X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited neurodegenerative disorder. The genetic bases for all its different phenotypic variants are mutation in the gene encoding the peroxisomal ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCD1, which transports very long chain fatty acids from the cytosol into the peroxisome for its degradation. The default manifestation of mutation in ABCD1 is adreno myeloneuropathy (AMN), a slow, progressive dying-back axonopathy affecting both ascending and descending spinal cord tracts as well as in some cases, peripheral neuropathy. In the present study, we use the invertebrate model organism Caenorhabditis elegans to generate a new nematode model of X-ALD. We reveal that the pmp-4(ok396) deletion mutant reproduces the main features of X-ALD such as lipid accumulation, increased mitochondrial oxidative stress, axonopathy and altered locomotion. Given the evidence that oxidative stress plays an important role in VLCFA-induced pathogenesis of ALD, therapeutic efforts aimed at the removal of free-radicals, prevention of their formation, or restoration of ETC function seem promising. Indeed, here we describe the mitochondria-specific pharmacological effects of MitoQ in protecting against VLCFA-induced toxicity and oxidative stress and its ability to rescue the observed X-ALD phenotypes on pmp-4(ok396) mutant worms. / La adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD-X) es un trastorno neurodegenerativo hereditario, causado por mutaciones en ABCD1. Este gen codifica para un transportador peroxisomal que importa ácidos grasos de cadena muy larga (AGCML) del citosol hacia el peroxisoma para su posterior degradación. La adrenomieloneuropatía (AMN) es la variante fenotípica en adultos y se manifiesta como un axonopatia de progresión lenta en la médula espinal. En este estudio utilizamos el gusano Caenorhabditis elegans para generar un nuevo modelo de ALD-X. Observamos que el mutante pmp-4(ok396) reproduce las principales características de la ALD-X (acumulación de lípidos, incremento del estrés oxidativo mitocondrial, axonopatía y locomoción alterada). Basándonos en evidencias que el estrés oxidativo inducido por acumulación de AGCML juega un papel importante en la patogénesis, estrategias enfocadas en la eliminación de radicales libres, prevención de su formación o normalización de la función de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, poseen un prometedor potencial terapéutico. Aquí demostramos que el compuesto MitoQ actua a nivel mitocondrial protegiendo en contra del estrés oxidativo y rescata los fenotipos ALD-X en los gusanos pmp-4(ok396). / La adrenoleucodistròfia lligada al cromosoma X (ALD-X) és un trastorn neurodegeneratiu hereditari, causat per mutacions en ABCD1. Aquest gen codifica per un transportador peroxisomal que importa àcids grassos de cadena molt llarga (AGCML) del citosol cap al peroxisoma per a la seva posterior degradació. La adrenomieloneuropatía (AMN) és la variant fenotípica en adults i es manifesta com una axonopatia de progressió lenta en la medul•la espinal. En aquest estudi utilitzem el cuc Caenorhabditis elegans per generar un nou model d'ALD-X. Observem que el mutant pmp-4 (ok396) reprodueix les principals característiques de l'ALD-X (acumulació de lípids, increment d'estrès oxidatiu mitocondrial, axonopatia i locomoció alterada). Basant-nos en les evidències que l'estrès oxidatiu induït per acumulació d’AGCML juga un paper important en la patogènesi, estratègies enfocades en eliminar radicals lliures, prevenirla seva formació o normalitzar la funció de la cadena de transport d'electrons mitocondrial, posseeixen un prometedor potencial terapèutic. Aquí, demostrem que el compost MitoQ actua a nivell mitocondrial protegint en contra de l'estrès oxidatiu i rescatant els fenotips ALD-X en els cucs pmp-4 (ok396).

Tot i les avantatges que presenta la sang de cordó umbilical (SCU) respecte el moll d’os i la sang perifèrica mobilitzada (SPM) com a font de cèl·lules mare hematopoètiques (CMH), la seva utilització pel tractament de l’aplàsia mieloide queda limitada degut al retard que pateixen els pacients a recuperar els nivells normals de neutròfils i plaquetes en sang. S’especula que aquest fet es deu bàsicament a dos factors: la reduïda dosi de CMH disponible per unitat i a l’estat d’immaduresa de les seves cèl·lules. Tenint en compte aquesta conjuntura, l’objectiu d’aquest treball es centra en el desenvolupament d’un producte de teràpia cel·lular avançada a partir de l’expansió i diferenciació selectiva dels progenitors hematopoètics de la sang de cordó umbilical per tal de superar els inconvenients que en limiten la seva utilització i aprofitar així les múltiples avantatges que presenta com a font cel·lular. En primer lloc s’ha estudiat la cinètica de creixement in vitro dels progenitors hematopoètics aïllats de la SCU amb l’objectiu d’aproximar una estratègia de cultiu que en permeti la seva expansió. Una vegada definida l’estratègia d’expansió, s’ha procedit a la caracterització del producte resultant. Per una banda, s’ha realitzat una caracterització funcional in vitro per tal d’aproximar el mecanisme d’acció de les diferents poblacions cel·lulars generades. Per altra banda, s’han dut a terme els estudis preclínics consistents en la determinació de l’eficàcia i seguretat del producte cel·lular en un model animal. La caracterització funcional in vitro ha posat de manifest que el producte cel·lular resultant del procés d’expansió no tan sols està format per CMH (cèl·lules CD34+), sinó que està compost per progenitors neutròfils en diferent grau de maduració amb activitat fagocítica. A més, també s’ha determinat la presència de cèl·lules mieloides supressores (MDSC) tant de llinatge granulocític com monocític. El estudis de limfoproliferació duts a terme han permès concloure que aquestes cèl·lules presenten la seva activitat immunosupressora característica. A continuació s’han realitzat els estudis preclínics a partir del trasplantament d’igual dosis de CMH en el model murí NOD-scid IL2rynull. Aquests estudis han consistit en determinar la capacitat d’empelt i repoblació de les CMH obtingudes al llarg del cultiu, en comparació amb CMH aïllades de SCU sense expandir. Els resultats obtinguts han permès concloure que sota les condicions de cultiu fixades, s’afavoreix l’expansió dels progenitors hematopoètics amb activitat repobladora a curt termini, mentre que es genera un empobriment de les cèl·lules amb activitat repobladora a llarg termini, resultat positiu tenint en compte que el producte de teràpia cel·lular està orientat a la reducció dels períodes d’aplàsia. Addicionalment s’ha pogut concloure que el producte de teràpia cel·lular no té efectes potencialment tòxics, evidenciant, per tant, la seva seguretat. Finalment, s’ha escalat el procés productiu, assolint uns factors d’expansió que permeten obtenir dosis d’1x106 CD34+/kg de pacient. En les proves pilot realitzades s’ha obtingut una