El petrolier Prestige (2002) es va enfonsar abocant al mar unes 65.000 tones de fuel que, dies després, van contaminar les costes gallegues. Durant les tasques de neteja, més de 300.000 persones van estar exposades als components genotòxics del fuel, com el benzè i el benzopirè. El nostre grup va realitzar un estudi genotòxic dos anys després de l’exposició al fuel (Prestige I), observant un augment de les alteracions cromosòmiques estructurals en els individus exposats. L’associació existent entre l’augment de les alteracions cromosòmiques i el risc de desenvolupar càncer va fer que es plantegés la necessitat de realitzar un estudi de seguiment (Prestige II). Aquesta tesi doctoral té com objectiu principal determinar si l’efecte genotòxic, prèviament detectat, persisteix sis anys després de l’exposició. S’han estudiat 104 pescadors gallecs, 58 exposats i 46 no exposats al fuel, amb cultius estàndards de limfòcits de 48 h. A més, s’han realitzat cultius de limfòcits amb afidicolina en 44 d’aquests mateixos individus, per comprovar l’existència d’errors en la reparació de l’ADN. Basant-nos en els resultats d’aquest treball, en els obtinguts prèviament (Prestige I i Prestige II cultius de 72 h) i en les comparacions realitzades entre ells, podem concloure que: a) en els estudis de seguiment només s’han d’incloure els individus prèviament analitzat, b) les lesions cromosòmiques no són un bon biomarcador de genotoxicitat quan el temps transcorregut des de l’exposició al fuel és superior a dos anys, c) el temps de cultiu no afecta a la detecció de dany cromosòmic després de dos anys de l’exposició, d) la freqüència d'alteracions cromosòmiques estructurals en individus exposats al fuel és entre dos i tres vegades superior a la descrita en la població normal, confirmant que l'efecte genotòxic persisteix sis anys després de l'exposició, e) l’augment d’alteracions cromosòmiques en els individus no exposats suggereix que han estat sotmesos a una exposició secundària al fuel (aliments contaminats o residus emmagatzemats) o a algun altre agent genotòxic, que els ha fet empitjorar des del Prestige I, f) l’augment del dany detectat en individus exposats al fuel, tan en Prestige I com en Prestige II, està associat a errors en la reparació de l’ADN. Finalment, l’interès socio-sanitari dels nostres resultats, posa de manifest la necessitat de portar a terme estudis semblants que permetin confirmar si l’exposició accidental al fuel incrementa el risc de desenvolupar càncer. / The tanker Prestige (2002) wrecked and spill about 65.000 tons of oil and pollutants into the sea at the Galician coasts. During the cleaning tasks, more than 300.000 people were exposed to genotoxic oil components, like benzene and benzopyrenne. Our group carried out a genotoxic study two years after the exposure to oil (Prestige I) and showed an increase in structural chromosome alterations in exposed individuals. The associations between the increase of chromosomal alterations and the risk of developing cancer revealed the importance of conducting a follow-up study (Prestige II). The main objective of this doctoral thesis is to determine if the previously detected genotoxic effect persists six years after the exposure. We have analyzed 104 fishermen, 58 exposed and 46 not exposed to the oil, with conventional culturing of 48 h lymphocytes. And 44 of the same individuals were studied with culturing with aphidicolin, to test possible errors in DNA repair. Based on our results, the results of the previous studies (Prestige I 72 h and Prestige II 72h) and the comparison between them, we must conclude that: a) follow-up studies only have to include previously studied individuals, b) chromosomal lesions are not a good genotoxicity biomarker when the fuel is not present, c) the time of culturing does not affect the detection of chromosomal damage two years after the exposure, d) the frequency of structural chromosome alterations is about two times higher than described in normal population, which confirms that genotoxic effect previously detected still persists six years after the exposure, e) the increase of damage in non-exposed individuals makes us believe that these individuals have undergone a less intense exposure to the oil (contaminated food or stored residues) or to another genotoxic agent, which affected them, f) the high damage in exposed individuals, in Prestige I and Prestige II, is associated with errors in DNA repair. Finally, the socio-sanitary interest of our results shows the need for similar studies to confirm if accidental exposure to oil increases the risk of developing cancer.

La correcta trazabilidad de las muestras derivadas de la práctica de las técnicas de reproducción asistida principalmente ovocitos, semen y embriones es esencial, tanto en la reproducción asistida de humanos como de animales de renta. Los sistemas actualmente destinados a mantener identificada la muestra durante su paso por el laboratorio y a preservar dicha trazabilidad presentan ciertas limitaciones. En esta tesis se ha desarrollado un sistema de etiquetaje directo de ovocitos y embriones utilizando microdispositivos codificados de polisilicio que permite mantener la muestra identificada, y por lo tanto trazarla durante todo su procesamiento cubriendo así la mayoría de las limitaciones detectadas en los sistemas actualmente disponibles para esta función. / The correct traceability of samples derived from the practice of assisted reproductive technologies mainly oocytes, semen and embryos is essential, both in human and livestock assisted reproduction. Current systems designed to maintain the sampleidentifiedduringallthe laboratory procedures and to preserve its traceability have certain limitations. In this thesis a direct tagging system for oocytes and embryos, using encoded polysilicon microdevices, has been developed. This system keeps the sample identified throughout its processing, allowing its traceability at any time. Thus, the limitations detected in the systems currently available can be overpassed by means of the implementation of the direct tagging system developed here.

