Per tal de protegir les cèl·lules germinals de sofrir inestabilitat genòmica, diversos mecanismes de control s’encarreguen de que la progressió de la meiosis sigui correcte. En mamífers, els espermatòcits que presenten defectes de recombinació o de la formació de la vesícula sexual pateixen un bloqueig a l’estadi de paquitè. Estudis previs del nostre laboratori descriuen que la via complex MRE11-ATM-CHK2 activa l’arrest dependent de recombinació en presència de trencaments de doble cadena (DSBs) no reparats. L’objectiu d’aquest treball ha estat identificar si els membres de la família p53, els quals són possibles substrats de ATM i CHK2, participen en l’activació del arrest depenent de recombinació. En una aproximació genètica, hem obtingut ratolins doble mutants portadors d’una mutació de un membre de la família p53 (p53, Tap63 o p73) en un fons defectiu per Trip13. La mutació de Trip13 causa defectes de recombinació, el qual activa l’arrest depenent de recombinació en els espermatòcits a l’estadi de paquitè. Per tant, hem estudiat com l’absència d’algun membre de la família p53 afectava aquest fenotip d’arrest el espermatòcits Trip13mod/mod. Els nostres resultats demostren que tant la deficiència de p53 com Tap63, però no p73, permeten que els espermatòcits progressin més enllà i arribin a l’estadi de paquitè tardà tot i acumular nombrosos DSBs no reparats. Addicionalment, l’absència de p53 o Tap63 resulta en una disminució del nombre d’espermatòcits apoptòtics a l’estadi de paquitè primerenc. Així, els nostres resultats indiquen que p53 i TAp63 són responsables d’activar l’arrest dependent de recombinació en els espermatòcits de ratolí. Tot i així, els espermatòcits doble mutants encara presenten un bloqueig a l’estadi de paquitè. Per tal d’estudiar si els espermatòcits doble mutants arresten a causa de l’activació de l’arrest depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, hem analitzat la funcionalitat del MSCI en els mutants Trip13. Per tant, el fet de saltar-se l’arrest dependent de recombinació ens ha permès elucidar el paper de TRIP13 en el silenciament meiòtic, de manera que al fallar la vesícula sexual es desencadena l’apoptosi i bloqueig dels mutants Trip13. Aquests resultats infereixen que el bloqueig depenent de recombinació i el depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, són mecanismes que s’activen per mecanismes genèticament separats. A partir de l’observació que TRIP13 és necessari per implementar el silenciament del MSCI, he dut a terme un anàlisis exhaustiu de la transcripció en els mutants de Trip13. Els nostres resultats de marcatge de RNA amb EU i activació de la RNA polimerasa II fosforilada (S2) suggereixen que la expressió de RNA en els espermatòcits mutants per Trip13 es troba incrementada en els estadis inicials de la meiosis. Addicionalment, la seqüenciació del RNA ha permès observar que els gens dels cromosomes sexuals i gens pre-meiòtics es troben sobre expressats en els mutants de Trip13, suggerint que TRIP13 és necessari per mantenir l’expressió d’aquests gens a nivells baixos. En conjunt, els resultats presentats en aquest treball contribueixen a entendre com els mecanismes de control regulen diversos passes crucials de la progressió de la profase meiòtica en els espermatòcits de mamífer. / In order to protect germinal cells from genomic instability, surveillance mechanisms ensure that meiosis occurs properly. In mammals, spermatocytes that display recombination or sex body defects experience an arrest at pachytene stage. Previous studies from our lab described that the MRE11 complex-ATM-CHK2 pathway activates the recombination-dependent arrest in the presence of unrepaired double strand breaks (DSBs). In this work we aimed to identify if p53 family members, which are putative targets of ATM and CHK2, participate in the activation of the recombination-dependent arrest. As a genetic approach, we bred double mutant mice carrying a mutation of a member of the p53 family (p53, TAp63, p73) in a Trip13 defective background. Trip13 mutation causes recombination defects, which activate the recombination-dependent arrest in pachytene-stage spermatocytes. Thus, we studied how the absence of p53 family members affected the arrest phenotype of Trip13mod/mod spermatocytes. Our data showed that p53 and TAp63 deficiency, but not p73, allowed spermatocytes to progress further into late pachynema, despite accumulating numerous unrepaired DBSs. In addition, lack of p53 or TAp63 resulted in a decrease of apoptotic spermatocytes at early pachytene stage. Therefore, our results indicate that p53 and TAp63 are responsible to activate the recombination-dependent arrest in mouse spermatocytes. Even though, double mutant spermatocytes still arrested at pachytene stage. To study if double mutant spermatocytes were arresting due to the activation of the sex body deficient arrest we analyzed MSCI functionality in Trip13 mutants. Thus, by bypassing the recombination-dependent arrest has allowed us to elucidate a role for TRIP13 protein in meiotic silencing, which consequently triggers apoptosis in double mutants at late pachytene stage due to sex body impairment. These results infer that the recombination-dependent and the sex-body deficient arrest are activated by two genetically separated mechanisms. From the observation that TRIP13 is required to implement MSCI silencing, we performed an exhaustive analysis of transcription in Trip13 mutants. Our results suggested that RNA expression in Trip13 mutants was increased in early meiotic stage spermatocytes, assessed by EU-labeling RNA and phosphorylated(S2)-RNA polymerase II. Moreover, RNA sequencing data highlighted the observation that sex chromosome genes and pre-meiotic genes are overexpressed in Trip13 mutants, suggesting that TRIP13 is required to maintain the expression of these genes at low levels. Overall, the data presented in this work contributes to the understanding on how surveillance mechanisms control several crucial steps of meiotic prophase progression in mammalian spermatocytes.

