQ) we have employed the Salmonella microssoma/assay. The genotoxic and recombinogenic potencial effects were analysed in haploid and diploid yeast Saccharomyces cerevisiae strains. In Salmonella microssoma/assay the NQ was not mutagenic while the aminonaphthoquinones were weakly mutagenic in TA98 and TA102 stains. In haploid yeast, only NQ showed a mutagenic response. In diploid yeast, the naphthoquinones did not induce any recombinogenic events. All these results suggest that aminonaphthoquinones are weak mutagenic agents only in prokaryotic cells. Moreover, the genotoxicity of these compounds was determined using standard Comet assay (single-cell gel – SCG) and modified Comet assay with bacterial enzymes formamidopyrimidine DNAglycosylase (FPG) and endonuclease III (ENDOIII) in V79 Chinese hamster lung fibroblast cells. Our study demonstrated that ANQ and NQ induced oxidative DNA damage in V79 cells as shown in comet assay with the lesion-specific enzymes. Post-treatment with ENDOIII and FPG proteins had not significant effect on ANQ-OH-induced oxidative DNA damage when compared to standard alkaline comet assay. Besides, all naphthoquinones showed genotoxic effect on V79 cells in presence of metabolic activation. In mammalian cells, NQ and ANQ are genotoxic agents and ANQ-OH is genotoxic only in presence of metabolic activation. Taken together these results reinforce that ANQ and NQ produce superoxide radicals and reveal that amino group in position 5 does not abolish the ability of ANQ in producing reactive oxygen species. Finally, we were able to affirm that cytotoxicity and genotoxicity of these compounds is promoted by oxidative damage despite the cell system.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6048_1.pdf: 2450691 bytes, checksum: 944413fde58e15a773b3aca712198e2a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / O surgimento de cepas Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) a partir da década de setenta teve um rápido incremento em todo mundo. Estas cepas multirresistentes são responsáveis por infecções nosocomiais e comunitária de difícil tratamento. A resistência a meticilina é produzida pela modificação de uma proteína que liga-se as penicilinas (PBP), a PBP2a codificada pelo gene mecA. Cerca de 40 a 60% das cepas de S. aureus isolados em hospitais de grande porte apresentam-se resistentes a meticilina e ainda, relatos na literatura permitem constatar que tais infecções estão associadas a clones específicos epidêmicos de Staphylococcus aureus multirresistentes, muitas vezes unicamente sensíveis ao glicopeptídeo vancomicina. No Brasil a partir de 1992 tem sido detectado um clone epidêmico designado como Clone Epidêmico Brasileiro (CEB), amplamente disseminado em hospitais de diferentes regiões do Brasil e outros países da América Latina e Europa. De outra parte a heterogenicidade de resistência que apresentam muitos desses clones, levando até mesmo a falhas no tratamento, justifica a preocupação de evidenciar sua presença. No Recife, estudos sistemáticos dessa resistência do Staphylococcus aureus não vinha ainda sendo realizados. No presente trabalho foram desenvolvidas diferentes técnicas para determinar a resistência a meticilina e estudos por biologia molecular para determinar a presença do gene mecA e detectar a existência do clone epidêmico. Foram coletados 242 isolados clínicos de Staphylococcus aureus de diferentes origens no período de janeiro de 2002 a julho de 2003 do Hospital Universitário (Hospital das Clinicas) de Recife Pernambuco. Para determinar o perfil de sensibilidade/resistência, das cepas devidamente identificadas , foi determinado um antibiograma padrão com oito antibióticos: ciprofloxacina, vancomicina, oxacilina, gentamicina, penicilina, sulfametropim, tetraciclina e eritromicina. A resistência à meticilina foi confirmada pela técnica Agar screen de oxacilina, realizando paralelamente a determinação das CMI para oxacilina mediante um multiinoculador de Steers e a técnica de Etest. Quanto a presença de gene mecA foi determinada por amplificação por PCR. Dos resultados obtidos, 57 cepas (72%) dos 79 isolados Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes foram sensíveis apenas a vancomicina. Quarenta e sete cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes escolhidas pelos seus padrões de resistência fenotipica foram estudadas pelo método de eletroforeses de DNA em campos alternados (PFGE) determinandose que 26 isolados eram subclones do Clone Epidêmico Brasileiro. Por outro lado foi verificada a presença de oito subclones do Clone Pediátrico. Entre estes o Staphylococcus aureus MRSA AM 824 , inicialmente considerado relacionado ao clone New York foi classificado como clone pediátrico pela determinação do mec elemento, SCCmec (tipo IV). Ainda foram detectados nove isolados relacionados com Clones Epidêmicos Esporádicos. Os resultados encontrados principalmente relativos ao CEB confirmam os dados citados na literatura para centros hospitalares, do Brasil, de paises latinoamericanos como Argentina e Uruguai, assim como países da Europa