dosi màxima de 92x106 CD34+. A més, aquest escalat s’ha dut a terme de forma paral·lela a la definició de la totalitat del bioprocés sota els estàndards de seguretat fixats per la normativa GMP (Good Manufacturing Practices). / Despite the advantages of umbilical cord blood (UCB) as a source of hematopoietic stem cells (HSC) compared to bone marrow or mobilized peripheral blood, its use for the treatment of aplastic anemia is limited due to the fact that patients undergo a delay in reaching normal levels of neutrophils and platelets. It has been suggested that this problem is due to two main reasons: a reduced amount of available HSC per unit and their immaturity. Given this situation, the aim of this work was to develop an advanced cell therapy product based on the expansion and selective differentiation of hematopoietic progenitor cells from UCB, in order to overcome the disadvantages that limit its use as a stem cell source. First we studied the in vitro growth kinetics of HSC from UCB in order to establish a cell culture strategy for its expansion. After that, the resulting cell product was characterized in vitro and in vivo in order to establish the functional profile and to determine its safety and efficacy in an animal model, respectively. The in vitro functional characterization revealed that the cell product obtained from the expansion culture contained not only HSC (CD34+ cells) but also neutrophil progenitors at different maturation stages with phagocytic activity. Moreover, it was found the presence of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) from both granulocytic and monocytic lineages. Lymphocyte proliferation assays revealed that these cells displayed the expected immunosuppressive activity, which is characteristic of this cell type. Preclinical studies consisting in transplantation of equal doses into the murine model NOD-scid IL2rynull were performed. In these experiments, the engraftment and repopulation activity of the expanded product were compared to HSC isolated from UCB. Our results indicated that under the culture conditions developed in this PhD project, short-term repopulating progenitors were expanded, and long-term repopulating progenitors were depleted. These results are positive when considering that the advanced cell therapy product is designed to reduce aplastic periods. Moreover, the safety of this product was confirmed by the absence of toxic effects. Finally, the culture strategy was scaled up, reaching the expansion factor needed to produce clinical doses (1x106 CD34+/kg patient). The maximum dose obtained during a pilot test was 92x106 CD34+. On this, it is worth mentioning that the scaling process was carried out in parallel with the definition of the bioprocess under the standards established by the GMP (Good Manufacturing Practices) regulations.

La definició clàssica de la mort apoptòtica estableix la presència d’una morfologia nuclear apoptòtica de tipus II (condensació de la cromatina i fragmentació del nucli) i la degradació oligonucleosomal de l’ADN o LMW (low molecular weight). Les cèl·lules derivades de neuroblastoma humà SH-SY5Y presenten aquest fenotip de mort després de ser sotmeses a un estímul citotòxic com, per exemple, l’estaurosporina. En aquest treball demostrem que les cèl·lules SH-SY5Y pateixen un procés de mort cel·lular de forma homogènia amb un fenotip nuclear no apoptòtic després de ser tractades amb l’alcaloide pertanyent a la família de les benzofenantridines, queleritrina. Aquest fenotip nuclear no apoptòtic també és observat en altres línies cel·lulars derivades de neuroblastoma humà després de ser tractades amb queleritrina. A més, establim que aquest alcaloide tampoc és capaç d’induir la degradació oligonucleosomal de l’ADN, inclús quan s’estan assolint percentatges de mort més elevats que en el tractament amb estaurosporina. Per altra banda, demostrem que la manifestació del fenotip nuclear no apoptòtic succeeix de forma primerenca i depenent de l’activació anticipada de les caspases, en un procés de mort cel·lular que es desencadena ràpidament. En aquest context, l’increment d’expressió dels nivells de CAD, la principal endonucleasa responsable de la degradació apoptòtica de l’ADN i de la morfologia nuclear de tipus II, no restableix el fenotip apoptòtic en les cèl·lules tractades amb queleritrina. A més, demostrem que les cèl·lules SH-SY5Y manifesten el fenotip de mort no apoptòtic induït per l’alcaloide malgrat CAD es trobi a la fracció cromatínica. Per altra banda, establim que el procés de mort cel·lular induït per queleritrina coincideix amb la manifestació de les propietats intercalants d’aquest alcaloide sobre l’ADN. En aquest aspecte, mostrem que altres agents d’unió a l’ADN, a l’igual que queleritrina, impedeixen la manifestació del fenotip apoptòtic provocat per estaurosporina. A més, trobem que els agents d’unió a l’ADN pertanyents a la mateixa família que queleritrina (benzofenantridines), com la sanguinarina, també indueixen l’activació prematura de les caspases. Per altra banda, el procés de mort desencadenat per queleritrina s’evita quan diferents antioxidants tiòlics s’afegeixen al medi de cultiu. A més a més, aquest fet coincideix en què queleritrina provoca que un elevat percentatge de cèl·lules pateixin estrès oxidatiu de forma anticipada mitjançant la detecció d’espècies reactives de l’oxigen (ROS). Per últim, l’addició de determinades concentracions de DTT (dithiothreitol), un antioxidant tiòlic, retarda l’activació de caspases i recupera la morfologia apoptòtica de tipus II en cèl·lules tractades amb queleritrina. En aquestes condicions, en canvi, no s’observa cap signe de degradació oligonucleosomal de l’ADN. Aquest fet coincideix en què les propietats intercalants de queleritrina sobre l’ADN encara es mantenen. Tot plegat, el conjunt dels resultats obtinguts en aquest treball estableix que els processos d’estrès oxidatiu i les propietats d’unió a l’ADN són determinants en la manifestació de diferents fenotips de mort. Així, una producció prematura de ROS podria associar-se amb una activació anticipada de les caspases, fet que seria contraproduent per la consecució d’un fenotip apoptòtic canònic en la cèl·lula destinada a morir. Per altra banda, les propietats intercalants sobre l’ADN d’una determinada molècula, per exemple, un quimioteràpic, estaria desafavorint l’acció enzimàtica de CAD sobre la cromatina respecte a la fragmentació en doble cadena de l’ADN per generar fragments oligonucleosomals, però no la capacitat d’aquesta per facilitar la compactació i fragmentació del nucli durant l’estímul citotòxic. En conclusió, el procés de mort cel·lular induït per queleritrina esdevé una eina de manifesta rellevància que ens permet l’exploració de nous procesos de mort cel·lular i, per tant, l’estudi de mecanismes moleculars que puguin estar implicats en l’evasió de la mort apoptòtica canònica. / The classic definition of apoptotic cell death ascertains the presence of type II