Des de la preocupació envers els riscos derivats dels programes de cribratge mamogràfic en la població i la impossibilitat d’analitzar-los de manera completa a partir d’estudis epidemiològics, es va analitzar la capacitat de les cèl·lules epitelials mamàries humanes de fer front als trencaments de cadena doble induïts pel mamògraf. Els resultats mostren que després de rebre una dosi de raigs X de 20 mGy, equivalent a la dosi estàndard rebuda per la superfície de la mama en una exploració mamogràfica, les cèl·lules epitelials mamàries (HMECs) envellides in vitro presenten un nombre major de trencaments de cadena doble (DSBs) que les cèl·lules més joves. Els nostres estudis apunten a una resposta ineficient del dany en les cèl·lules envellides a causa d’una mobilització incompleta i endarrerida de les proteïnes de reparació en els punts de trencament. Aquesta resposta ineficient es tradueix en un retard important en la reparació dels trencaments de cadena doble en les cèl·lules de population doublings (PD) més avançats, que dóna lloc a un augment de la inestabilitat genètica. Mitjançant la posta a punt d’una tècnica automatitzada i molt sensible de seguiment de la fosforilació de H2AX, un dels primers esdeveniments que tenen lloc en la senyalització dels DSBs, es va poder determinar també l’eficiència de la resposta al dany en cèl·lules BPECs de diferents donants transduïdes amb hTERT. Aquest segon estudi va permetre establir, tot i que de manera molt preliminar, que la lentitud en la reparació dels DSBs, no només apareixia a mesura que augmentaven el nombre de passes en cultiu, com havíem vist en les HMECs, sinó que també augmentava amb l’edat de la donant. Per l’establiment d’aquesta tècnica es va tenir en compte la rellevància de la fase del cicle cel·lular en el recompte dels foci de γH2AX deguda als canvis en el patró de marcatge de la histona al llarg d’aquest. Un cop avaluades les cinètiques d’aparició i desaparició de foci d’histona fosforilada, tant en HMECs com en BPECs es va observar que la re-expressió de la telomerasa i el conseqüent allargament dels telòmers no evitava que les cèl·lules presentessin una DDR (DNA Damage Response) alentida a PDs avançats. Aquests resultats ens va conduir a realitzar una revisió exhaustiva de la bibliografia per explorar quins factors, a banda de l’escurçament telomèric, podrien jugar un paper important en la relació entre envelliment i radiosensibilitat. Entre aquests, s’ha vist que l’estrès oxidatiu que pateixen les cèl·lules amb l’envelliment té un paper molt rellevant, tant pel seu rol com a agent nociu i generador de trencaments en el DNA com en relació a l’oxidació que té lloc en altres estructures cel·lulars. Per altra banda, també tenen lloc un seguit de canvis en l’organització nuclear relacionats amb l’envelliment, com la reestructuració de la heterocromatina, la pèrdua de funcionalitat de la lamina A o la manca d’integritat dels porus nuclears. En la revisió es va fer molta incidència en les relacions entre aquests canvis en l’organització nuclear i el detriment de la DDR observat en varis estudis i en el nostre. La conclusió més destacada és que s’observa una relació multifactorial entre la radiosensibilitat i l’edat. Fent palès des de diferents assajos que la capacitat de les cèl·lules de fer front al dany en el DNA es veu reduïda amb l’envelliment i que aquesta reducció podria contribuir a explicar l’augment dels riscos carcinogènics de l'exposició a radiacions en edats més avançades revelats pels estudis epidemiològics. Davant d’un augment en l’esperança de vida es fa cada cop més necessari tenir en compte l’envelliment alhora d’establir polítiques de radioprotecció. / Concerned about the risks of mammography screening and in order to overcome the limitations of the epidemiological studies, we analyzed the ability of human mammary epithelial cells to cope with mammogram-induced DNA damage. Our results show that an X-ray dose of 0.02 Gy, which is the standard dose received by the breast surface per two-view mammogram X-ray exploration, induces an increase in the DNA double-strand breaks number to in vitro aged–but not to young–human mammary epithelial cells. Our studies point to an ineffective DDR (DNA damage response) of aged cells due to both delayed and incomplete mobilization of repair proteins to DNA strand breaks. This inefficient response results in an important delay in double-strand break disappearance in cells of Population doublings (PD) advanced, causing an increased genetic instability. By setting up an automated and highly sensitive method of phosphorylated histone (γH2AX) foci scoring, an early step in DSB repair pathway, we determined the DDR efficiency of the Breast primary epithelial cells (BPECs) transduced with hTERT, obtained from several donors. The establishment of this method provided us with the insight that the delay in the DDR observed as the number of population doublings progressed was also relevant when comparing only the donor’s age. To establish this technique we took into account the importance of the cell cycle phase in the γH2AX foci counting since the phosphorylated histone staining pattern changes through the cycle. Once evaluated the kinetics of appearance and disappearance of foci of the γH2AX foci in both HMEC and BPECs we proved that the re-expression of hTERT on these cells did not avoid the DDR’s delay on the in vitro aged cells. These results drove us to perform an exhaustive review of the literature to explore what factors, in addition to telomeric shortening, are playing an important role in the relationship between aging and radiosensitivity. Among these, the oxidative stress that the aged cells suffer has a significant role, both as an agent that generates harmful breaks in DNA and in relation to corrosion that induces to other relevant cellular structures. On the other hand, there are several the age-related changes in the nuclear organization such as the restructuring of the heterochromatin, loss of functionality of the laminate or lack of integrity of the nuclear pores. In the review we tried to highlight the relationship between these changes in the nuclear organization and the deterioration of the DDR observed in several studies and in ours. The most important conclusion is that there is a multifactorial relationship between radiosensitivity and age. It seems clear that the ability of cells to cope with DNA damage is reduced with aging and such reduction could help to explain the increased carcinogenic risks of radiation exposure at older ages revealed by epidemiological studies. Challenged with an increase in life expectancy is ever more necessary to consider aging while establishing radiation protection policies.

