Le but de cette thèse est de construire une image couleur de haute qualité, contenant un faible niveau de bruit et d'aliasing, à partir d'une grande séquence (e.g. des centaines) d'images RAW prises avec un appareil photo grand public. C’est un problème complexe nécessitant d'effectuer à la volée du dématriçage, du débruitage et de la super-résolution. Les algorithmes existants produisent des images de haute qualité, mais le nombre d'images d'entrée est limité par des coûts de calcul et de mémoire importants. Dans cette thèse, nous proposons un algorithme de fusion d'images qui les traite séquentiellement de sorte que le coût mémoire ne dépend que de la taille de l'image de sortie. Après un pré-traitement, les images mosaïquées sont recalées en utilisant une méthode en deux étapes que nous introduisons. Ensuite, une image couleur est calculée par accumulation des données irrégulièrement échantillonnées en utilisant une régression à noyau classique. Enfin, le flou introduit est supprimé en appliquant l'inverse du filtre équivalent asymptotique correspondant (que nous introduisons). Nous évaluons la performance et la précision de chaque étape de notre algorithme sur des données synthétiques et réelles. Nous montrons que pour une grande séquence d'images, notre méthode augmente avec succès la résolution et le bruit résiduel diminue comme prévu. Nos résultats sont similaires à des méthodes plus lentes et plus gourmandes en mémoire. Comme la génération de données nécessite une méthode d'interpolation, nous étudions également les méthodes d'interpolation par polynôme trigonométrique et B-spline. Nous déduisons de cette étude de nouvelles méthodes d'interpolation affinées / The aim of this thesis is to build a high-quality color image, containing a low level of noise and aliasing, from a large sequence (e.g. hundreds or thousands) of RAW images taken with a consumer camera. This is a challenging issue requiring to perform on the fly demosaicking, denoising and super-resolution. Existing algorithms produce high-quality images but the number of input images is limited by severe computational and memory costs. In this thesis we propose an image fusion algorithm that processes the images sequentially so that the memory cost only depends on the size of the output image. After a preprocessing step, the mosaicked (or CFA) images are aligned in a common system of coordinates using a two-step registration method that we introduce. Then, a color image is computed by accumulation of the irregularly sampled data using classical kernel regression. Finally, the blur introduced is removed by applying the inverse of the corresponding asymptotic equivalent filter (that we introduce).We evaluate the performance and the accuracy of each step of our algorithm on synthetic and real data. We find that for a large sequence of RAW images, our method successfully performs super-resolution and the residual noise decreases as expected. We obtained results similar to those obtained by slower and memory greedy methods. As generating synthetic data requires an interpolation method, we also study in detail the trigonometric polynomial and B-spline interpolation methods. We derive from this study new fine-tuned interpolation methods

La relation entre le repliement du génome et les processus cellulaires majeurs, notamment la transcription, la réparation de l’ADN et la réplication est une question biologique centrale. De nouvelles méthodes de la génomique ont révélé un niveau inconnu de l’architecture tridimensionnelle de la chromatine. A l’échelle en dessous de la mégabase, certaines séquences génomiques se trouvent préférentiellement à proximité les unes des autres formant ainsi des domaines topologiques associés (TAD). Les gènes situés dans le même TAD ont des propriétés épigénétiques similaires, et leur expression au cours de la différentiation semble corrélée, ce qui suggère un lien fort entre la structure de la chromatine et la transcription. Les TADs sont à leur tour séparés par des régions avec peu de contacts, appelées frontières, qui sont généralement occupées par des protéines dites isolatrices. Les déterminants de cette organisation chromatinienne particulière et ses implications fonctionnelles sont largement méconnus. Selon une hypothèse récente, les TADs seraient formés par des contacts entre les séquences des frontières, stabilisés par la formation de boucles via les protéines isolatrices. Les travaux présentés ici ont pour but d’étudier le rôle des protéines isolatrices dans le mécanisme de formation des TADs chez la drosophile. La microscopie super-résolue a été implémentée et une série de développements ont été réalisés en microscopie à