apoptotic nuclear morphology (chromatin condensation and fragmentation of the nucleus) and oligonucleosomal DNA degradation or LMW (low molecular weight). Cells derived from human neuroblastoma SH-SY5Y have this cell death phenotype upon a cytotoxic stimulus as for example estaurosporine. In the present study, we demonstrate that the SH-SY5Y cells undergo a process of cell death in a homogeneous way with a nuclear non-apoptotic phenotype after the challenge with a benzophenanthridine alkaloid, chelerythrine. This nuclear non-apoptotic phenotype is also shown in other cell lines derived from human neuroblastoma upon the chelerythrine treatment. In addition, we establish that this alkaloid is not able to induce the oligonucleosomal DNA degradation, even when the cell death percentages reached are higher than the values obtained with treatment of estaurosporine. On the other hand, we show that the non-apoptotic nuclear phenotype appears early. It depends on anticipatory activation of caspases in a cell death process which triggers quickly. In this context, the increase of CAD levels expression, the main endonuclease responsible for DNA apoptotic degradation and nuclear morphology of type II, does not restore the apoptotic phenotype after the treatment with chelerythrine. Moreover, we demonstrate that the SH-SY5Y cells show the non-apoptotic cell death phenotype induced by the alkaloid although CAD is located in the chromatin-enriched fraction. Besides this, we ascertain that the cell death induced by chelerythrine is concomitant with the presence of DNA intercalating properties from this alkaloid. In this sense, we show that other DNA binding agents, just like chelerythrine, avoid the apoptotic phenotype induced by estaurosporine. Furthermore, we find that the DNA binding agents belonging to the same family that chelerithrine (benzophenanthridine), such as sanguinarine, also induce a premature activation of caspases. On the other hand, the presence of different thiolic antioxidants in the culture media prevents the cell death process triggered by chelerythrine. Moreover, this fact coincides with a high percentage of cells undergoes an early oxidative stress through detection of reactive oxygen species (ROS). Finally, the addition to the culture media of certain DTT (dithiothreitol) concentrations, a thiolic antioxidant, delays the caspases activation and restores the apoptotic morphology of type II, after the treatment with chelerythrine. Altogether, the results obtained from this work ascertain that the oxidative stress processes and DNA binding properties are crucial to the induction of different cell death phenotypes. Thus, an early ROS production relates to a premature activation of caspases, which would be counter-productive to achieve a canonical apoptotic phenotype in cells destined to die. Furthermore, the DNA intercalating properties from one particular compound, such as chemotherapeutic agent, would disadvantage the CAD enzymatic action of double-strand DNA fragments on chromatin degradation to generate the oligonucleosomals fragments. However, the DNA intercalating properties would not be able to avoid the compaction and fragmentation of the nucleus during cytotoxic stimulus. In conclusion, the cell death process induced by chelerythrine becomes an important tool that allows us to explore new processes of cell death and, therefore, to study the molecular pathways involved in evasion to the canonical apoptotic death.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells coordinate cell growth and cell cycle progression essentially during G1, where they must reach a critical cell size to traverse Start and enter the cell cycle. The most upstream activator of Start is Cln3, a G1 cyclin that together with the cyclin-dependent kinase Cdc28 triggers a transcriptional wave that drives cell cycle entry. The Cln3 cyclin is a low abundant and very unstable protein whose levels respond very rapidly to nutritional changes. However, Cln3 expression is not sharply regulated through the cell cycle and it is already present in early G1 cells. Notably, most Cln3 is retained bound to the ER in early G1 with the assistance of Whi3, an RNA-binding protein that binds the CLN3 mRNA, and it is released in late G1 by Ydj1, a J-chaperone that might transmit growth capacity information to the cell cycle machinery. However, little is known on the molecular mechanisms that retain the Cdc28-C1n3 complex in the cytoplasm and how do these mechanisms transmit information of cell size to coordinate cell proliferation with cell growth. As Cdc28 is important for proper retention of Cln3 at the ER, we hypothesized that mutations weakening interactions to unknown ER retention factors would cause premature release of the Cdc28-C1n3 complex and, hence, a smaller cell size. This thesis describes the isolation and characterization of a CDC28 quintuple mutant, which we refer to as CDC28wee, that causes premature entry into the cell cycle and a small cell size. Next we used isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) to identify direct interactors with lower affinities for mutant Cdc28wee, aiming at the identification of proteins with key regulatory roles in the retention mechanism. Among the identified proteins we found Sr13, a protein of unknown function, here renamed as Whi7. Here we show that Whi7 acts as an inhibitor of Start, associates to the ER and contributes to efficient retention of the Cln3 cyclin, thus preventing its unscheduled accumulation in the nucleus. Our results demonstrate that Whi7 acts in a positive feedback loop to release the G1 Cdk¬cyclin complex and trigger Start once a critical size has been reached, thus uncovering a key nonlinear mechanism at the earliest known events of cell cycle entry. In addition to Whi7 we also identified Whi8, renamed here as Whi8, which is an RNA-binding protein present in both stress granules (SGs) and P bodies (PBs) with unknown biological function. We have found that Whi8 interacts with Cdc28 in vivo, binds and colocalizes with the CLN3 mRNA, and interacts with Whi3 in an RNA-dependent manner. Whi8-deficient cells showed a smaller budding cell size while, on the other hand, overexpression of Whi8 increased the budding volume. Cells lacking Whi8 were not capable of accumulating the CLN3 mRNA in SGs under stress conditions, and Cln3 synthesis remained high under glucose and nitrogen starvation, two environmental stress conditions that dramatically decrease Cln3 levels in the cell. Whi8 accumulation in SGs depended on an intrinsically disordered domain (IDD) identified at C-terminus of Whi8 and specific PKA phophosites. Our results suggest that Whi8 acts under stress as a safeguard that limits the influx of newly synthesized Cln3 (and likely other proteins) into the cell cycle machinery, by trapping the CLN3 mRNA in mRNA granules. Thus, we have found a unique target for signaling pathways that directly links stress response and cell cycle entry.