Les motoneurones espinals requereixen factors neurotròfics per a la seva supervivència i diferenciació. L’efecte fisiològic dels factors neurotròfics és mediat per l’activació de diferents vies de senyalització i factors de transcripció entre els quals es troba la via NF-kB. S’ha relacionat la desregulació de l’activació d’aquesta via amb diferents patologies neuronals. S’ha proposat NF- kB com a diana terapèutica en diferents malalties neurodegeneratives. En el present estudi hem analitzat els mecanismes intracel·lulars involucrats en l’activació de la via NF-kB i la seva implicació en la supervivència de les motoneurones induïda pels factors neurotròfics. Els nostres resultats demostren l’habilitat dels factors neurotròfics de fosforil·lar el complex IKKs a través de l’activació de la via PI3K/Akt i d’induir la translocació nuclear de RelA. Per altra banda, s’ha demostrat que únicament l’activació de la via canónica d’NF-kB té un efecte regulador sobre la supervivència de les motoneurones. El bloqueig de la via canònica causa mort apoptòtica. Aquelles motoneurones que degeneren al inhibir la via es poden rescatar mitjançant la sobre-expressió de la proteïna Bcl-xL o bé inhibint la proteïna Bax. No obstant, els factors neurotròfics també activen la vía no canònica d’NF-kB tot hi que sense implicació en la supervivència. A les motoneurones, la inhibició de la via canònica comporta un augment de la proteïna pro-apoptótica Bim, la disminució de la proteïna Survival Motor Neuron (SMN) i del factor de transcripció CREB. La reducció dels nivells de proteïna SMN causa la malaltia neurodegenerativa hereditària Atròfia Muscular Espinal (AME), que afecta específicament a les motoneurones espinals. En el nostre laboratori hem desenvolupat un model in vitro d’AME. La reducció dels nivells d’SMN causa degeneració neurítica i mort de les motoneurones. Aquests dos processos es poden bloquejar amb la sobreexpressió de la proteïna Bcl-xL. En conclusió, el nostre treball demostra la implicació de la via NF-kB en la supervivència de les motoneurones i aporta nous avenços per a comprendre l’AME. / Las motoneuronas espinales requieren de los factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. El efecto fisiológico de los factores neurotróficos esta mediado por la activación de distintas vías de señalización y factores de transcripción entre los cuales está la vía NF-kB. La desregulación en la activación de esta vía se ha relacionado con distintas patologías neuronales. Se ha propuesto a NF-kB como una diana terapéutica en distintas enfermedades neurodegenerativas. En el presente estudio hemos analizado los mecanismos intracelulares involucrados en la activación de la vía NF-kB y su implicación en la supervivencia de las motoneuronas inducida por los factores neurotróficos. Nuestros resultados demuestran la habilidad de los factores neurotróficos de fosforilar el complejo IKKs a través de la activación de la vía PI3-K/Akt y de inducir la translocación nuclear de RelA. Por otro lado, se ha demostrado que únicamente la activación de la vía canónica de NF-kB tiene un efecto regulador sobre la supervivencia de las motoneuronas. El bloqueo de esta vía induce muerte celular apoptótica. Las motoneuronas que van a degenerar por la inhibición de la vía NF-kB, se pueden rescatar mediante la sobre-expresión de la proteína Bcl-xL o mediante la inhibición de la proteína Bax. Sin embargo, los factores neurotróficos también activan la vía no-canónica de NF-kB aunque sin implicación en la supervivencia. En las motoneuronas, la inhibición de la vía canónica conlleva el aumento de los niveles endógenos de la proteína pro-apoptótica Bim y la reducción de la proteína Survival Motor Neuron (SMN) y del factor de transcripción CREB. La reducción de los niveles de proteína SMN causa la enfermedad neurodegenerativa hereditaria Atrofia Muscular Espinal (AME), que afecta específicamente a las motoneuronas de la médula espinal. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo in vitro de AME. La disminución de los niveles de SMN causa la degeneración de las neuritas y la muerte de las motoneuronas. Estos dos procesos pueden ser bloqueados por sobre-expresión de la proteína Bcl-xL. En conclusión, nuestro trabajo demuestra la implicación de la vía NF-kB en la supervivencia de las motoneuronas y aporta nuevos avances para la comprensión de la AME. / The Spinal cord motoneurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation. The physiological effect of neurotrophic factors is mediated by activation of different signaling pathways and transcription factors including NF-kB. Deregulation in the activation of this pathway has been associated with different neural pathologies. NF-kB has been proposed as a therapeutic target in several neurodegenerative diseases. In this study we analyze the intracellular mechanisms involved in the activation of NF-kB pathway and its involvement in motor neuron survival induced by neurotrophic factors. Our results demonstrate the ability of neurotrophic factors to phosphorylate the IKKs complex through the PI3-K/Akt pathway activation and induce a nuclear translocation of RelA. On the other hand, it has been analysed the involvement of different forms of NF-kB activation pathway on motoneuron survival and the results demonstrate that only the canonical pathway has regulatory effects on the motoneuron survival. The blockade of this pathway induces apoptotic cell death. Motoneurons that will degenerate by inhibition of NF-kB, can be rescued by overexpression of Bcl-xL protein or by inhibiting Bax protein expression. However, neurotrophic factors also activate non-canonical pathway of NF-kB but this pathway does not modulate motoneuron survival. In motoneurons, inhibition of the canonical pathway leads to increased levels of the endogenous pro-apoptotic protein Bim and reduction of the Survival Motor Neuron Protein (SMN) and the transcription factor CREB. Reduced levels of SMN protein cause the hereditary neurodegenerative disease Spinal Muscular Atrophy (SMA), which specifically affects spinal cord motorneurons. In our laboratory, we developed an in vitro model of SMA. The decreased levels of SMN cause neurite degeneration and motorneuron death. These two processes can be blocked by overexpression of Bcl-xL protein. In conclusion, our study shows the involvement of NF-kB in the survival of motor neurons and provides new advances in the understanding of the SMA pathology.