Els telòmers són estructures ribonucleoproteiques formades per repeticions en tàndem TTAGGG, un complex proteic específic (shelterina), i RNA telomèric no codificant (TERRA), que es localitzen als extrems dels cromosomes eucariotes per prevenir la inestabilitat genòmica i les fusions entre cromosomes. En les cèl·lules germinals, el manteniment de l’estructura telomèrica és crucial per a la correcta progressió de la gametogènesi, ja que els telòmers participen en l’aparellament entre cromosomes homòlegs durant la profase I de la meiosi, i promouen la sinapsi i la recombinació entre ells. De fet, la disrupció de l’homeòstasi telomèrica provoca l’apoptosi de les cèl·lules germinals i/o la generació d’aneuploïdies, i està altament relacionada amb la senescència reproductiva. No obstant, poc se’n sap dels mecanismes encarregats de preservar l’estructura i longitud telomèrica al llarg de la gametogènesi dels mamífers. Per aquest motiu, tenint en compte que TERRA és un component integral de l’estructura telomèrica, i que la telomerasa és el complex enzimàtic que allarga els telòmers, en aquest treball es va plantejar l'estudi de la implicació d’aquestes dues molècules en la preservació de l’homeòstasi dels telòmers en les cèl·lules germinals de mamífer. Amb aquest objectiu, es van analitzar cèl·lules germinals humanes i de ratolí al llarg de la gametogènesi mitjançant tècniques citogenètiques i moleculars. Els nostres resultats mostraren que tant TERRA com el component proteic de la telomerasa (TERT) es localitzaven als telòmers de les cèl·lules germinals. La distribució nuclear de TERRA estaria subjecta a un llindar dependent dels nivells cel·lulars de TERRA i del gènere de la cèl·lula (oòcit o espermatòcit), mentre que la transcripció de TERRA dependria de l’estadi de la gametogènesi i de l’estat del mateix telòmer. D’altra banda, TERT es trobava majoritàriament als telòmers de les cèl·lules germinals, sobretot en ratolí, tot i que no s’observà l’elongació dels telòmers al llarg de la gametogènesi. Alhora, la (baixa) co-localització entre TERRA i TERT als meiòcits humans i de ratolí es produïa majoritàriament fora del complex telomèric. De la mateixa manera, es va analitzar la distribució de TERRA i TERT en espermatòcits de pacients diagnosticats amb infertilitat idiopàtica d’origen no obstructiu, els quals mostraren un menor nombre d’esdeveniments de recombinació en comparació amb els espermatòcits control. S’observà una reducció en els nivells de TERRA conjuntament amb una disrupció de la distribució telomèrica de TERRA i TERT en les cèl·lules dels individus infèrtils: mentre TERRA tendia a localitzar-se als telòmers, TERT tendia a dissociar-se’n. No obstant, ni el nombre de repeticions telomèriques ni l’associació de TERRA i TERT es veien afectades. Per tant, en base als nostres resultats, proposem que TERRA i TERT s’associarien amb els telòmers de les cèl·lules germinals humanes i de ratolí per tal de participar en el manteniment de l’estabilitat de l’estructura telomèrica durant els complexos esdeveniments cromosòmics que tenen llocs durant la meiosi i la gametogènesi. Alhora, donat que l’homeòstasi d’aquestes dues molècules es veu alterada a les cèl·lules germinals de pacients infèrtils, el seu anàlisi en meiòcits, conjuntament amb d’altres paràmetres, podria ser útil per a la determinació de l’origen de la infertilitat humana. / Telomeres are ribonucleoprotein complexes, composed by TTAGGG tandem repeats, a telomere-specific protein complex (shelterin) and telomeric noncoding RNA (TERRA) that cap the ends of eukaryote chromosomes preventing them from genomic instability and fusions. In mammalian germ cells, the maintenance of the telomeric structure is crucial for the proper progression of gametogenesis since telomeres are involved in homologous chromosomes pairing during the meiotic prophase I, also promoting their synapsis and recombination. In fact, disruption of telomere homeostasis leads to germ cells apoptosis and/or aneuploidy, and has been strongly related to reproductive aging. However, little is known on the mechanisms preserving telomere structure and length during mammalian gametogenesis so far. Thus, taking into account that TERRA is an integral component of the telomeric structure, and that telomerase is the enzymatic complex that elongates telomeres, the main objective of this work was to investigate whether these two molecules are implicated in the preservation of telomere homeostasis of mammalian germ cells. To this aim, mouse and human germ cells were analyzed by cytogenetic and molecular techniques throughout gametogenesis. Our results showed that both TERRA and the protein component of telomerase (TERT) localized at telomeres of germ cells. The distribution of TERRA in the nucleus would be subjected to a threshold that would depend on TERRA cellular levels and the cell gender (i.e. oocyte or spermatocyte), whereas TERRA transcription would be regulated according to the gametogenic stage and the telomere status per se. On the other hand, TERT highly localized at germ cells telomeres, especially in mouse, although no telomere elongation was observed in these cells throughout gametogenesis. Moreover, (scarce) TERRA and TERT co-localization occurred out of the telomeric complex in mouse and human meiocytes. In the same way, TERRA and TERT distribution was analyzed in human spermatocytes from patients diagnosed with idiopathic non-obstructive infertility, which showed fewer recombination events compared to spermatocytes of a control donor. A reduction in TERRA levels together with a disruption of the telomeric distribution of TERRA and TERT was observed in cells of infertile individuals. While TERRA was prone to localize at telomeres, TERT tended to dissociate from them. Nevertheless, neither the number of telomeric repeats nor TERRA-TERT association was affected in spermatocytes of infertile patients. Therefore, in the light of our results, we propose that TERRA and TERT would associate with telomeres of mouse and human germ cells to participate in the maintenance of the stability of telomere structure during the complex chromosome events taking place throughout meiosis and gametogenesis. Moreover, since the homeostasis of these two molecules is disrupted in germ cells from infertile patients, they could be useful to determine of the origin of human infertility by their analysis in meiocytes together with other parameters.