illumination structurée (SIM) et la microscopie à localisation de molécules uniques (SMLM), avec une attention particulière sur le marquage fluorescent. Ces développements ont directement été appliqués à l’étude de l’organisation nucléaire de la protéine associée aux éléments frontières (BEAF), une des 11 protéines isolatrices identifiées à ce jour chez la drosophile. Le fort enrichissement aux frontières des TADs, ainsi que son activité dans la formation de boucles d’ADN font de BEAF un candidat intéressant pour tester l’hypothèse de regroupement de frontières comme mécanisme général de repliement de la chromatine. La technique SMLM multi-couleurs a systématiquement localisé BEAF à la périphérie des larges domaines portant la marque épigénétique H3K27me3. L’analyse quantitative des images SMLM a révélé que BEAF forme des centaines de foyers d’une taille de 45 nm, composés en moyenne de 5 molécules, ce qui est en désaccord avec la présence de boucles de chromatine à large échelle. Afin de tester le regroupement de gènes directement au niveau de l’ADN, des frontières ont été marquées par des oligonucléotides fluorescents. Le nombre de foyers détectés par SIM s’est à nouveau révélé incompatible avec le modèle de contacts entre les frontières tout le long du génome. Par ailleurs, les distances entre paires de frontières au niveau de deux régions génomiques ont montré <5% de contacts. Ensemble, ces résultats sont en désaccord avec l’établissement d’interactions entre barrières chez la drosophile. Enfin, ces travaux de thèse ont contribué au développement méthodologique de la microscopie super-résolue, ce qui a permis d’apporter des preuves expérimentales invalidant le modèle de regroupement des frontières comme mécanisme général du repliement chromatinien. / The interplay between genome folding and key cellular functions such as transcription, DNA repair and replication is a fundamental question in chromatin biology. Recent genome-wide developments unveiled a new level of three-dimensional chromatin architecture. At the sub-megabase scale, some genome sequences are preferentially found in proximity with one another forming Topologically Associating Domains (TADs). Genes located within the same TAD display common epigenetic properties and tend to have coordinated dynamics of expression during differentiation, suggesting a strong link between chromatin structure and transcription. TADs are in turn separated by regions of low contact, termed TAD borders, which are generally occupied by factors called chromatin insulators. What are the determinants of this particular type of chromatin organization and what are the functional implications is still largely unknown. In an emerging hypothesis, TADs could be formed through contacts between TAD border sequences stabilized by the looping activity of insulator proteins. This thesis investigates the roles of insulator proteins in the TAD formation mechanism using Drosophila melanogaster as model system. Superresolution imaging was implemented and a series of developments were performed in Structured Illumination Microscopy (SIM) and Single-molecule Localization Microscopy (SMLM), with particular attention on fluorescent labeling for single-molecule detection. These developments were directly applied to study the nuclear organization of the Boundary Element Associated Factor (BEAF), one of the 11 insulator proteins discovered to date in Drosophila. The strong enrichment on TAD borders and its demonstrated looping activity make BEAF a potent candidate to test for the clustering of TAD borders as a general mechanism of chromatin folding. Multicolor SMLM systematically located BEAF foci at the periphery of large H3K27me3 chromatin domains. Quantitative analysis of SMLM images indicated BEAF forms hundreds of 45 nm foci, containing a mean of 5 molecules, which argues against a large-scale looping of BEAF-bound chromatin. To directly probe for gene clustering at the DNA level, TAD borders were labeled using fluorescent oligonucleotide probes. The number of foci detected by SIM was once more incompatible with a model of chromosome-wide contacting of multiple TAD borders. Furthermore, TAD border pairs distances were measured in two genomic regions, resulting in <5% of paired contacts among the measured barriers. Taken together, these results are inconsistent with constitutive interactions between consecutive or non-consecutive barriers in Drosophila.In conclusion, this study contributed to the methodological development of super-resolution microscopy which was applied to provide experimental evidence invalidating the TAD border clustering model as a general mechanism of chromatin folding.