Las neuronas tanto in vivo como in vitro requieren factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. En concreto, las motoneuronas(MNs) responden a diferentes factores neurotróficos, entre los que se encuentran la familia de ligandos del GDNF y la familia de las neurotrofinas. Estas células no sólo sobreviven en presencia de estos factores, sino que la propia actividad neuronal y por consiguiente la despolarización de membrana también promueve su supervivencia, incrementando los niveles de calcio intracelular ([Ca2+]i) y activando diferentes vías de señalización.En este trabajo se estudia el papel del calcio y la calmodulina (CaM) en la regulación de la vía de supervivencia PI3K/PKB, en un modelo de MNs deembrión de pollo tratadas con GDNF. Los resultados obtenidos demuestran que GDNF promueve incrementos moderados en la [Ca2+]i que pueden resultar en la activación de la CaM. El tratamiento con antagonistas de la CaM inhibe laactivación de la Pl3K y PKB in vitro, bloqueando la supervivencia inducida por GDNF. El mecanismo por el cual la CaM ejerce este efecto está pococaracterizado. Tanto la PI-3K como la PKB, proteína que actúa por debajo en la vía de señalización de la PI-3K, son importantes mediando la supervivencia por factores neurotróficos. De hecho, se ha demostrado que GDNF promueve lasupervivencia neuronal a través de la activación de esta vía. Experimentos de inmunoprecipitación demuestran una interacción in vitro entre la subunidad reguladora de la PI-3K y CaM. Esta interacción es independiente de factor neurotrófico, pero se bloquea con el tratamiento con quelantes de calcio como EGTA. De estos resultados se concluye que los cambios producidos en [Ca2+]i inducidos por GDNF, promueven la supervivencia neuronal a través de un mecanismo que implica una regulación directa de la PI-3K por la CaM.Como segundo objetivo de este estudio, analizamos el papel de la quinasa regulada por calcio/CaM la CaMKIV en la supervivencia neuronal. Tras el clonaje y la caracterización de la CaMKIV de pollo (gCaMKIV), demostramos que la forma constitutivamente activa de la gCaMKIV es capaz de fosforilar a PKB, lo que se traduce en la supervivencia de las MNs en ausencia de factoresneurotróficos. Por contra, el bloqueo de la expresión endógena de la gCaMKIV,utilizando RNAs de interferencia, reduce el porcentaje de supervivencia mediado por GDNF y por la despolarización de membrana. Experimentos deinmunoprecipitación han demostrado una interacción in vitro entre la subunidad p85 de la PI-3K y la CaMKIV.En conclusión, se describe por primera vez, como GDNF induce incrementos en [Ca2+]i, activando CaM, que se encuentra unida a la PI-3K. Además, CaMKIV se puede unir a CaM y juntas regular la vía PI-3K/PKB promoviendo la supervivencia. Estos resultados aportan parte de las claves moleculares que regulan la supervivencia de estas neuronas, pudiendo así aplicar estos conocimientos para la comprensión y las posibles estrategias terapeúticas relacionadas con las enfermedades donde hay una degeneración de las MNs. / Neurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation both in vivo and in vitro. In particular, motoneurons respond to a series of neurotrophic factors such as the family of the neurotrophins and the Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) Family Ligands (GFLs). Moderate increases of intracellular calcium concentration induced by either the activation of tropomyosin receptor kinase (Trk) receptor for neurotrophins or by neuronal activity, regulate neuronal survival.In the present report we wanted to establish the role of calcium and calmodulin in the activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-K) pathway by GDNF. Our results demonstrate that GDNF treatment promotes moderate increases of intracelullar calcium concentration by mobilizing this cation from internal stores, resulting in the activation of calmodulin.The effects of [Ca2+]i increase after membrane depolarization are mainly mediated by calmodulin (CaM). We show that CaM antagonists inhibit PI 3-kinase and PKB activation as well as motoneuron survival induced by GDNF. It has been reported that (PI 3-K) and its downstream target protein kinase B (PKB) play a central role in cell survival induced by neurotrophic factors; in fact,GDNF promotes neuronal survival through the activation of the PI 3-kinase/PKB pathway. We also demonstrate that endogenous calcium/CaM associates with the 85-kDa regulatory subunit of PI 3-kinase (p85). This interaction is neurotrophic factor-independent, but it can be abolished with calcium chelators like EGTA.The second part of this work is focused on the analysis of proteins activated by calcium. We wanted to analyze the role of calcium and calmodulinrelated kinase, CaMKIV in cultured motoneurons. This work allowed us to cloneand characterize the Gallus gallus CaMKIV (gCaMKIV). We further demonstrate that the active form of gCaMKIV is able to phosphorylate PKB in the absence of neurotrophic factors and this activation can be blocked by PI3-kinase inhibitors.In addition, the active form of gCaMKIV promotes motoneuron survival in the absence of neurotrophic factors. Moreover, reduction of endogenous levels of CaMKIV by RNA interference results in a decrease of motoneuron survivalinduced by GDNF. A physical interaction between CaMKIV and the PI3-kinase regulatory subunit has been demonstrated by pull-down experiments.In conclusion, this study demonstrates that GDNF is able to promote increases in intracellular calcium concentration that leads to the activation of calmodulin thus regulating PI3-kinase pathway through interaction with p85 subunit. Moreover, CaMKIV is able to interact with calmodulin proposing a suitable model of cooperative effects in the regulation of motoneuron survival pathways.Therefore, these results will contribute to the understanding of the molecular basis for the regulation of MNs survival, thus contributing to the knowledge for prevention of MNs associated neuropathologies.