Desde el punto de vista metodológico esta tesis aporta, primero una mejora en la técnica de fusión heteróloga de ovocitos de hámster con esperma humano mediante el uso de ionóforo lo que mejora el proceso de capacitación espermática. En segundo lugar el uso de vinblastina, como agente antimitótico, es un hecho relevante que mejora sustancialmente la calidad de la extensión cromosómica y en consecuencia incrementa el número de complementos cromosómicos de mejor morfología para ser estudiados. Una tercera mejora importante ha consistido en un método original para el pintado de cromosomas enteros. Permite distinguir los complementos cromosómicos de ovocito de hámster de los complementos de pronúcleo masculino humano. Además, usando sondas de ADN marcadas con fluorescencia, específicas para los cromosomas preseleccionados, se han estudiado cromosomas humanos específicos. Esta aproximación metodológica mejorada hace posible estudiar con éxito la segregación meiótica en portadores de reorganizaciones cromosómicas equilibradas. Uno de ellos es la reorganización cromosómica compleja, 46, XY, -2, + der (2) t (2; 11) (q13; q23), - 11, + der (11) t (11; 22) (q23; q11.2), - 22, + der (22) t (2; 22) (q13; q11.2). Se analizaron un total de 208 complementos de esperma. La frecuencia de esperma que lleva una complemento normal o un complemento equilibrado era sustancialmente más baja que la frecuencia de espermatozoides desequilibrada siendo de 13,5% vs 86,5%, respectivamente, incluyendo 30 modos diferentes de segregación de ambos 4: 2 y 5: 1. Los resultados obtenidos en este estudio son compatibles con la formación, durante el proceso sináptico, de una figura hexavalente compleja que implica los cromosomas 2, 11 y 22. El comportamiento y la segregación de esta figura compleja explicarían la alta frecuencia (86,5%) de complementos desequilibrados observado en este portador. También se ha estudiado la segregación cromosómica de varios portadores de reorganizaciones cromosómicas. Tres portadores de translocacion recíproca (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) y un portador de inversión pericéntrica 47, XY, inv (7) (p13q36). En los portadores de translocaciones equilibradas se observaron todas los modos de segregación (alternante, adyacente-1, adyacente-2 y 3:1). No se ha observado relación entre la no disyunción de los cromosomas homólogos y las características particulares de la figura de emparejamiento, con la incidencia de eventos de recombinación meiótica en las regiones intersticiales de la estructura tetravalente. Además, en el caso del portador de la translocación recíproca 46XY, t (5; 7) (q21;q32) hay evidencia de un efecto intercromosómico, incremento de la frecuencia de aneuploidía en cromosomas no implicados en la translocación, con respecto a las muestras control. En cuanto a los portadores de inversiones pericéntricas analizados, el estudio de segregación cromosómica, proporciona una clara evidencia de una relación entre la incidencia de los productos de recombinación meiótica y la proporción entre el tamaño del segmento invertido respecto del tamaño total del cromosoma (tamaño en Mpb), más que con la longitud del fragmento invertido. Finalmente, cabe destacar la aplicabilidad de los resultados para desarrollar el conocimiento necesario para proporcionar un consejo genético apropiado a los portadores de reorganización cromosómicas equilibradas. / From the methodological point of view this thesis it provides, first the improvement of the heterologous fusion technique of hamster oocyte with human sperm by using ionophore improving the sperm capacitation process. Secondly using vinblastine, as antimitotic agent, improves the chromosomal morphology quality substantially, and consequently the number of complements good enough that can be studied increases. A third important improvement is an original method for painting whole chromosomes using FISH. It allows to distinguish both chromosomal complements, hamster oocyte chromosomes and human pronuclear male chromosomes. Moreover, using DNA probes labelled with fluorescence, specific to the preselected chromosomes, selected human chromosomes have been studied. This improved methodological approach enables study successfully meiotic segregation in carriers of balanced chromosomal rearrangements. One of them is the carrier of a complex chromosome rearrangement, 46,XY,-2, +der(2)t(2;11)(q13; q23),-11,+der(11)t(11;22)(q23;q11.2),-22, +der(22)t(2;22)(q13; q11.2). A total of 208 sperm complements were analyzed. The frequency of sperm carrying a normal or a balanced complement was substantially less frequent than the frequency of unbalanced sperm (13.5% vs 86.5% respectively) including 30 different segregation modes of both 4:2 and 5:1. The results obtained in this study are compatible with the formation, during the synaptic process, of a complex hexavalent figure involving chromosomes 2, 11, and 22. The behaviour and segregation of this complex figure would explain the high frequency (86.5%) of unbalanced complements observed in this carrier. Moreover sperm chromosome segregation studies in several carriers of balanced chromosome rearrangement are also performed: the following three reciprocal translocations (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) and the pericentric inversion 47, XY, inv (7) (p13q36). In the balanced translocation carriers the frequencies of alternate, adjacent-1, adjacent-2 and 3:1 segregation were detected. No relationship between the non-disjunction of homologous chromosomes and particular characteristics of the pairing figure such as the incidence of meiotic recombination events in the interstitial regions of tetravalent structure has been observed. Moreover, in the case of the carrier of t(9;17)(q12;p12) reciprocal translocation, evidence of an interchromosomal effect were observed, increased aneuploidy frequencies for chromosomes not involved in the translocation, in respect of control samples. Taking into account, the pericentric inversions carriers analysed, the chromosome segregation study provides a clear evidence of a relationship between the incidence of meiotic recombination products and the percentage of the inverted chromosome segment more tan with the length (size in Mpb) of the inverted chromosome segment. Finally, is worth noting the applicability of the results to develop the necessary knowledge, for proper genetic counselling to male carriers of balanced chromosomal rearrangements.