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-26T17:32:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Carolina de Oliveira Luz.pdf: 4326874 bytes, checksum: 63dc00a616c9960ee4e6e303435634c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T17:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Carolina de Oliveira Luz.pdf: 4326874 bytes, checksum: 63dc00a616c9960ee4e6e303435634c1 (MD5) Previous issue date: 2015-03-09 / CNPQ / FACEPE / Staphylococcus aureus é considerado o patógeno mais importante de seu gênero, responsável por diversas infecções, variando desde infecção de pele e tecidos moles, até pneumonia, endocardite e sepse. Uma das causas da diversidade patogênica desta bactéria é a grande variedade de fatores de virulência que podem ser produzidos. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de melhor compreender o perfil de virulência de S. aureus, e a possível relação destes com os clones epidêmicos circulantes na região estudada. Para tal, foram estudados 89 isolados clínicos de S. aureus provenientes de diferentes hospitais de Recife/PE, obtidos de diversas fontes de infecção e com diferentes perfis genéticos. Foram realizadas investigações dos genes fnbA e fnbB (ligação à fibronectina), cna (ligação ao colágeno), clfA e clfB (fatores clumping, ligação ao fibrinogênio), icaA e icaD (produção de biofilme), lukF-PV e lukS-PV (leucocidina Panton Valentine), cap5 e cap8 (cápsula polissacarídica), genes do cluster gênico de enterotoxinas (seg, sei, sem, sen e seo), e análise do proteoma e secretoma de dois clones amplamente distribuídos. Todos os isolados apresentaram no mínimo oito fatores de virulência. Foram estabelecidos 39 genótipos, dos quais nenhum se mostrou clone específico. Analisando-se o padrão protéico, diversas proteínas, em especial três fatores de virulência, mostraram-se diferencialmente expressos. Como conclusão, pode-se sugerir que os isolados clínicos estudados possuem alto potencial virulento, possuindo um arcabouço genético capaz de desenvolver quadros clínicos graves. / Staphylococcus aureus is considered the most important pathogen within its genre, responsible for a variety of infections, ranging from skin and soft tissue infections to pneumonia, endocarditis and sepsis. One of the causes for this bacterium’s pathogenic diversity is the great variety of virulence factors that can be produced. The present study was developed aiming a better comprehension the virulence profile of S. aureus, and the possible relationship between them and current epidemic clones in the study area. To do so, we studied 89 clinical isolates of S. aureus from various sources of infection and with different genetic backgrounds. Investigations were conducted for the genes fnbA and fnbB (fibronectin binding proteins), cna (collagen binding protein), clfA and clfB (clumping factors, fibrinogen binding proteins), icaA and icaD (biofilm formation), lukF-PV and lukS-PV (leucocidin Panton Valentine), cap5 and cap8 (capsule polyssacharides), genes from the enterotoxin gene cluster (seg, sei, sem, sen and seo), and proteome and secretome analysis of two widely spread epidemic clones. All isolates showed positive for, at least, eight virulence factors. Thirty-nine genotypes were stablished, none of which showed itself as clone specific. Analysing the proteic pattern, several proteins, in special three virulence factors, were differentially expressed. As conclusion, we can suggest that the clinical isolates studied have a high virulence potential, possessing a genetic background capable of developing severe clinical syndromes.

Simplex optimization was used to maximize the production of Maillard reaction compounds which inhibit the growth of Staphylococcus aureus. The simultaneous factor shift and mapping procedures of the optimization program enabled the optimization to be completed with a minimum number of experiments. The reaction conditions likely to have the greatest effect on the production of these compounds were chosen as: (1) molar ratio of amino acid to sugar, (2) total concentration of reactants, (3) pH, (4) temperature and (5) time of heating. Inhibition of the test organism was quantified as the radius of no growth, by the concurrent use of the variable and uniform cams of the spiral plating system. Twenty nine experiments were required to reach the optimum of model system A, glucose + lysine, while model system B, xylose + lysine, was optimized after 28 experiments. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the optimum glucose + lysine reaction mixture was 5.78 x 10⁻⁴ μg/cfu, while that of the xylose + lysine reaction mixture was 8.94 x 10⁻⁴ μg/cfu. Multiple regression analysis of the data indicated that pH and total concentration were the two most significant factors in determining the inhibitory compounds produced by the glucose + lysine mixture. Molar ratio, temperature and time were not significant for this combination of reactants. The most significant factors for the xylose + lysine combination were pH and temperature, whereas molar ratio and total concentration were not significant. Calculation of the contributing proportion (Pⅰ) of each variable to the response, supported the results of the regression analysis. Separation of the optimized Maillard reaction mixtures according to molecular weight, using ultrafiltration, failed to provide any information about the molecular weight range of the inhibitory compounds. / Land and Food Systems, Faculty of / Graduate