La identificació dels mecanismes moleculars que regulen la supervivència i mort de les motoneurones representa una informació important per a la comprensió funcional i l'establiment de potencials dianes terapèutiques per a les malalties que cursen amb degeneració i mort d'aquestes neurones. Per aquest motiu hem dedicat aquest treball a:a) L'estudi dels mecanismes intracel·lulars dependents de calci que modulen la supervivència de les motoneurones durant el desenvolupament.Com a efecte inductor de supervivència hem analitzat la participació de la proteïna quinasa dependent de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneurones embrionàries de pollastre, i demostrem que la seva activació calci dependent indueix la fosforilació d'Akt i la supervivència d'aquestes neurones. Per altra banda, com a efecte inductor de mort demostrem que els increments excessius de la concentració del calci intracel·lular induïts per la despolarització de la membrana, són responsables de l'activació de la proteasa Calpaïna i la conseqüent degeneració de les motoneurones de ratolí. Proposem la inhibició de Calpaïna com a mecanisme neuroprotector.b) La generació d'un model in vitro per a l'estudi dels mecanismes patològics que causen la degeneració específica de les motoneurones en Atròfia Muscular Espinal.En aquesta segona part del treball, amb la finalitat de contribuir a la comprensió de la fisiopatologia d'aquesta malaltia hem desenvolupat un model in vitro utilitzant tècniques d'interferència d'RNA. Reduïm l'expressió de la proteïna Survival Motoneuron (SMN) en les motoneurones fins a nivells representatius de la forma severa de la malaltia. L'estudi morfològic i de viabilitat en aquestes cèl·lules ens facilitarà la identificació dels mecanismes moleculars implicats en la malaltia.Els resultats presentats en aquesta tesi impliquen l'activació de CaMKIV en la regulació de la supervivència de les motoneurones; proporcionen nous coneixements sobre les vies de regulació que en provoquen la seva degeneració (nivells de potassi elevats al medi extracel·lular i Calpaïna), i demostren alteracions d'aquestes neurones en un models d'Atròfia Muscular Espinal (degeneració neurítica i mort). / La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y muerte de las motoneuronas representa una información importante de conocimiento básico y para el establecimiento de potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades que cursan con degeneración y muerte de estas neuronas. Por este motivo hemos dedicado este trabajo al estudio de:a) Mecanismos intracelulares básicos dependientes de calcio que modulan la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo.Como efecto inductor de supervivencia hemos analizado la participación de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneuronas embrionarias de pollo, y demostramos que su activación calcio dependiente, induce la fosforilación de Akt y supervivencia de estas neuronas. Por otro lado, como a efecto inductor de muerte demostramos que incrementos de la concentración del calcio intracelular inducidos por la despolarización de la membrana, son responsables de la activación de la proteasa Calpaína y la degeneración de las motoneuronas de ratón. Nuestros resultados apoyan el uso de inhibidores de Calpaína como estrategia neuroprotectora.b) Mecanismos patológicos que causan la degeneración específica de las motoneuronas en Atrofia Muscular Espinal.En esta segunda parte del trabajo, con la finalidad de contribuir a la comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad hemos desarrollado un modelo in Vitro utilizando técnicas de interferencia de RNA. Reducimos la expresión de la proteína Survival Motoneuron (SMN) en las motoneuronas hasta niveles representativos de la forma severa de la enfermedad. El estudio morfológico y de viabilidad en estas células nos facilitará la identificación de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad.Los resultados que presentamos en esta tesis implican la activación de CaMKIV en la regulación de la supervivencia de las motoneuronas; proporcionan nuevos conocimientos sobre las vías de regulación que provocan su degeneración (niveles de potasio elevados al medio extracelular y Calpaína), así como alteraciones específicas de estas neuronas en modelos de Atrofia Muscular Espinal (degeneración neurítica y muerte). / Identification of molecular mechanisms that regulate motoneuron survival and death represent valuable basic knowledge to elucidate potential therapeutic targets for those diseases that imply motoneuron degeneration and death. For this reason in the present work we studied:a) Basic calcium-dependent intracellular mechanisms which modulate motoneuron survival during development.As a pro-survival effect we analysed the role of the calcium/calmodulin dependent protein kinase IV (CaMKIV) in cultured chicken motoneurons. Results demonstrated that CaMKIV activation induces Akt phosphorylation and motoneuron survival. On the other hand, as a prodegenerative effect we demonstrate that in mouse motoneurons depolarization induced excessive calcium influx activates the protease Calpain and causes motoneurons death. Our results suggest that Calpain inhibitors may induce neuroprotective effects.b) Intrinsic motoneuron pathological mechanisms underlying Spinal Muscular Atrophy.In this second part, with the aim to facilitate the understanding of the physiopathology of SMA we developed an in vitro model using RNA interference techniques. We reduce Survival Motoneuron (SMN) protein expression in motoneurons to representative levels from severe Spinal Muscular Atrophy mouse models. Morphologic and survival analysis of these cultured neurons may contribute to the identification of pathologic molecular mechanisms implicated in the disease.Reported results, obtained from the morphological and molecular analysis of primary motoneuron cultures, provide new knowledge on motoneuron development and survival regulating pathways (implication of CaMKIV activation in motoneuron survival regulation), about regulation pathways involved in motoneuron degeneration (high potassium extracellular levels and Calpain activation), as well as motoneuron alterations in a severe SMA culture model (neurite degeneration and death).