- Introducció Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by early synaptic and late neuronal loss, affecting more than 26 million people worldwide. Among patients affected with dementia, more than half suffer from Alzheimer’s disease. The biggest risk factor for developing Alzheimer's disease is age. β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary p-Tau tangles accumulates in the brains of elderly patients playing a central role in the pathogenesis of AD. During the last years the fruit fly, Drosophila melanogaster has increasingly been used as a model for neurodegenerative disease. Although the adult fly has a simpler nervous system than those of vertebrates, it is capable of higher-order brain functions, including aversive and appetitive learning, and recalling learned information from prior experiences. - Contingut de la investigació This work has been focused on modeling Alzheimer's Disease in Drosophila by expressing two human genes associated with AD (Aβ42 and Tau) in the fly central nervous system. This model displays AD-like neuropathological as well as behavioral symptoms. The main goal of developing such a model is to analyse and study the effect of new synthetic fatty acids molecules in the pathogenesis of AD. Additionally, the model organisms established in this study could provide tools that help to understand disease-specific processes resulting in neuronal loss. This study argues that Drosophila can be used to study the behavioural basis of human neurodegenerative diseases and may provide a model to identify novel therapeutic avenues for neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease. In this work also was studied the effect of membrane lipid therapy on cognitive decline of a transgenic model of Drosophila. This model overexpresses the human amyloid peptide of 42 amino acids (Aβ42), and human Tau protein that play a key role in the development of this disease. - Conclusió The treatment has been based on the use of DHA and its hydroxylated derivate OHDHA, ARA and its hydroxylated form OHARA and EPA and its hydroxylated form OHEPA at 1, 3, 10, 30, 100 and 250 μg/ml of standard food. After testing the transgenes expression in the F1 generation by PCR analysis and Western blot it was evaluated the toxicity of the compounds, and it was demonstrated that food supplementation with OHDHA, OHARA, OHEPA partially restored the loss of locomotor activity and increased the life-span of the flies expressing the human transgenes whereas the DHA, ARA, EPA, form had not significant effects. It has been observed that the concentrations of 30 and 100 μg/ml of hydroxylated form, including the mixtures of (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA), and 30 μg/ml of TGMs, LP183A1, LP183A2, was used, have led to cognitive improvement and have maintained or increased the lifespan with respect to the control group. In addition it was analyzed the lipid content from Drosophila heads by using gas chromatography and it was found that the food supplementation with either hydroxylated or non-hydroxylated compounds induced changes in the fatty acid profile of Drosophila. Furthermore it was discovered that the amount of short chain fatty acids (SCFA), from the heads of F1 treated with ARA, EPA and DHA was less than that from untreated F1 flies. Concerning the hydroxylated fatty acids, the reduction in the levels of short chain fatty acid (SCFA) was similar to that of the non-hydroxylated fatty acids. All food supplement tested induced an increase of long chain fatty acids (≥ 18C). ARA, EPA and DHA were present in the fatty acid profile of flies treated with the respective non-hydroxylated food supplements. This fact proves the absorption and incorporation of dietary PUFAs into the Drosophila body tissues. / - Introducció La enfermedad de Alzheimer (AD, del inglés Alzheimer's disease) es una patología neurodegenerativa caracterizada por una pérdida temprana de conexiones sinápticas y, de manera tardía, de neuronas. Esta enfermedad afecta a unos 40 millones de personas en todo el mundo. Entre las personas con demencia, más de la mitad sufren AD. El mayor riesgo para desarrollar la enfermedad de Alzheimer es la edad. De hecho, las placas β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares de fosfo-Tau se acumulan en los cerebros de pacientes ancianos, jugando un papel central en la patogénesis de AD. Además, se han encontrado reducciones significativas en los niveles de los lípidos fosfatidiletanolamina y ácido docosahexaenoico (DHA) en el cerebro de pacientes con AD. Durante la última década, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) se ha utilizado como modelo para enfermedades neurodegenerativas, debido a que puede ser utilizada para el análisis de conductas como el aprendizaje aversivo y apetitivo, así como su capacidad de utilizar la información aprendida de previas experiencias, aunque la mosca adulta presenta un sistema nervioso mucho más simple que el de vertebrados. - Contingut de la investigació La presente investigación se centra en la utilización de Drosophila como modelo de AD mediante la sobreexpresión de los genes humanos asociados con AD (Aβ42 y Tau) en el sistema nervioso central de la mosca. El principal objetivo de desarrollar este modelo es analizar y estudiar el efecto de ácidos grasos sintéticos novedosos en la terapia de la AD. Conjuntamente, los organismos modelo establecidos en este trabajo pueden constituir un sistema que permita la comprensión de los procesos específicos de la enfermedad que desencadena la pérdida neuronal. Con todo ello, el presente trabajo demuestra que se puede usar Drosophila para estudiar las bases comportamentales de las enfermedades humanas neurodegenerativas y puede suponer un modelo para identificar nuevas terapias para dichas enfermedades, tales como AD. Además, se ha estudiado el efecto de la terapia lipídica de membrana en el declive cognitivo del modelo transgénico de AD de Drosophila. - Conclusió Los tratamientos empleados se basan en el uso de DHA y su derivado hidroxilado OHDHA, ARA y su forma hidroxilada OHARA y EPA y su forma hidroxilada OHEPA, así como derivados de triacilgliceroles (triacilglicerol miméticos, TGM) a dosis crecientes y añadidos en la comida. Tras confirmar la expresión de los transgenes en la generación F1 de las moscas por PCR y western blot, se analizó la toxicidad de los distintos compuestos y se demostró que la suplementación de comida con OHDHA, OHARA, OHEPA restauró la pérdida de actividad locomotora, parcialmente, además, aumentó la vida media de las moscas expresando los transgenes humanos, mientras que DHA, ARA, EPA no presentaron efectos significativos. Se observó que las concentraciones de 30 y 100 μg/ml de las formas hidroxiladas, incluyendo las mezclas de (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA) y 30 μg/ml de TGMs, LP183A1, LP183A2, mejoraron la capacidad cognitiva y aumentaron la vida media con respecto al grupo control no tratado. También se analizó el contenido lipídico en membranas de la cabeza de moscas mediante cromatografía de gases y se observó que la suplementación de la comida, tanto con los compuestos hidroxilados como los no-hidroxilados estudiados, indujo cambios en el perfil de ácidos grasos de Drosophila melanogaster. Entre ellos, se observó una menor cantidad de ácidos grasos de cadena corta en cabezas de moscas F1 tratadas con ARA, EPA and DHA en comparación con moscas no tratadas. En cuanto a los ácidos grasos hidroxilados, presentaron un nivel similar en la reducción de los niveles de ácidos grasos de cadena corta. Además, todos los suplementos añadidos a la comida indujeron un aumento de los ácidos grasos de cadena larga (≥ 18C). Finalmente, se observó la presencia de ARA, EPA y DHA en el perfil de ácidos grasos de las moscas tratadas con el correspondiente ácido graso no-hidroxilado. Este hecho prueba la absorción e incorporación de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la dieta en los tejidos de la Drosophila.