Un membre de la famille des tétraspanines, CD82, est une protéine transmembranaire et l'un des rares suppresseurs de métastase identifié jusqu'à présent. Cependant, le mécanisme de suppression de métastase induite par CD82 reste mal compris. Les tétraspanines, y compris CD82, ont la propriété unique de créer un réseau d'interactions protéines-protéines à la membrane plasmique, appelé « tetraspanin web ». Dans ce réseau, CD82 est connu pour interagir avec d’autres tétraspanines, y compris CD9, CD81 et CD151, en plus d’autres protéines membranaires telles que les intégrines, les récepteurs de facteurs de croissance et les protéines de type immunoglobuline. De plus, des travaux antérieurs ont identifié que l'interaction de CD82 avec l’EGFR, d'autres tétraspanines et les intégrines dépend de l'expression des gangliosides au sein de la membrane plasmique.À ce jour, les études dans ce domaine ont utilisé des techniques d'ensemble qui ne peuvent pas tenir compte de la dynamique et de la stochasticité de la membrane, alors qu'il est maintenant bien établi que l'organisation spatio-temporelle de ses composants est cruciale pour certaines fonctions cellulaires.Ainsi, lors de ma thèse de doctorat, j'ai cherché à étudier à la fois la dynamique et la compartimentation de CD82 et de ses partenaires à la membrane plasmique des cellules épithéliales mammaires HB2. Pour ce faire, la technique de pistage en molécule unique basée sur l’utilisation d’un microscope TIRF a été utilisée afin d’obtenir des informations directes à l'échelle nanométrique sur la dynamique de protéines individuelles dans les cellules vivantes. Nos expériences en pistage de molécule unique ont démontré que l'expression de CD82 augmentait la dynamique CD81 à la membrane plasmique des cellules HB2 et modifiait ses interactions au sein du tetraspanin web. En revanche, les dynamiques de CD9 et de l’intégrine α3 n'ont pas été modifiées par l'expression de CD82. De plus, en modifiant enzymatiquement l'expression des gangliosides, nous avons montré que ces lipides sont impliqués à la fois dans la dynamique et la compartimentation des tétraspanines à la membrane plasmique. En effet, la déplétion en gangliosides entraine une augmentation de la dynamique de CD82, CD81 et de l’intégrine α3 ainsi qu'une redistribution des tétraspanines à la membrane plasmique. Nous avons également étudié la migration en 2D des cellules HB2 et montré que CD82 et les gangliosides modifiaient de façon différentielle la migration des cellules HB2.L’ensemble de nos résultats démontrent que CD82 et les gangliosides modulent de manière différente la dynamique et la compartimentation des tétraspanines et de leurs partenaires à la membrane plasmique des cellules HB2. Enfin, ce travail suggère que l'activité de CD82 en tant que suppresseur de métastase pourrait être en partie liée à sa capacité, en coopération avec les gangliosides, à moduler l'organisation spatio-temporelle de ses partenaires au sein du tetraspanin web. / A member of the family of tetraspanins, CD82, is a transmembrane protein and one of the rare metastasis suppressors identified so far. However, the mechanism of CD82-induced metastasis suppression remains not fully revealed. Tetraspanins, including CD82, have the unique property to create a network of protein-protein interactions within the plasma membrane, called tetraspanin web. Within this network, tetraspanins interact with each other (eg. CD82 with CD9, CD81 and CD151) as well as with other proteins, such as: integrins, growth factor receptors and immunoglobulin-like proteins. Additionally previous work has identified that the interaction of CD82 with EGFR, other tetraspanins and integrins depends on the expression of gangliosides at the plasma membrane.To date, studies in this field have employed ensemble-averaging techniques which are unable to account for membrane dynamics and stochasticity. Nevertheless, it is now well established that the spatio-temporal organization of its components is crucial for cellular functions.Thus, during my PhD thesis I aimed to study both the dynamics and partitioning of CD82 and its partners at the plasma membrane of HB2 mammary cells. To achieve this aim, a TIRF-based Single Molecule Tracking (SMT) approach was employed to provide direct nanoscale insights by observing individual proteins in living cells. Our SMT experiments demonstrated that CD82 overexpression increased CD81 dynamics at the plasma membrane of HB2 cells and modified its interaction within the tetraspanin web. In contrast, CD9 and α3 integrin dynamics were not modified by CD82 expression. Moreover, by enzymatically tuning gangliosides expression, we showed that these lipids are involved in both dynamics and partitioning of tetraspanins at the plasma membrane. Indeed, gangliosides depletion resulted in an increase in CD82, CD81 and α3 integrin dynamics as well as a redistribution of tetraspanins at the plasma membrane. We also investigated the 2D migration of HB2 cells showing that CD82 and gangliosides differentially altered the cellular migration of HB2 cells.Taken together, our results demonstrate that both CD82 and gangliosides differentially modulate the dynamics and partitioning of tetraspanins and their partners at the plasma membrane of HB2 cells. Finally, this work suggests that CD82 activity as metastasis suppressor could be in part linked to its ability, in cooperation with gangliosides, to modulate the spatio-temporal organization of its partners within the tetraspanin web.