Una forma d’analitzar la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules normals és l’anàlisi de l’expressió dels llocs fràgils. Aquests són regions del genoma caracteritzats per la seva inestabilitat sota condicions d’estrès replicatiu. Sota aquestes condicions es poden induir alteracions en loci relacionats amb càncer. L’estudi d’inestabilitat es pot centrar en sang perifèrica, i en altres tipus de teixit, d’entre els quals la bufeta és un bon model donat l’elevada freqüència de recidives i la multifocalitat o presència de tumors sincrònics en aquest òrgan. Els objectius d’aquest treball són: a) estudiar l’expressió de llocs fràgils comuns en limfòcits de sang perifèrica d’una sèrie de pacients afectats de càncer de bufeta i comparar-la amb una sèrie de controls aparellats per edat i hàbit fumador; b) analitzar si les condicions d’estrès replicatiu sota les quals s’expressen els llocs fràgils indueixen alteracions dels loci 9p21 i CCND1 en pacients i comparar-ho amb controls; c) analitzar la presència d’aneuploïdies afectant als cromosomes 1, 7, 8, 9, 11 i 17 en el tumor i en la resta de l’uroteli vesical aparentment normal del mateix pacient. Els nostres resultats demostren que l’afidicolina indueix alteracions en limfòcits de sang perifèrica en forma de delecions i duplicacions en loci tals com 9p21 i CCND1 normalment alterats en cèl·lules tumorals. Aquestes alteracions no difereixen entre pacients i controls. De la mateixa manera, l’expressió de llocs fràgils no presenta diferències entre ambdós grups, i en general els dos fenòmens estudiats estarien relacionats amb la pèrdua d’integritat del genoma relacionada amb l’edat. En l’epiteli urotelial, l’anàlisi cromosòmica d’inestabilitat numèrica indica que la mucosa aparentment normal acumula alteracions en major o menor freqüència i que s’observa variabilitat entre pacients. Els nostres resultats permeten confirmar que la presència d’inestabilitat en cèl·lules normals i en individus aparentment sans és un fenomen més freqüent de l’esperat i que probablement està relacionat amb l’envelliment. / One way to analyse chromosomal instability in normal cells is the analysis of the expression of fragile sites. These are regions of the genome characterized by instability under conditions of replicative stress. Under these conditions, alterations in cancerrelated loci may be induced. The study of instability can focus on peripheral blood and other tissue types, among which the bladder is a good model given the high frequency of recurrences and the presence of multiple synchronous tumours in this organ. The aim of this work is: a) to study the expression of common fragile sites in peripheral blood lymphocytes of a series of patients with bladder cancer and controls matched by age and smoking habit; b) to analyse if the replicative stress also induce alterations in loci 9p21 and CCND1 in the same subjects; c) to analyse the presence of aneuploidies for chromosomes 1, 7, 8, 9, 11 and 17 in bladder tumour and the apparently normal urothelium of the same patient. Our results show that aphidicolin induces deletions and duplications in loci 9p21 and CCND1 in peripheral blood lymphocytes. These alterations did not differ between patients and controls. Similarly, the expression of fragile sites presents no differences between both groups, and generally both phenomena would be related with the loss of integrity of the genome associated with age. The urothelial epithelium analysis indicates that numerical chromosomal instability is present in apparently normal mucosa, where alterations accumulates in varying frequency, and shows variability between patients. In summary, our results confirm the presence of instability in normal cells and in apparently healthy individuals. This phenomenon is more common than expected and probably is related to aging.

El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioteràpia és la tolerància del teixit normal. Aquesta tolerància mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioteràpia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s’han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de càncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l’estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues línies cel·lulars limfoblastoides, una línia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d’expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues línies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d’intensitat d’immunofluorescència en la línia RS en comparació amb la línia RR. A més, el sistema microscòpic automàtic va ser la metodologia més ràpida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La línia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, així com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la línia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d’alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues línies 24 h després d’irradiar. La línia RS va mostrar una freqüència significativament major d’ICE en comparació amb la línia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la línia RS que en la línia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d’expressió gènica diferencial de les dues línies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la línia RR, la línia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d’irradiar. L’anàlisi funcional 24 hores després d’irradiar va mostrar que la línia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la línia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que les dues línies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de càncer després de la radioteràpia. / The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients.

L’ús de materials biocompatibles ha assolit una importància creixent en aplicacions ortopèdiques i quirúrgiques, degut a l’envelliment de la població. Els aliatges metàl·lics que s’empren actualment en medicina presenten propietats físiques i mecàniques diferents a les de l’os humà, incrementant la probabilitat de pèrdua de l’implant. Per aquesta raó, s’estan desenvolupant nous aliatges metàl·lics amb millors propietats. En aquest sentit, la present tesi té com objectiu l’anàlisi de la biocompatibilitat de nous aliatges pel seu ús en implants ortopèdics. En primer lloc, s’ha demostrat la biocompatibilitat del vidre metàl·lic massís TiZrCuPd en termes de citotoxicitat, i d’adhesió i de diferenciació d’osteoblasts. En segon lloc, s’ha avaluat l’efecte de dues modificacions de superfície, anodització electroquímica i modificació física, dels aliatges TiZrCuPd i Ti-6Al-4V sobre el comportament dels osteoblasts. En aquest cas, no hem observat cap efecte de la topografia en la proliferació, l’adhesió i la diferenciació. En tercer lloc, hem demostrat que els aliatges TiZrPdSi i TiZrPdSiNb són biocompatibles i afavoreixen l’adhesió, la proliferació i la diferenciació d’osteoblasts. Finalment, hem avaluat l’efecte electroestimulador de dos nous nanogeneradors piezoelèctrics, basats en ZnO, emprant dues línies cel·lulars implicades en la regeneració òssia (osteoblasts i macròfags). Els resultats observats indiquen que els nanogeneradors són biocompatibles i que la seva interacció amb les cèl·lules produeix un camp elèctric local que estimula la motilitat dels macròfags i l’augment de la concentració intracel·lular de Ca2+ en osteoblasts. Aquests nous materials intel·ligents presenten propietats força interessants pel seu ús en aplicacions biomèdiques. En conjunt, els resultats obtinguts en els nostres estudis contribueixen en el desenvolupament de materials per millorar la reparació i la regeneració òssia. / The use of biocompatible materials has attained an increasing importance for medical surgery and orthopaedics due to population aging. Metallic alloys currently used in bone implants have physical and mechanical properties different from those of the bone, which increases the probability of implant loosening. For this reason, new metallic alloys with better properties are being developed. In this regard, the present thesis aims to analyse the biocompatibility of new biomaterials for orthopaedic applications. First, we demonstrated the biocompatibility of TiZrCuPd bulk metallic glass in terms of cytotoxicity, and osteoblast adhesion and differentiation. Second, we assessed the effect of surface modification of TiZrCuPd and Ti-6Al-4V alloys by electrochemical anodization and physical modification on osteoblast behaviour. Differences in topography did not cause changes on osteoblasts adhesion, proliferation and differentiation. Third, we demonstrated that TiZrPdSi and TiZrPdSiNb alloys are also biocompatible and enhance osteoblasts adhesion, spreading, proliferation and differentiation. Fourth, we evaluated the electrostimulation effect of two new ZnO piezoelectric nanogenerators using two cell lines involved in bone regeneration (osteoblasts and macrophages). We observed that both nanogenerators are biocompatible and that their interaction with cells produces a local electric field that stimulate macrophages motility and the increase in intracellular Ca2+ concentration in osteoblasts. Thus, these new smart materials have interesting properties for their use in biomedical devices. Collectively, the results obtained in our studies contribute to the progress in the development of better materials for bone repair and regeneration.