La selecció embrionària i la capacitat de predir el potencial d’implantació dels embrions humans és un factor determinant per l’èxit de les tècniques de fecundació in vitro (FIV), que permet reduir el número d’embrions a transferir minimitzant el risc d’embaràs múltiple. La pràctica més habitual per valorar la qualitat embrionària i dur a terme la selecció es basa en criteris morfològics i observacions en dia 1 (fecundació i divisió primerenca), dia 2 i 3 (divisió i fragmentació dels blastòmers) i en dia 5, o combinacions d’aquestes. Allargar el cultiu fins a blastocist, així com la determinació de la seva dotació cromosòmica, sembla una bona opció per seleccionar els embrions de millor qualitat, però malauradament no totes les pacients són bones candidates d’aquesta estratègia. El patró pronuclear s’ha associat amb el desenvolupament embrionari. En alguns països només poden criopreservar embrions fins a aquest estadi i per això n’és important la classificació. El nostre objectiu ha estat correlacionar la morfologia embrionària del zigot a l’estadi de 2 PN amb la utilització de les classificacions de pronuclis de Tesarik i Greco, 1999 (p0-5) i Scott et al., 2000 (z1-4), i la primera divisió embrionària a les 26h (EC), amb la morfologia de l’embrió en estadis posteriors de desenvolupament i la seva dotació cromosòmica. Primerament hem correlacionat els patrons de pronuclis (PN) amb la morfologia del zigot i de l’embrió. A l’utilitzar les classificacions de PN, hem observat una associació entre la sincronia en la polarització dels precursors nucleolars (NPB) i la bona qualitat embrionària. El patró p4 associat a un baix número de NPB s’ha correlacionat amb embrions multinucleats i embrions de baixa qualitat. No hi ha diferències en la taxa d’embaràs quan s’ha transferit al menys un embrió provinent d’un bon patró de PN o no. Per tal d’analitzar la relació entre la morfologia del zigot en 2PN segons les dues classificacions de PN i la dotació cromosòmica de l’embrió, s’han analitzat els embrions de 73 cicles de diagnòstic genètic preimplantacional (PGD) i cribatge d’aneuploïdies (PGS). No hi ha relació entre els patrons de PN i la dotació cromosòmica. No hem trobat correlació entre els PN i la morfologia embrionària. No hi ha relació entre euploïdia i qualitat embrionària, però sí quan distingim entre euploïdia, aneuploïdia i poliploïdia. El segon objectiu ha estat analitzar la correlació entre la divisió primerenca dels zigots i la qualitat embrionària i la dotació cromosòmica. S’han analitzat 595 embrions de 96 cicles de PGD/PGS. Hi ha diferències estadísticament significatives en la taxa d’embaràs per transferència quan s’ha transferit al menys un embrió EC o no. També hi ha diferències entre embrions EC, No PN o 2PN encara visibles a les 26h i la qualitat embrionària en dia 2 i la taxa de blastocist en PGS; no és així en PGD. En PGS i en PGD, els embrions EC tenen menys anomalies cromosòmiques que els embrions No PN i 2PN. Finalment, veiem que la valoració seqüencial de la morfologia oocitària, classificació de PN i morfologia embrionària permet seleccionar millor els embrions a transferir. Malgrat tot, en un programa de PGD/PGS la classificació de PN no pot predir ni la qualitat ni la dotació cromosòmica embrionària. Pel que fa la divisió primerenca, s’ha vist que està correlacionat amb la qualitat embrionària, el desenvolupament fins a blastocist i la dotació cromosòmica de l’embrió. / Several strategies have been proposed for the selection of embryos for uterine transfer in human assisted reproduction. The possibility of choosing adequate embryos with high implantation potential will allow the reduction in the number of embryos transferred. This will lead to a decrease in the percentage of multiple pregnancies and its complications. The scoring criteria of embryo selection are based on serial morphological observations conducted on day 1 (during the assessment of fertilization and early cleavage), on days 2 and 3 (based on cleavage and blastomere fragmentation), on day 5, or on combinations of these criteria. Extending the culture of embryos to the blastocyst stage may also be a good option to select high quality embryos, as well as the determination of the chromosome constitution of the embryo. Unfortunately, not all cases are good candidates and benefit from extended culture. Pronuclear morphology assessment has been extensively described as a method to score zygotes. Also, some countries are only allowed to freeze zygotes and the selection of embryos at this stage is thus necessary. The objective was to evaluate the usefulness of pronuclear patterns as described by Tesarik and Greco, 1999 (patterns p 0-5) and Scott et al., 2000 (Z1-4) as well as the occurrence of early cleavage at 26h as predictors of embryo morphology, implantation potential and chromosome constitution. The first purpose was to relate pronuclear patterns (PN) and zygote cytoplasmic appearance and embryo morphology. On this sense, the usefulness of PN classifications for embryo selection was assessed. We observed that synchrony on polarization and number of nucleolar precursor bodies (NPB) were associated with good quality embryos. Pattern 4 zygotes were associated with small number of NPB developed into multinucleated embryos and poor quality embryos. No significant differences were found in the pregnancy rate between transfer of at least one good prognosis PN pattern and transfer of poor prognosis PN patterns. In order to evaluate the usefulness of pronuclear patterns as predictors of embryo chromosome constitution, up to 73 preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening (PGD/PGS) cycles were analysed. The results show that the PN pattern using Tesarik’s and Scott’s classification systems is not related to the embryo developmental potential or its chromosome constitution. As regard to the relationship between PN pattern and embryo quality, the data obtained in the second study showed no correlation between both parameters. Although there were no significant differences when comparing the distribution of chromosomally normal and abnormal embryos with respect to embryo quality, such differences were observed when distinguishing between normal, aneuploid and polyploid embryos. The second objective was to analyse the correlation between early cleavage and embryo quality and chromosome constitution including 595 embryos from 96 PGS/PGD cycles. When clinical pregnancy rates per transfer were compared, statistically significant differences were observed between patients that had at least one early cleavage embryo and patients no EC. Statistically significant differences were found between EC, No PN and 2PN embryos at 26 h, good embryo quality at day 2 and in blastocyst rate in PGS cycles. These differences were not found in the PGD group. Early cleaved embryos exhibited less chromosome abnormalities than No PN and 2PN group in PGS and in PGD group. In conclusion, sequential assessment involving the evaluation of oocyte quality, the classification of PN patterns and embryo morphology allows a more accurate evaluation of embryos to be selected for transfer. Therefore, in the context of a PGD/PGS programme, the PN pattern cannot be used as a tool to predict embryo quality or chromosome status. Early cleavage has shown to correlate with embryo quality, with the capacity to develop up to blastocyst stage, as well as with euploid chromosome constitution.

En el nostre grup s’ha demostrat la interacció directa entre l’inhibidor de ciclines-CDKs p27 i l’acetiltransferasa PCAF. Aquesta interacció es produeix entre el domini HAT de PCAF i la regió que compren els aminoàcids 91-120 de p27. Aquesta regió conté un PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa), un domini característic d’interacció entre proteïnes. En aquest treball hem comprobat que PCAF acetila la lisina en posició 100 de p27 in vivo. L’acetilació de p27 afecta la seva estabilitat, afavorint-ne la seva trasnlocació del nucli al citoplasma, al inici de la fase G1, on serà degradada (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF és un co-activador transcripcional que actúa acetilant histones, factors de trasncripció i altres proteïnes. Per altra banda, recentment s’ha descrit que p27 actúa com a regulador transcripcional, bàsicament com a repressor transcripcional de la transcripció de determinats gens diana. Així doncs, com PCAF acetila p27, en aquest treball ens hem centrat en confirmar la col·laboració de p27 i PCAF en la regulació transcripcional dels seus gens diana. Per aconseguir aquest objectiu hem identificat els programes transcripcionals regulats per p27 i PCAF en cèl·lules humanes de càncer de còlon (HCT116), mitjançant experiments de ChIP-seq. Determinem que p27 i PCAF s’uneixen a regions diferents de la cromatina en els seus gens diana. Un cop identificats els gens diana comuns de p27 i PCAF, s’ha analitzat l’expressió de 14 d’aquests gens i hem pogut concloure que p27 i PCAF en regulen la seva transcripció de forma antagònica. p27 reprimeix i PCAF activa l’expressió de la majoria dels gens diana analitzats. Aquest efecte és degut a la unió de p27 i PCAF a elements reguladors de la transcripció en la cromatina. Hem descrit que p27 s’uneix a elements amb efecte activador de la transcripció en la cromatina dels seus gens diana, inhibint-los. Per contra, PCAF s’uneix a elements amb efecte silenciador sobre la transcripció del seus gens diana. Finalment hem demostrat la interacció de p27 i PCAF amb els factors de transcripció PAX en cèl·lules HCT116. / Our group has demonstrated the direct interaction between the cyclin-CDK inhibitor p27 and the acetyltransferase PCAF. This interaction occurs between the HAT domain of PCAF and the region comprising aa 91-120 of p27. This region of p27 contains a PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa) a characteristic protein interacting domain. In this study we found that PCAF acetylates the lysine at position 100 of p27 in vivo. The acetylation of p27 affects its stability, promoting its translocation from the nucleus to the cytoplasm early in the G1 phase, where it will be degraded (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF acts as a transcriptional coactivator by acetylating histones, transcription factors and other proteins. On the other hand, it has been reported that p27 acts as a transcriptional regulator, basically by repressing transcription of certain target genes. Therefore, since PCAF acetylates p27, in this thesis we focus on confirming the collaboration of p27 and PCAF in the transcriptional regulation of their target genes. To pursue this goal we have identified the transcriptional programs regulated by p27 and PCAF in HCT116 cells by ChIP -seq experiments. We found that p27 and PCAF binds to different regions of the chromatin of their target genes. Once the common target genes of p27 and PCAF were identified, their expression was analyzed. We concluded that p27 and PCAF regulate the transcription of their target genes antagonistically. p27 represses and PCAF activates the expression of most of their target genes, due to its binding to transcription regulatory elements in the chromatin. p27 binds to transcription activating elements, thus inhibiting the transcription of the target gene. On the contrary, PCAF binds to transcription silencing elements, thus activating the transcription of the target gene. Finally we demonstrated the interaction of p27 and PCAF with transcription factors PAX in HCT116 cells.