La guia axonal i la migració són dos processos similars i crucials per al desenvolupament. Aquests dos elements permeten el correcte posicionament cel•lular i la selecció de dianes essencial per a la funcionalitat posterior del sistema nerviós central, i es fonamenten en la regulació de l’avanç del con de creixement o la cèl•lula, respectivament, en resposta a estímuls externs, quimioatraients i quimiorepulsius, proporcionats per molècules de guia. Un altre component clau del funcionament neuronal és l’exocitosi, que permet la propagació dels estímuls nerviosos entre cèl•lules a través de la fusió de vesícules amb la membrana plasmàtica i l’alliberament de neurotransmissors. L’exocitosi està vehiculada per les proteïnes SNARE, que es troben a la membrana cel•lular i de la vesícula i que, a través de la unió paral•lela dels dominis catalítics, aproximen les membranes plasmàtica i vesicular possibilitant-ne la fusió Malgrat posseir la maquinària necessària per a l’exocitosi, les neurones en desenvolupament no presenten estructures especialitzades per a la transmissió del senyal com són les sinapsis, i es creu que el paper de les proteïnes del complex SNARE rau en el manteniment de la homeòstasi de membrana. Conceptualment, és fàcil pensar que la guia axonal i la migració actuïn a través del control precís de la dinàmica de la membrana, augmentant localment la superfície de la neurona i expandint-la en la direcció del creixement. En aquesta tesi hem investigat el paper de la dinàmica de membrana en la guia axonal i la migració. Concretament, ens hem centrat en l’estudi de la interacció del receptor de la Netrina-1 amb les proteïnes del complex SNARE en dos sistemes bàsics per a l’establiment de connexions del cervell: la guia dels axons de neurones de l’hipocamp i la migració de les neurones del llavi ròmbic atrets cap a una font de Netrina-1. També hem estudiat l’efecte del silenciament de les proteïnes del complex SNARE en dos paradigmes de guia axonal in vivo: la navegació dels axons de les cèl•lules comissurals de la medul•la espinal cap a, a través i més enllà de la línia mitja, i la innervació de l’extremitat inferior per part de les motoneurones d’embrions de pollastre. El tercer focus d’atenció ha estat l’estudi de la dinàmica de membrana i l’exocitosi al con de creixement de neurones d’hipocamp murí en resposta a estímuls quimioatraients de Netrina-1. Els resultats obtinguts durant aquesta tesi han demostrat que el receptor de la atractiu de la Netrina-1 DCC interacciona in vivo amb les proteïnes del complex SNARE Sintaxina1 i TI-VAMP, però no amb SNAP25 o VAMP2 en cèl•lules d’hipocamp i neurones migrants del llavi ròmbic inferior. A més, la interacció de DCC amb Sintaxina1 està regulada pel lligand, però l’exocitosi del receptor de Netrina-1 no es veu afectada per tractaments amb toxines que proteolitzen Sintaxina1. Hem descrit que les proteïnes del complex SNARE són imprescindibles per a la guia dels axons de neurones comissurals i motoneurones , perquè el silenciament de Sintaxina1, SNAP25, VAMP2 o TI-VAMP causa defectes en la navegació dels seus axons compatibles amb alteracions de diversos sistemes (molècula guia-receptor) de guia axonal. Per últim, hem descrit la dinàmica de membrana i l’exocitosi a nivell del con de creixement amb una tècnica innovadora, que permet la monitorització de l’exocitosi en temps real, i, i hem descrit com la Netrina-1 incrementa l’exocitosi dependent de proteïnes SNARE a nivell del con de creixement i les vies de senyalització que hi estan implicades. / Role of Synaptic Proteins and Exocytosis in Axon Guidance and Migration. Axon guidance and migration are two similar processes which are key to the development of the nervous system by allowing the correct localization and innervation of neurons. They regulate the elongation of the axon and the movement of cells by the use of guidance molecules which act as chemoattractants or chemorepellents at short and long ranges. A second crucial component in the nervous system functionality is exocytosis. It allows the communication of neighboring cells by the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane and the release of the vesicle contents to the extracellular space, a process mediated by the SNARE proteins. SNARE proteins located at the vesicle and the plasma membranes interact and bring the two membranes into close apposition, thereby facilitation fusion. Developing neurons have a vast array of synaptic proteins whose function is thought to reside in the regulation of membrane homeostasis. It is plausible to think that axon guidance and migration may act thru the precise control of membrane dynamics at discrete locations of the growth cone/leading edge, thereby expanding the neuron on the direction of growth. In this thesis we have analyzed the role of SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration. We have focused our studies in the analysis of the interaction between the guidance receptor DCC and SNARE proteins in the attraction of hippocampal axons and migrating neurons of the lower rhombic lip towards a Netrin-1 source. We have also studied the role of SNARE proteins in two axon guidance paradigms such as the navigation of commissural axons of the spinal cord and motoneurons. Furthermore, we have also investigated Netrin-1-induced exocytosis in growth cones using live imaging techniques. Our results demonstrate the necessary participation of SNARE proteins and SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration; reveal a ligand-regulated interaction between the Netrin-1 receptor DCC and the SNAREs Syntaxin1 and TI-VAMP; and show that Netrin-1 triggers SNARE-mediated exocytosis in the growth cone.