En estudis previs realitzats en el nostre laboratori vam demostrar que la infusió de cèl·lules de medul·la òssia (MO) transduïdes amb un autoantigen (MOG40-55), dirigit a la via de presentació d'antígens per MHC de classe II, induïen tolerància immunològica en un model experimental d'esclerosi múltiple, la encefalomielitis autoimmune experimental (EAE), tant en un abordatge preventiu com terapèutic (Eixarch et al. 2009). Per altra banda, l'absència d'empelt de les cèl·lules que expressaven la MOG va permetre eliminar la mieloablació i ens va conduir a la hipòtesis de que l'efecte terapèutic observat no estava mediat per cèl·lules amb capacitat d'empeltar sinó més aviat per unes cèl·lules més madures que presentaven l'autoantigen de forma tolerogènica. Estudis posteriors van revelar que la majoria de les cèl·lules que es generaven en els cultius de transducció amb retrovirus de cèl·lules de MO eren d'origen mieloide i que, de fet, eren cèl·lules mieloide supressores (MDSCs, sigles en anglès) (Gomez et al.2014). Per tant, la primera part d'aquesta tesi es va iniciar amb el propòsit de caracteritzar millor aquestes MDSCs i de determinar si eren elles les responsables de la inducció de tolerància immunològica observada en la EAE a més d'estudiar els possibles mecanismes d'acció implicats. Amb aquesta finalitat es van transduïr cèl·lules de MO amb un vector retroviral que codificava per l'autoantigen (MOG40-55) o amb un vector control. Es van aïllar les MDSCs i es van administrar als ratolins set dies abans (braç preventiu) o 13-14 dies després (braç terapèutic) de la inducció de la EAE. Els resultats mostren que una única administració de MDSCs antigen-específiques va induir tolerància immunològica in vivo i que va prevenir i millorar els signes clínics de la EAE de manera antigen-específica. A més a més, els animals toleritzats presentaven una neuropatologia reduïda, proporcions de limfòcits activats reduïdes i proporcions de limfòcits B amb un fenotip regulador augmentades. D'altra banda, aquestes MDSCs generades ex vivo expressaven la molècula inhibitòria programmed death ligand 1 (PD-L1) i produïen espècies reactives d'oxigen, mecanismes associats amb la inhibició dels limfòcits T autoreactius i amb la inducció de tolerància immunològica. Després d'obtenir resultats prometedors amb les MDSCs antigen-específiques de ratolí, vam decidir donar un pas més i la segona part d'aquesta tesi està enfocada a desenvolupar mètodes eficients per generar MDSCs humanes a partir de progenitors hemopoètics per la seva potencial aplicació clínica. Es van cultivar progenitors CD34+ obtinguts de productes d'afèresis de donants sans durant 9, 14 i 20 dies en presència de diferents combinacions de citoquines bàsicament formades per SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF i IL-6. Els resultats mostren que les MDSCs es poden generar de manera eficient a partir de progenitors hemopoètics i que les seves proporcions augmentaven amb els dies de cultiu. A més, aquestes cèl·lules expressaven la molècula immunosupressora PD-L1, eren molt poc al·loreactives, suprimien la proliferació de cèl·lules T induïda per un estímul policlonal i reduïen els nivells de les citoquines proinflamatòries mentre que augmentaven el nivell de la citoquina immunomoduladora IL-10. Per aquests motius creiem que les MDSCs generades in vitro són una eina potencial pel tractament de malalties autoimmunes i per evitar la malaltia de l'empelt contra l'hoste després del trasplantament. / In previous studies conducted at our laboratory we demonstrated that infusion of bone marrow (BM) cells transduced with a self-antigen (MOG40-55), targeted to the MHC class II antigen presentation pathway, induced immunological tolerance in an experimental model of multiple sclerosis, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), both preventively and therapeutically (Eixarch et al. 2009). Moreover, the absence of engraftment of the MOG-expressing cells allowed to eliminate myeloablation and hypothesize that the therapeutic effect observed was not mediated by cells with engrafting potential but rather by a more mature cell type that expressed the self-antigen in a tolerogenic manner. Subsequent studies revealed that the majority of cells generated in standard retroviral transduction cultures of BM cells were of myeloid origin and that, indeed, were myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) (Gomez et al. 2014). Therefore, the first part of this thesis was initiated with the purpose of better characterizing these MDSCs generated in BM retroviral transduction cultures and determining whether these cells were responsible for the induction of the immunological tolerance observed in the EAE model as well as studying the potential mechanisms of action involved. To this end, BM cells were transduced either with a retroviral vector encoding for the self-antigen or with a control vector. Both BM cells and isolated MDSCs were infused to the animals seven days before (preventive arm) or 13-14 days after (therapeutic arm) EAE induction. Results showed that a single infusion of antigen-specific MDSCs induced immunological tolerance in vivo and was able to prevent and ameliorate established EAE in an antigen-specific manner. In addition, tolerized animals presented a decreased neuropathology, reduced proportions of activated T cells and increased proportions of B cells with a regulatory phenotype. Moreover, the ex vivo generated MDSCs expressed the inhibitory molecule programmed death ligand 1 (PD-L1) and produced reactive oxygen species, mechanisms associated with the inhibition of autoreactive T cells and with the induction of immunological tolerance. After obtaining these promising results with the murine antigen-specific MDSCs, we decided to move one step further and, therefore, the second part of this thesis was aimed at developing efficient methods to generate human MDSCs from hematopoietic progenitor cells for its potential clinical application. To this end, CD34+ progenitor cells from apheresis products of healthy donors were cultured for 9, 14 and 20 days in the presence of different cytokine combinations mainly consisting of SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF and IL-6. Results showed that MDSCs can be efficiently generated from hematopoietic progenitor cells and that their proportions significantly increased along with the days of the culture. Moreover, these cells expressed the immunosuppressive molecule PD-L1, had very little alloreactivity, suppressed polyclonal-induced T-cell proliferation and decreased the levels of proinflammatory cytokines while increasing the levels of the immunomodulatory cytokine IL-10. For these reasons, we believe that in vitro generated MDSCs constitute a potential tool for the treatment of autoimmune diseases and to prevent graft-versus-host disease (GVHD) in transplantation settings.