La presència de dos o més nuclis en una cèl·lula embrionària es defineix com a multinucleació i va ser descrita per primera vegada en embrions humans cultivats in vitro per Tesarik i col.laboradors al 1987 (Tesarik et al., 1987). Es considera que un embrió és multinucleat quan s’ha observat més d’un nucli en alguna de les seves cèl·lules en qualsevol moment del seu desenvolupament. Aquesta característica embrionària es considera patològica i s’associa a mal pronòstic reproductiu. La multinucleació pot generar-se per errors en el procés de divisió mitòtica o per fragmentació del nucli i pot donar lloc patrons de multinucleació diferents: binucleació (2 nuclis) o multi/micronucleació (>2 nuclis). Diversos autors han descrit una associació entre multinucleació i morfologia embrionària compromesa que es tradueix en una menor capacitat de desenvolupament d’aquests embrions quan es cultiven fins a l’estadi de blastocist (Alikani et al., 2000; Yakin et al., 2005). A més, aquests embrions exhibeixen una constitució cromosòmica anormal amb més freqüència. Per tot això, i malgrat s’han descrit naixements sans a partir de la transferència d’embrions multinucleats, la transferència d’aquests embrions en els cicles de Fecundació in vitro sol realitzar-se només quan no n’hi ha d’altres disponibles. En el nostre treball s’han analitzat les característiques de 763 cicles de FIV-ICSI amb i sense embrions multinucleats a la cohort. S’han comparat les característiques dels cicles i de les pacients dels dos grups. En segon lloc, s’han analitzat les característiques de 1312 embrions multinucleats. S’ha determinat la seva incidència, el moment d’aparició de la multinucleació i els patrons de multinucleació. S’ha analitzat els paràmetres morfocinètics dels embrions multinucleats comparant-los amb els d’embrions sense signes de multinucleació i s’ha avaluat la capacitat de desenvolupament fins a blastocist dels embrions multinucleats. S’han analitzat els resultats clínics dels embrions multinucleats que han estat transferits. A partir de les dades obtingudes de 199 cicles de Screening genètic preimplantacional s’ha determinat la constitució cromosòmica dels embrions multinucleats i s’ha comparat amb l’observada en embrions sense multinucleació Els nostres resultats han mostrat que, tot i les millores recents del cultiu in vitro, la multinucleació embrionària segueix essent un fenomen freqüent en els cicles de FIV. (23.6%). En els cicles de FIV, el nombre d’oòcits recuperats en la punció fol·licular s'associa a presència de multinucleació, però la presència d’embrions multinucleats en una cohort no té un efecte negatiu en el pronòstic del cicle. La tecnologia de monitorització dinàmica de la morfologia embrionària incorporada als laboratoris de reproducció assistida darrerament possibilita una millor detecció de la multinucleació i ha mostrat que embrions amb aquestes característiques mostren una morfocinètica alterada. Amb aquest treball, s’ha confirmat una menor capacitat per assolir l’estadi de blastocist i una major incidència d’anomalies cromosòmiques dels embrions multinucleats, tot i que els embrions multinucleats euploides que assoleixen l’estadi de blastocist tenen la mateixa capacitat d'implantació que els blastocists euploides no multinucleats. Per últim, s’ha pogut concloure que el cultiu dels embrions multinucleats fins a l'estadi de blastocist permet la selecció dels potencialment viables. / Abnormalities in the number of nuclei in cells from cleaving human embryos was demonstrated as early as 1987 (Tesarik et al., 1987) and it is known as multinucleation. Errors in the mitotic process or nuclear fragmentation can both lead to multinucleation. This phenomenon has been correlated with impaired cleavage, high rate of chromosomal abnormalities, diminished embryo developmental potential, lower implantation, clinical pregnancy and birth rate. In our study, we analyzed the characteristics of ICSI cycles with and without multinucleated embryos. Second, morphokinetic characteristics and developmental ability of multinucleated and non-multinucleated embryos were compared. And finally, data from 199 preimplantation genetic screening cycles was used to analyze the chromosomal constitution of multinucleated embryos. Our results have shown that although recent improvements in culture conditions have been introduced in assisted reproduction laboratories, multinucleation is still a common phenomenon in IVF cycles. Patients with multinucleated embryos had a higher number of oocytes retrieved when compared with patient without multinucleated embryos. Nevertheless, the presence of multinucleated embryos does not compromise the reproductive outcome of the ICSI cycle. Dynamic evaluation of embryo development performed with time-lapse technology allowed a better detection of the multinucleation phenomenon, and altered morphokinetics has been detected in these embryos. Data obtained has confirmed a diminished developmental ability to reach the blastocyst stage as well as increased incidence of chromosomal abnormalities has been confirmed from our results. Nevertheless, euploid blastocysts derived from multinucleated embryos have high implantation potential. Culture of multinucleated embryos to the blastocyst stage allows the selection of those potentially viable.