Los síndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) son dos síndromes de desarrollo y conducta que ocurren con una frecuencia 1/15.000-20.000 recién nacidos. Resultan de la pérdida física o funcional de genes regulados por la impronta dentro de la región 15q11-q13. SPW está asociado con la perdida de expresión de alelos paternos, mientras que el SA está asociado con la perdida de expresión de alelo materno. Aproximadamente el 70% de los pacientes SPW presentan deleción en el cromosoma paterno, el 20-30% disomía uniparental materna y el 1% defecto de impronta. En los pacientes SA el 70% presentan deleción en el cromosoma materno, el 6% disomía uniparental paterna, el 2-7% defecto de impronta, el 4-10% mutación del gen UBE3A y en el 10-12% la etiología es desconocida. El diagnóstico citogenético molecular de estos síndromes se realiza normalmente usando la combinación de varias técnicas debido a que la base genética es compleja. Nuestro laboratorio en 1991 inició los estudios de citogenética, en 1993 los estudios de FISH, en 1994 el análisis de microsatélites y en 1996 el análisis de metilación. De nuestra experiencia proponemos un algoritmo de diagnóstico molecular. Se han analizado entre los años 1991-2000, 151 pacientes y seis líquidos amnióticos con sospecha de SPW y 147 pacientes y dos líquidos amnióticos con sospecha de SA procedentes del territorio español. Las técnicas empleadas han sido el estudio del cariotipo mediante bandas G, la hibridación in situ fluorescente, el análisis de microsatélites y el análisis de metilación con detección quimioluminiscente. El diagnóstico de SPW se ha confirmado en 40 pacientes, 28 causado por deleción, cinco por disomía uniparental, dos por defecto de impronta y en cinco no se ha determinado la etiología. El SA se ha confirmado en 47 pacientes, 39 por deleción, cuatro por disomía uniparental y en cuatro no se ha determinado la etiología. Quince pacientes con sospecha de SA y estudio molecular normal han presentado una clínica típica SA, por lo que han sido considerados candidatos a presentar una mutación en el gen UBE3A o ser pacientes de etiología desconocida.Las características clínicas de los pacientes han sido recogidas por médicos especialistas, correlacionándola con la etiología. Los pacientes SPW con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a los otros grupos en hipotonía neonatal, obesidad, hiperfagia, retraso del desarrollo, hipogonadismo, manos y pies pequeños, anomalías dentales, saliva viscosa, alteraciones de comportamiento y problemas de sueño. Solo se han observado diferencias en problemas de alimentación (93% vs 50%, p=0.070) entre deleción y disomía uniparental, y en facies característica (100% vs. 50%, p= 0.069) entre pacientes con deleción y defecto de impronta. Los pacientes SA con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a las otras etiologías en retraso en el desarrollo y del lenguaje, ataxia, risa frecuente, aleteo de manos, hipermotricidad, poca atención, microcefalia, convulsiones, EEG anormal, occipital plano, boca ancha, babeo e hipopigmentación. Las frecuencias observadas han sido semejantes a las de estudios previos. En cambio, se han observado diferencias entre deleción y disomía uniparental en problemas de alimentación (100% vs. 0%, p=0.008), protusion de la lengua (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) y comunicación por gestos (23% vs. 75%, p=0.060). Estos resultados señalan que el dismorfismo facial y la comunicación por gestos son menos severos en los pacientes con disomía. Sin embargo, no podemos concluir que el fenotipo de estos pacientes sea menos severo que el de los pacientes con deleción.Este trabajo ha permitido un mayor conocimiento molecular y clínico de estos dos síndromes que ha llevado a que seamos centro de referencia y asesores de familias afectas. / Prader-Willi (PWS) and Angelman (AS) syndromes are distinct developmental and neurobehavioral syndromes that occur at a frequency of 1/15.000-20.000 live births. Both are a results of a loss of function of imprinted genes mapped to the chromosome region 15q11-q13. PWS is associated with a loss of expression of paternally derived alleles, whereas AS is associated with a loss of expression of maternal allele. The etiology is heterogeneous: approximately 70% of PWS patients present deletion in the paternal chromosome, 20-30% maternal uniparental disomy and 1% imprinting defect. In AS, 70% present deletion in the maternal chromosome, 6% paternal uniparental disomy, 2-7% imprinting defect, 4-10% mutation of the gene UBE3A and 10-12% have an unknown etiology. Molecular and cytogenetic diagnosis is currently performed using a combination of several techniques due to the complexity of the genetic basis of these syndromes. Our laboratory began in 1991 cytogenetics studies, in 1993 studies of FISH, in 1994 microsatellites analysis and in 1996 methylation analysis. Due to our experience an algorithm for molecular diagnostic was proposed. Between the years 1991-2000, we analyzed 151 patients and six amniocentesis with suspicion of PWS and 147 patients and two amniocentesis with suspicion of AS from Spain. The techniques used were G-banding karyotype, the fluorescent in situ hybridization (FISH), microsatellite analysis and methylation analysis with chemiluminescent detection. The diagnosis of PWS was confirmed in 40 patients, 28 with deletion, five with uniparental disomy, two with imprinting defect and in five the etiology was not been determined. AS diagnosis was confirmed in 47 patients, 39 with deletion, four with uniparental disomy and in four the etiology was not determined. Fifteen patients with suspicion of AS and normal molecular study had classical AS phenotype, and they were considered candidates to present a mutation in the gene UBE3A or unknown etiology. The clinical characteristics of the