En 2002, el petrolero Prestige se hundió vertiendo una gran cantidad de fuel que poco después llegó a las costas gallegas. En las tareas de limpieza del fuel colaboraron un gran número de personas que se expusieron a los compuestos químicos potencialmente tóxicos y algunos, como el benceno, carcinógenos. En un estudio genotóxico realizado dos años después de la exposición al fuel, por nuestro grupo (Prestige I), se observó un incremento de alteraciones cromosómicas estructurales en los individuos expuestos. Las conclusiones de este estudio evidenciaron la importancia de realizar un estudio de seguimiento de los mismos individuos a más largo plazo (Prestige II), dada la asociación existente entre aumento de alteraciones cromosómicas y riesgo a desarrollar cáncer. El objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar si el efecto genotóxico detectado persiste transcurridos 4 años del estudio anterior. Para ello se han estudiado 105 pescadores gallegos expuestos (E) y no expuestos (NE) al fuel. Además, 9 individuos se han incluido en un grupo especial de cáncer. Se han llevado a cabo cultivos convencionales de linfocitos de 72h en medio RPMI-1640. En total se han analizado 11.651 metafases con tinción secuencial uniforme-bandas G y 3.130 cariotipos para la detección de lesiones cromosómicas y alteraciones cromosómicas estructurales, respectivamente. La frecuencia de lesiones cromosómicas observada es similar en individuos expuestos y no expuestos en ambos estudios (Prestige I y Prestige II), indicando que las lesiones cromosómicas no son un buen biomarcador para analizar el efecto del fuel, si este ya no está presente. Se ha detectado una frecuencia elevada de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos E, indicando que el efecto genotóxico detectado anteriormente aún persiste 4 años después y que las células de la médula ósea podrían haber sido afectadas por la exposición al fuel. Así mismo, la frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos no expuestos era mayor que la observada en el Prestige I, lo que hace pensar que dichos individuos han estado sometidos, durante estos años, a una exposición indirecta al fuel de menor intensidad. Los individuos diagnosticados de cáncer presentan una frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales similar a la observada en individuos expuestos al fuel en Prestige II. Estos datos muestran la necesidad de hacer un seguimiento de los individuos que estuvieron muy expuestos al fuel, con el fin de detectar el cáncer en etapas más tempranas. Los estudios de genotoxicidad del Prestige I y II son, hasta el momento, los únicos que han analizado la exposición aguda al fuel en un elevado número de individuos muy seleccionados, a medio y largo plazo (2 y 6 años después de la exposición). / In 2002 the oil tanker Prestige wrecked near the Spanish region of Galicia, in the northwestern Atlantic coast of Spain. A big quantity of oil was spilt and reached the nearby coast soon after. An important amount of people took part in the cleaning tasks of the fuel and were therefore exposed to potentially toxic chemicals, some of them being carcinogens, as it is the case of benzene. A genotoxic study, carried out by our group (Prestige I) 2 years after the exposure to the fuel, showed an increase in structural chromosome aberrations in the exposed individuals. The conclusions from that study revealed the importance of conducting a follow up study of the same individuals in a longer term period (Prestige II), due to the existing association between the increase of chromosome aberrations and the risk of developing cancer. The main objective of this doctoral thesis is to determine if the genotoxic effect detected in these individuals persist four years after the previous study, by analyzing 105 fishermen, exposed (E) and not exposed (NE) to the fuel. Furthermore, 9 individuals have been included in a special cancer group. Conventional culturing of 72-hour lymphocytes in RPMI-1640 medium was carried out. A total of 11.651 metaphases were analysed sequentially stained, uniform- G-bands, and 3.130 karyotypes in order to detect chromosome lesions (gaps and breaks) and structural chromosome aberrations respectively. The observed frequency of chromosome lesions is similar in both groups exposed and not exposed, in both studies (Prestige I and Prestige II), indicating that chromosome lesions are not a good biomarker to analyse the fuel effect, when the fuel is not longer present. An elevated amount of structural chromosome aberrations has been detected in exposed individuals, which indicates that the genotoxic effect previously observed still persists four years later, and that the cells of the bone marrow could have been affected due to the exposure to the fuel. Moreover, the frequency of structural chromosome aberrations in not exposed individuals has been greater than observed in Prestige I, which makes us believe that these individuals have undergone, during these years, a less intense and indirect exposure to the fuel. The individuals diagnosed with cancer present a frequency in structural chromosome aberrations similar to the observed in individuals exposed to the fuel in Prestige II. Such data proves the need for following up of the most exposed individuals, aiming to detect cancer in the initial stages. The genotoxic studies in Prestige I and II are, so far, the only studies that have analysed the acute exposure to the fuel in an important quantity of well chosen individuals, in a medium and long-term period (2 and 6 years after the exposure).