En microscopie, savoir focaliser la lumière à l’échelle micrométrique est déterminant. Dans les tissus biologiques néanmoins, les inhomogénéités du milieu diffusent la lumière, empêchant toute focalisation au-delà d’une profondeur de l’ordre du millimètre. Des techniques de façonnage de front d’onde ont été développées afin de pré-compenser la distorsion du faisceau lumineux induite par la propagation à travers un milieu diffusant. Pour parvenir à focaliser la lumière à l’intérieur même du milieu diffusant, l’enjeu est de mesurer l’intensité lumineuse en profondeur de manière non invasive. Nous proposons d’utiliser l’effet photoacoustique pour sonder cette intensité. Une structure optiquement absorbante éclairée par une impulsion lumineuse émet en effet un signal ultrasonore, dont l’amplitude est proportionnelle à l’intensité lumineuse. Ces ultrasons se propagent de façon quasi-balistique dans les tissus mous et peuvent donc être détectés à l’aide d’un transducteur acoustique externe. Cette mesure permet donc de déterminer l’intensité lumineuse éclairant l’absorbeur. Nous avons montré qu’il était possible d’utiliser l'imagerie photoacoustique pour mesurer la matrice de transmission d’un échantillon diffusant. Cette caractérisation nous permet de focaliser la lumière sur des structures absorbantes et de sonder des propriétés mésoscopiques du milieu diffusant. Nous avons montré que la large bande spectrale des signaux photoacoustiques permet d’améliorer la focalisation. Enfin, nous avons montré que l’utilisation d’une source de lumière cohérente permet de pallier certains artefacts de l’imagerie photoacoustique, ainsi que de franchir la limite de résolution acoustique. / Light focusing is a crucial requirement for high resolution optical imaging. In biological tissue though, refractive index inhomogeneities scatter light, preventing any focusing beyond one millimeter. Wavefront shaping techniques have been recently developed to partially compensate for light scattering after propagation through a scattering medium. These techniques require a measurement of the light intensity at the target point. These techniques hold much promise for performing wavefront correction in order to focus light deep inside scattering media. This would require a non-invasive measure of the light intensity at depth. In this PhD study, we propose to use the photoacoustic effect for such task. An optically absorbing structure under pulsed illumination indeed generates ultrasonic waves, whose amplitude is proportional to the absorbed light intensity. These ultrasounds mostly propagate in a ballistic way, and can therefore be detected with an external transducer. We have shown that photoacoustic imaging could be used to measure the transmission matrix of a scattering sample, enabling to focus light on absorbing structures as well as to retrieve mesoscopic properties of the medium. We have shown that the broadband spectral content of the photoacoustic signals can be harnessed to improve the focusing performances. Finally, we demonstrated that coherent illumination could be used to remove fundamentals artefacts, as well as to break the acoustic resolution limit of conventional deep tissue photoacoustic imaging.