patients were registered by the specialist physician. The received information was correlated with the etiology. The PWS patients with deletion did not present significant differences from the other groups regarding neonatal hypotonia, obesity, hyperphagia, developmental delay, hypogonadism, small hands and feet, dental anomalies, viscous salivates, behavioural disorders and sleep disturbance. The only differences observed were in feeding problems (93% vs 50%, p=0.070) between deletion and uniparental disomy, and in facies characteristic (100% vs. 50%, p = 0.069) among patients with deletion and imprinting defect. AS patients with deletion did not present significant differences from the other etiologies in developmental delay, absent speech, ataxia, frequent laughing, flapping of hands, hypermotricity, little attention, microcephaly, seizures, abnormal EEG, occipital groove, macrostomia, drooling and hypopigmentation. The observed frequencies were similar to those of previous studies. On the other hand, differences were observed between deletion and uniparental disomy in feeding problems (100% vs. 0%, p=0.008), protruding tongue (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) and communication through gestures (23% vs. 75%, p=0.060). These results point out that the facial dismorfism and communication by gestures are less severe in the patients with disomy. However, we cannot conclude that the phenotype of these patients is less severe than that of the patients with deletion. This work gave us a greater molecular and clinical knowledge of these two syndromes allowing us to become a reference and advisory centre for affected families.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan tanto animales como humanos. Están causadas por unas partículas proteicas denominadas “priones”, resultantes de la transformación de la proteína priónica celular (PrP(C)) a una forma patogénica denominada PrP(SC), que se acumula en el cerebro en forma de agregados e induce la transformación de más moléculas a expensas de la reducción de los niveles de PrP(C). Hasta el día de hoy, el estudio de las prionopatías se ha centrado en la bioquímica, toxicidad y transmisibilidad de PrP(SC). Sin embargo, la pérdida de la proteína endógena puede también contribuir al desarrollo de la enfermedad. A día de hoy, la función fisiológica de PrP(C) está aún por esclarecer, aunque los análisis realizados la involucran en procesos de: i) ciclo celular y proliferación, ii) homeostasis del cobre, iii) neuroprotección, iv) transmisión sináptica y v) señalización intracelular, entre otros. Esta Tesis Doctoral aborda la función de PrP(C) en la regulación del ciclo celular y la neuroprotección, ampliando los conocimientos existentes mediante la descripción de las vías moleculares implicadas en ambos procesos. Nuestros datos describen a PrP(C) como una proteína capaz de integrar gran variedad de señales extracelulares y generar respuestas a través de la modulación de diferentes vías de señalización asociadas. Hemos observado como la modulación transitoria de los niveles de PrP(C) en una línea celular de neuroblastoma produce cambios dosis-dependientes sobre los mecanismos de proliferación celular. Estas alteraciones son debidas a la interacción de la proteína con EGFR y la consiguiente activación de las vías ERK1/2 y AKT, que incluyen entre sus dianas a elementos reguladores del ciclo celular. PrP(C) también parece ejercer cierta influencia sobre la formación de filopodios en este tipo celular, regulando la dinámica del citoesqueleto de actina por su acción sobre las Rho GTPasas, concretamente, vía Cdc42-N-WASP. Por otro lado, el uso de un modelo in vivo de excitotoxicidad por KA nos ha permitido entrar en detalle en la función neuroprotectora de PrP(C). Se conoce que tanto la susceptibilidad incrementada de los ratones Prnp-knockout a agentes convulsionantes como el daño neurotóxico derivado a nivel del hipocampo, son debidos a la activación de la vía JNK3 de muerte celular. Sin embargo, nuestros resultados obtenidos in vivo de ratones Prnp0/0 Jnk3+/+ y Prnp0/0 Jnk30/0 describen por primera vez la participación de PrP(C) en la modulación de esta vía de señalización. Hemos descrito como la proteína priónica interactúa a nivel postsináptico con la subunidad GluR6/7 de los receptores de glutamato, bloqueando por un lado la formación del complejo trimérico GluR6/7-PSD-95-MLK3 que lleva a la activación de la vía JNK3 y, por otro, modulando la actividad del receptor, que es un factor determinante de la excitabilidad neuronal incrementada propia de un episodio epiléptico. Esta Tesis Doctoral supone, por lo tanto, un avance en el conocimiento de la función fisiológica de PrP(C) y, consecuentemente, en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad priónica. La implicación de esta proteína en procesos proliferativos esenciales durante la neurogénesis así como en la regulación de la transmisión sináptica, deja entrever que PrP(C) es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los circuitos neuronales. Probablemente, las alteraciones derivadas de la reducción de los niveles de PrP(C) se suman a los efectos neurotóxicos de la agregación de PrP(SC), dando lugar al desarrollo de la enfermedad. Asimismo, la descripción de los mecanismos moleculares y vías de señalización reguladas por PrP(C) también abre las puertas a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de las EETs. / Transmissible spongiform encephalopathies constitute a group of fatal neurodegenerative disorders affecting both animals and humans. The causative agents of these diseases are “prions”, which are defined as proteinaceous infectious particles that result from an abnormal conformational folding of the cellular prion protein (PrPC) into a pathogenic form called PrPSC. Although the role of PrPSC has been intensively studied, the