Al SNC, la neuroinflamació és un procés desencadenat per varies circumstàncies incloent infeccions, toxicitat, lesió traumàtica o autoimmunitat i sempre implica la ràpida activació de les cèl·lules glials, en particular astròcits i micròglia. Com a major component del sistema immunitari al SNC, la micròglia juga un paper fonamental regulant la neuroinflamació. Un cop activada, la micròglia es transforma, prolifera, migra i secreta molècules immunomoduladores com les citoquines. A la mateixa vegada, les citoquines poden influenciar el fenotip microglial. Així, la IL-6 pot ser un potent inductor i modulador de l’activació microglial, mentre que la IL-10 pot reprimir el fenotip pro-inflamatori de la micròglia. Un dels models millor caracteritzats de lesió de nervi perifèric es la lesió del nervi facial (FNA), caracteritzada per la degeneració neuronal retrògrada, l’activació glial i el reclutament limfocític. Per entendre el paper de la IL-6 i la IL-10 en la regulació de la resposta inflamatòria després de FNA, utilitzem dos soques de ratolins transgènics, GFAP-IL6Tg i GFAP-IL10Tg, que produeixen les citoquines IL-6 i IL-10, respectivament, sota el promotor de GFAP en astròcits. Els nostres resultats demostren que després de FNA, la IL-6 té un lleu efecte atenuant l’activació astroglial, però indueix importants efectes en termes d’activació micròglia, que correlacionen amb una major mort neuronal. Així, trobem que la IL-6 augmenta la densitat microglial i modifica l’expressió de moltes molècules relacionades amb la comunicació cel·lular. La IL-6 produeix una baixada en les molècules d’adhesió microglial, les quals poden afectar la manera com la micròglia es comunica amb les neurones axotomitzades. Remarcablement, la IL-6 indueix menor formació de clústers microglials, qüestionant la noció de que aquests clústers corresponen a llocs de neurones degenerant-se i micròglia fagocítica. També, demostrem que la IL-6 provoca un augment en el nombre de limfòcits-T infiltrats al nucli facial. Tot i que la infiltració de limfòcits-T, especialment els Th2, es considera neuroprotectora en WT, podem especular que la IL-6 indueix el reclutament de limfòcits-T no-neuroprotectors i, per tant, es modificaria la supervivència neuronal. Malgrat els efectes detrimentals en supervivència neuronal als 21 dies, la IL-6 no continua augmentant la mort neuronal 7 setmanes desprès de FNA però sembla que empitjora la regeneració funcional efectiva a aquest temps. Per una altra banda, la IL-10 augmenta la supervivència neuronal comparada amb el WT, correlacionant amb canvis en la resposta microglial i immunitària. Remarcablement, la IL-10 provoca una major formació de clústers de micròglia, demostrant de nou que no hi ha correlació entre el nombre de clústers i la quantitat de mort neuronal. A més, la IL-10 disminueix l’expressió de molècules associades amb la fagocitosis microglial al principi de la lesió. Aquests resultats, conjuntament amb l’observat amb els animals GFAP-IL6Tg, ens duen a proposar que els clústers de micròglia poden tenir unes altres funcions, més enllà de la fagocitosis de residus neuronals. En aquest sentit, la IL-10 incrementa l’expressió de molècules coestimuladores en la micròglia dels clústers, senyalant aquestes estructures com a llocs d’interacció amb els limfòcits-T. Demostrem també que la IL-10 provoca un major reclutament de limfòcits-T al nucli facial, tot i que el mecanisme pel qual els limfòcits-T promouen la supervivència neuronal no ha estat encara aclarit. Malgrat els efectes beneficiosos en supervivència neuronal a 21 dies, la IL-10 no té efectes en aquesta ni en la regeneració funcional efectiva 7 setmanes desprès de FNA. En resum, els resultats obtinguts en la present tesis mostren que la producció dirigida en astròcits de IL-6 i IL-10 modula la resposta neuroinflamatòria orquestrada desprès de FNA i influencien la supervivència neuronal i la regeneració del nervi. / In the CNS, neuroinflammation is a process triggered by a variety of circumstances including infection, toxicity, traumatic injury or autoimmunity and as hallmark always involves the quick activation of glial cells, in particular astrocytes and microglia. As the prime component of the CNS immune system, microglia plays a major role regulating neuroinflammation. Once activated, microglial cells transform, proliferate, migrate and release immunomodulatory molecules like cytokines. In turn, cytokines can strongly influence microglial phenotype. In this sense, IL-6 can be a potent inducer and modulator of microglial activation while IL-10 can downregulate the pro-inflammatory phenotype of microglia. One of the most-well described models of peripheral nerve injury is facial nerve axotomy (FNA), characterized by retrograde neuronal degeneration, glial activation and lymphocyte recruitment. To understand the role of IL-6 and IL-10 in the orchestration of the inflammatory response after FNA, we used two transgenic mice, GFAP-IL6Tg and GFAP-IL10Tg, which produce the cytokines IL-6 and IL-10, respectively, under the GFAP promoter in astrocytes. Our results showed that after FNA, IL-6 elicited a slight effect on attenuating astroglial activation, but induced intensive effects in terms of microglial activation that correlated with a higher neuronal death. Thus, we found that IL-6 increased microglia density and modify the pattern of expression of several molecules related with cellular cross-talk. IL-6 produced a drop in microglial adhesion molecules, which may affect how microglia communicate with the lesioned motorneurons. Importantly, IL-6 led to less microglial cluster formation, calling in question the assumption that these clusters correspond just to places of dying neurons and phagocytic microglia. Also, our findings showed that IL-6 produced an increase in the number of infiltrated T-cell within the lesioned facial nucleus. Although infiltration of T-cells, specifically Th2 lymphocytes, has been reported to play a neuroprotective role in WT, we can speculate that IL-6 induced the recruitment of non-neuroprotective T-cells and therefore modify the outcome of lesioned motor neurons. Despite its detrimental effects in neuronal survival at 21 days, IL-6 did not continue increasing neuronal death 7 weeks after axotomy but seemed to impair effective functional regeneration at this time-point. On the other hand IL-10 promoted an increase in neuronal survival, in front to WT, correlating with changes in microglial and immune responses. Remarkably, IL-10 led to increased microglial clusters formation, showing again no correlation between the number of microglial clusters and the amount of neuronal death. Moreover, IL-10 decreased the expression of molecules associated with microglial phagocytosis during early time-points. These findings, together with the observations in GFAP-IL6Tg animals, lead us to propose that microglial clusters may have another functions rather than phagocytosis of neuronal debris. In this sense, IL-10 increased co-stimulatory molecule expression in clustering microglia, pointing to these clusters as locations of interaction with recruited lymphocytes. We showed that also IL-10 promoted the recruitment of T-cells into the facial nucleus, yet the mechanism by which infiltrated T-cells contribute to enhanced neuronal survival has not been yet elucidated. Despite its beneficial effects on neuronal survival at 21 days, IL-10 was not able to increase neither neuronal survival nor functional regeneration 7 weeks after FNA. In summary, the results obtained in the present thesis show that astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 modulates the neuroinflammatory response orchestrated after FNA and influence the neuronal survival and nerve regeneration.