physiological function of PrPC still remains unclear. Several evidences support the notion that PrPC plays a role in different cellular processes including: i) cell cycle and proliferation, ii) copper homeostasis, iii) neuroprotection, iv) synaptic transmission and v) intracellular signaling, among others. Here we expand previous data concerning PrPC function by describing the molecular mechanisms by which PrPC regulates cell proliferation in vitro and excitotoxic cell death in vivo. First, we describe how transient overexpression of PrPC in Neuro2a cells enhances cell cycle progression after mitogenic stimulation, while the opposite effect is observed when PrPC is silenced. These effects are due in part to the interaction of PrPC with the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the cell membrane and the consequent downstream activation of ERK1/2 and protein kinase B (AKT) pathways. We also describe PrPC-dependent filopodia formation in Neuro2a cells through the modulation of AKT-Cdc42-N-WASP pathway. In a second study, we took advantage of the Prnp0/0Jnk3+/+ and Prnp0/0Jnk30/0 mice models to analyze the neuroprotective role of PrPC against kainate-induced epileptic seizures and cell death. Our results indicate that PrPC regulates kainate receptor-mediated neurotransmission through its interaction with the GluR6/7-PSD-95-MLK3 complex and the downstream modulation of JNK3 neurotoxic signaling. These new insights into the molecular functions of PrPC help us to understand the physiopathological events underlying prion disease and other related neurodegenerative pathologies.

Las biomembranas constituyen la estructura de separación fundamental en las celulas animales, y son importantes en el diseño de sistemas bioinspirados. Su simulación presenta desafíos, especialmente cuando ésta implica dinámica y grandes cambios de forma o se estudian sistemas micrométricos, impidiendo el uso de modelos atomísticos y de grano grueso. El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de un marco computacional para entender la dinámica de biomembranas inmersas en fluido viscoso usando modelos de campo de fase. Los modelos de campo de fase introducen un campo escalar contínuo que define una interfase difusa, cuya física está codificada en las ecuaciones en derivadas parciales que la gobiernan. Estos modelos son capaces de soportar cambios dramáticos de forma y topología, y facilitan el acoplamiento de distintos fenómenos físicos. No obstante, presentan desafíos numéricos significativos, como el alto orden de las ecuaciones, la resolución de frentes móviles y abruptos, o una eficiente integración en el tiempo. En esta disertación abordamos estos puntos mediante la combinación de una discretización espacial con métodos sin malla usando las funciones base locales de máxima entropía, y una formulación variacional Lagrangiana para acoplamiento elástico-hidrodinámico. La suavidad del método sin malla genera una aproximación precisa del campo de fase y puede lidiar fácilmente con adaptatividad local, la aproximación Lagrangiana extiende de manera natural esta adaptividad a la dinámica, y la formulación variacional permite una integración variacional temporal no linealmente estable y robusta. La implementación numérica de estos métodos en un entorno de computación de alto rendimiento ha motivado el desarrollo de un nuevo código computacional. Este código integra el estado del arte de las librerías en paralelo e incorpora importantes contribuciones técnicas para solventar cuellos de botella que aparecen con el uso de métodos sin malla en computación a gran escala. El código resultante es flexible y ha sido aplicado a otros problemas científicos en varias colaboraciones que incluyen flexoelectricidad, conformado metálico, fluidos viscosos o fractura en materiales con energía de superficie altamente anisotrópica. / Biomembranes are the fundamental separation structure in animal cells, and are also used in engineered bioinspired systems. Their simulation is challenging, particularly when large shape changes and dynamics are involved, or micrometer systems are considered, ruling out atomistic or coarse-grained molecular modeling. The main goal of this thesis is to develop a computational framework to understand the dynamics of biomembranes embedded in a viscous fluid using phase-field models. Phase-field models introduce a scalar continuous field to define a diffuse moving interface, whose physics is encoded in partial differential equations governing it. These models can deal with dramatic shape and topological transformations and are amenable to multiphysics coupling. However, they present significant numerical challenges, such as the high-order character of the equations, the resolution of sharp and moving fronts, or the efficient time-integration. We address all these issues through a combination of meshfree spacial discretization using local maximum-entropy basis functions, and a Lagrangian variational formulation of the coupled elasticity-hydrodynamics. The smooth meshfree approach provides accurate approximations of the phase-field and can easily deal with local adaptivity, the Lagrangian approach naturally extend adaptivity to dynamics, and the variational formulation enables nonlinearly-stable robust variational time integration. The numerical implementation of these methods in a high-performance computing framework has motivated the development of a new computer code, which integrates state-of-the-art parallel libraries and incorporates important technical contributions to overcome bottlenecks that arise in meshfree methods for large-scale problems. The resulting code is flexible and has been applied to other scientific problems in a number of collaborations dealing with flexoelectricity, metal forming, creeping flows, or fracture in materials with strongly anisotropic surface energy.

La conexión GABAérgica septohipocámpica es un elemento crucial para el correcto funcionamiento del hipocampo y, en concreto, para determinados procesos de aprendizaje y memoria. La exquisita especificidad de contacto de este componente es la piedra angular que determina su función, pero los datos existentes sobre los mecanismos que rigen la selección de diana y sinaptogénesis de estos axones son escasos. Aunque esta conexión desempeña un papel elemental en procesos cognitivos que están afectados durante el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer, en el momento en que iniciamos este proyecto había un sorprendente vacío en la literatura sobre el estado de la vía GABAérgica septohipocámpica en estas situaciones. Hemos establecido el modelo in vitro del desarrollo de la conexión septohipocámpica, mediante cultivos organotípicos que constan de septum, hipocampo y corteza entorrinal obtenidos de animales neonatales. La conexión septohipocámpica se forma en nuestro modelo in vitro manteniendo la exquisita especificidad de contacto de su componente GABAérgico. Hemos comprobado, mediante el uso de tejido proveniente de ratones knock-out para Semaforina 3C y mediante la aplicación de ectodominios bloqueantes de los receptores de Semaforina 3C, que esta molécula es prescindible para el proceso de sinaptogénesis específica de los axones GABAérgicos septohipocámpicos in vitro. Utilizando el cultivo puesto a punto también hemos demostrado que las aferencias de corteza entorrinal a hipocampo no son necesarias para que la conexión se forme de manera específica. Se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de la inervación y complejidad de las sinapsis de la conexión GABAérgica septohipocámpica sobre diferentes tipos de interneuronas del hipocampo de ratones wild-type a diferentes edades (2, 8 y 18 meses), así como de ratones de la cepa transgénica J20 (modelo murino de enfermedad de Alzheimer) a 2 y 8 meses de edad. Los resultados de estos experimentos muestran que durante el envejecimiento normal, en ratones wild-type de 18 meses, se produce una disminución tanto en el número de fibras GABAérgicas septohipocámpicas como en la complejidad de sus contactos sinápticos. Estos déficits de la conexión GABAérgica septohipocámpica se producen de manera acelerada en ratones J20, modelo de enfermedad de Alzheimer. En esta cepa transgénica, los déficits histológicos observados van acompañados de alteraciones funcionales: disminución en la potencia de los ritmos theta y gamma hipocámpicos. El análisis del estado funcional del hipocampo de ratones J20 demuestra que la sinapsis CA3-CA1 funciona normalmente en los animales transgénicos J20, aunque con alteraciones sutiles en la facilitación sináptica a corto plazo. Los procesos de potenciación a largo plazo (LTP) de esta sinapsis están aumentados en el modelo de EA. En un paradigma de condicionamiento operante de autoestimulación, en que los animales pueden autoadministrarse estímulos eléctricos reforzantes en el septum medial, los animales J20 presentan peor aprendizaje y ejecución de la tarea. Hemos demostrado que, en animales WT, este refuerzo operante se correlaciona con una disminución de la respuesta obtenida en la sinapsis CA3-CA1. Los transgénicos J20 no presentan tal disminución, especialmente durante los primeros días del test, y por tanto muestran peor aprendizaje y ejecución del paradigma de refuerzo operante, como se observa en nuestros resultados. En estos mismos animales, además, la inducción de LTP afecta negativamente la ejecución de la tarea reforzante ya adquirida, seguramente porque la excesiva respuesta de la sinapsis una vez potenciada cancela esa disminución de la respuesta en CA3-CA1 que es necesaria para que tenga lugar el refuerzo operante. / The septohippocampal connection is a crucial element for some learning and memory processes which are affected during aging and in Alzheimer’s disease. The GABAergic component of this pathway displays an exquisite target selection, contacting only the interneurons of the hippocampus, but the mechanisms responsible for this target selection are poorly known. In this work we have created an organotypic in vitro model of the septohippocampal connection, which has allowed us to demonstrate that neither Semaphorin 3C nor the entorhinal input to the hippocampus are factors needed for the establishment of proper contacts of the GABAergic septohippocampal pathway. The in vitro model created here also serves as a tool for studying developmental and degenerative processes of the nervous system. We have carried out an exhaustive analysis of the innervation and synapse complexity of the GABAergic septohippocampal pathway in wild-type mice during the aging process and in a mouse model of Alzheimer’s disease (J20 line). Our results show that both the number and complexity of the GABAergic septohippocampal contacts decrease during aging, and this process is accelerated in the J20 Alzheimer’s mouse model. In this transgenic strain, the histological deficits are accompanied by functional alterations: a diminution in the theta and gamma rhythms of the hippocampus. The function of the CA3-CA1 synapse of the hippocampus is normal in the J20 mice, except for subtle alterations in the short-term synaptic plasticity. The long-term potentiation processes (LTP) of this synapse are increased in the Alzheimer model. In an operant conditioning paradigm in which mice can self-stimulate the septohippocampal connection, transgenic mice of the J20 line show poorer learning and performance of the task than do wild-type mice. In nontransgenic mice, the reward in this task correlates with an increase in the CA3-CA1 response which J20 transgenic mice lack, possibly explaining their poorer performance.

S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat. / La levadura S. cerevisiae es un organismo modelo muy utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el citoesqueleto actina y su función biológica, ya que los mecanismos moleculares que controlan la organización del citoesqueleto de actina están conservados, por lo que muchos de los descubrimientos realizados en S. cerevisiae son aplicables también en eucariotas superiores. Una de las principales funciones biológicas de la actina en S. cerevisiae es la formación de una vesícula endocítica. En este organismo, la formación de los perfiles endocíticos primarios ocurre de forma simultánea con el ensamblaje de una estructura de actina compleja (módulo de actina) que incluye al complejo nucleador de actina Arp2/3. Diferentes estudios indican que la miosina-I Myo5 junto su co-activador Vrp1 activan al complejo Arp2/3 produciendo la elongación del perfil endocítico. Nuestro laboratorio ha demostrado que el dominio C-terminal de Myo5 inmovilizado en la superficie de bolas de sefarosa induce el ensamblaje del módulo de actina en presencia de extracto de levadura. El análisis del ensayo demostró además que Myo5 está fosforilada por la quinasa CK2 en la S1205. En este estudio hemos caracterizado la actividad CK2 que fosforila a Myo5 en la S1205 y hemos investigado el significado funcional de dicha fosforilación in vivo e in vitro. Nuestros resultados indican que una actividad CK2 asociada a partículas, que incluye la subunidad catalítica Cka2 pero no Cka1 ni las subunidades reguladoras Ckb1 y Ckb2 fosforila la S1205 de Myo5. Esta fosforilación perturba la interacción entre Myo5 y su co-activador Vrp1, regulando negativamente la formación de las estructuras de actina complejas in vitro, y consistentemente, disminuyendo la velocidad de la internalización endocítica in vivo. Además, nuestros resultados también sugieren que Cka2 seguramente tiene otras dianas además de Myo5, y que su actividad podría regular otras fases iniciales durante la formación de la vesícula endocítica.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / El tráfico de membrana en el cono crecimiento axonal es clave durante el desarrollo del sistema nervioso. La familia de proteínas SNARE son una familia de moléculas cuya función principal es mediar la fusión entre membranas. Este hecho hace que las proteínas SNARE tengan potencialmente tengan un papel en el desarrollo axonal y otros procesos que impliquen una gran actividad en los procesos de tráfico de membrana: un ejemplo de casos como así es la progresión de tumores con un alto grado de recambio de membrana como el glioblastoma, que es el caso más común y mortal de astrocitoma de grado IV. Las proteínas SNAREs se clasifican en dos grupos t-SNARE (localizadas en las membranas objetivo) y v-SNARE (localizadas en las membranas vesiculares) y juntas median la fusión entre membranas a través de la formación del complejo SNARE. El complejo SNARE mejor caracterizado es el tetrámero formado por Sintaxina1 (Stx1), dos SNAP-25 y VAMP2. En esta tesis doctoral estudiamos en primer lugar el papel de las proteínas SNARE en los procesos de guía axonal. Para ello utilizamos como modelo el desarrollo del sistema nervioso embrionario en Drosophila melanogaster y obtuvimos como resultado que problemas en las proteínas SNARE, especialmente en Sintaxina1A (Syx1A), generan problemas de guía axonal en el sistema nervioso. Si nos centramos en los estudios del desarrollo del sistema nervioso en mutantes nulos para Syx1A, todas las estructuras nerviosas desde el sistema nervioso central, los nervios motores y el sistema periférico desarrollaron problemas de guía axonal. Además, estudios de interacción génica y una detalla caracterización del fenotipo sugieren que la alteración de las proteínas SNARE, especialmente Syx1A, genera problemas en la vía de guía axonal Slit/Robo. En segundo lugar, estudiamos el rol de las proteínas SNARE en la progresión tumoral. Pare ello analizamos los efectos in vitro e in vivo que tiene el bloqueo de la función de Stx1 en líneas celulares y modelos murínicos del glioblastoma Como resultado, detectamos una pérdida de la proliferación in vitro e in vivo al bloquear Stx1. Además, el bloqueo de Stx1 disminuye la capacidad invasiva in vitro de las células de glioblastoma. / The membrane delivery/traffic in the growth cone is a key element during axons development. SNARE family proteins may be important players in this process since they mediate the fusion of membrane vesicles with their targets. Moreover, since membrane trafficking is a key element during the progression of several tumors, SNAREs may be important also during tumoral progression. Two groups form the SNARE family: t-SNARE (Syntaxins, SNAPs…) located in the target membranes, and, v-SNARE (VAMPs), located in the vesicles. Complexes between specific t- and v- SNAREs are formed which ultimately leads to the fusion of vesicles with their target membranes. The best-characterized SNARE complex is the tetramer formed by syntaxin1 (Stx1), two SNAP-25 and VAMP2, which mediates the fusion of synaptic vesicles during the exocytosis of neurotransmitters. In order to study the role of SNARE in axon guidance we used as a model Drosophila melanogaster embryonic nerve system development. Embryos mutant for SNARE proteins developed axon guidance defects. From all the stocks, Syx1A had a severe phenotype in comparison with the other mutants. Syx1A null embryos developed axon guidance problems in all the nerve system structures: ventral nerve cord, motor axons or peripheral nerves. In addition, a deep analysis of the phenotype and genetic interaction studies suggest that Syx1A mutants have problems in Slit/Robo axon guidance pathway. In order to study the role of SNARE protein in tumoral progression we studied in vitro and in vivo the effect of Stx1 inactivation in glioblastoma models (glioblastomas are the most common and deadliest astrocitomas). Our results show that the loss of function in Stx1 decreases in vitro and in vivo glioblastoma progression and it blocks in vitro cellular invasion.