Cette étude a pour cadre l’analyse d’images dans un contexte multi-échelles, une attention particulière étant portée sur les images fluides dans un contexte turbulent. Nous traitons en premier lieu le problème de l’estimation de mouvement. Dans un contexte multi-échelles, on néglige bien souvent dans un premier temps la contribution des fines échelles du problème. Nous proposons, pour pallier ce problème, plusieurs termes d’attache aux données dérivant de l’OFCE. Ceux-ci permettent, à chaque niveau d’échelle, la prise en compte de ces composantes fines échelles. Les performances de ces termes sont expérimentalement démontrées sur des images générales et fluides. Nous abordons en second lieu le problème de super-résolution d’images de scalaires passifs : nous souhaitons reconstruire, de manière explicite, certains détails manquants au sein d’images basse résolution données. Pour cela, nous utilisons plusieurs modèles issus de la simulation des grandes échelles ainsi que des méthodes d’assimilation de données permettant d’assurer une certaine cohérence temporelle de la solution. Les approches présentées sont expérimentalement étudiées sur différentes séquences d’images. Enfin, nous proposons une méthode d’estimation multi-résolution permettant de combiner de manière simultanée les informations issues des différents niveaux de résolution. / This thesis is concerned with image analysis within a multi-scale framework. Specific attention is given to fluid images in the presence of turbulence. In a first part, we adress the problem of multi-scale motion estimation from image sequences. Starting from OFCE equation, we derive several image data terms allowing to take into account, while estimating the solution coarse scales, the contribution of the finer scales components usually neglected in classic approaches. The performances of the resulting estimators is demonstrated on both general and fluid images. The second step of this study is concerned with the problem of passive scalar images super- resolution : starting from low resolution input images, we aim at recovering some of the missing high frequencies. We proposed several methods inspired by the LES framework, as well as data assimilation techniques, in order to ensure the solution consistency over time. Such approaches are experimented and compared over various image sequences. Finally, we propose a multi-resolution estimation method simultaneously combining informations from different grid levels.

L'arterial spin labelling (ASL) est une technique d'imagerie par résonance magnétique de la perfusion cérébrale. Les travaux présentés dans cette thèse ont d'abord consisté à standardiser les acquisitions ASL dans le contexte d'études de neuro-imagerie multicentriques. Un processus de contrôle de la qualité des images a par la suite été proposé. Les travaux se sont ensuite orientés vers le post-traitement de données ASL, en évaluant la capacité d'algorithmes existants à y corriger les distorsions. Des méthodes de super-résolution adaptées aux acquisitions ASL mono et multi-TI ont finalement été proposées et validées sur des données simulées, de sujets sains, ou de patients imagés pour suspicion de tumeurs cérébrales. / Arterial spin labelling (ASL) is a brain perfusion magnetic resonance imaging technique. The objective of this thesis was first to standardize ASL acquisitions in the context of multicenter neuroimaging studies. A quality control procedure has then been proposed. The capacity of existing algorithms to correct for distortions in ASL images has then been evaluated. Super-resolution methods, developed and adapted to single and multi-TI ASL data in the context of this thesis, are then described, and validated on simulated data, images acquired on healthy subjects, and on patients imaged for brain tumors.

Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus nombreux et les premières cellules à arriver au site de l’infection où elles internalisent les pathogènes par phagocytose. Dès le début du processus, la NADPH oxydase s’assemble au phagosome où elle permet la production de formes réactives de l’oxygène contribuant ainsi à la destruction du pathogène. La sous-unité catalytique membranaire de la NADPH oxydase, Nox2, est donc présente à la coupe phagocytaire puis au phagosome. Le dessein de cette étude était de déterminer quelles sont les sources subcellulaires de la protéine Nox2, de savoir si la protéine s’accumule au phagosome et le cas échéant selon quelle cinétique. Dans le but de comprendre la dynamique de la protéine Nox2, la protéine d’échafaudage IQGAP1 qui est associée au cytosquelette a également été étudiée. Enfin l’étude de l’organisation spatiale de la protéine Nox2 à la synapse phagocytaire a également été abordé.En utilisant des cellules neutrophil-like (PLB-985) ainsi que des neutrophiles humains, notre étude a montré par immunofluorescence la présence de la protéine Nox2 dans des endosomes de recyclage ou dans des endosomes précoces. Lors de la phagocytose ils avoisinent le phagosome suggérant leur implication dans l’apport de la protéine Nox2 à la membrane de ce dernier. L’utilisation de cellules PLB-985 pour lesquelles l’expression de Nox2 a été supprimée puis réintroduite avec un transgène codant pour la protéine GFP-Nox2 montre que la sous-unité Nox2 s’accumule au phagosome pendant les vingt minutes suivant sa fermeture. Dans notre étude, la protéine IQGAP1 ne semble pas avoir d’effet sur la phagocytose ou sur la production de FRO par la NADPH oxydase. Enfin, grâce à une technique de microscopie super-résolution (le dSTORM) l’évolution du pattern de Nox2 dans la membrane a été évalué au cours du temps en phagocytose frustrée. En dix minutes, le nombre de clusters de protéine Nox2 augmente mais leur taille reste inchangée. / Neutrophils are the most numerous leukocytes and the first cells to arrive at the site of infection where they internalize pathogens by phagocytosis. From the beginning of the process, the NADPH oxidase is assembled at the phagosome, where it allows the production of reactive oxygen species (ROS), thus contributing to the destruction of the pathogen. The membrane bound catalytic subunit of the NADPH oxidase, Nox2, is therefore recruited at the phagocytic cup and then at the phagosome. The purpose of this study was to determine, which are the subcellular sources of the Nox2 protein, whether the protein accumulates at the phagosome and if so, according to which kinetics. In order to modify the dynamics of the Nox2 protein, the scaffold protein IQGAP1 that is associated with the cytoskeleton was also studied. Finally, the spatial organization of the Nox2 protein in the phagocytic synapse was also investigated.Using neutrophil-like cells (PLB-985) as well as human neutrophils, our study showed by immunofluorescence the presence of the Nox2 protein in recycled or early endosomes. During phagocytosis, they are close to the phagosome, suggesting their involvement in the contribution of the Nox2 protein to the phagosome membrane. The use of PLB-985 for which Nox2 expression has been suppressed and then reintroduced with a transgene encoding the GFP-Nox2 protein shows that the Nox2 subunit accumulates at the phagosome during the first twenty minutes after its closure. In our study, the protein IQGAP1 does not appear to have any effect on phagocytosis or on the production of ROS by NADPH oxidase. Finally, using super resolution microscopy (dSTORM) the evolution of the Nox2 pattern in the membrane has been evaluated over time in frustrated phagocytosis. Within ten minutes, the number of Nox2 protein clusters increases but their size remains unchanged.

Ce travail de thèse propose d’étudier les propriétés photophysiques de systèmes moléculaires à la fois photochromes et fluorescents. Sous l’effet de la lumière, ces molécules peuvent subir une désexcitation radiative, non radiative ou une photo-isomérisation. Dans la première partie de ce travail, la compétition entre ces différentes voies a été étudiée en détail grâce à deux photochromes proches sur le plan structurel et présentant une émission de fluorescence de couleur différente pour chaque forme du photochrome. Les efficacités relatives et les mécanismes de désexcitation ont été étudiés à l’échelle macroscopique. Cette comparaison a été accompagnée d’une étude sous microscope pour laquelle des nano-bâtonnets d’or ont été intégrés au système photochrome-fluorescent de manière à étudier l’influence d’un champ plasmon de surface localisé sur les différents phénomènes de désexcitation à une échelle proche de celle de la nanoparticule individuelle. Une deuxième partie de ce travail consiste en la préparation et l’étude des propriétés photophysiques de nanoparticules organiques constituées de dyades fluorescentes et photochromes. La fluorescence de ce type de nano-objets peut être efficacement contrôlée par la lumière : la conversion de quelques unités photochromes peut permettre, par transfert d’énergie intermoléculaire, d’éteindre la totalité de la fluorescence d’une nanoparticule. L’observation de cet effet pour des nanoparticules individuelles a été mise en application pour le développement d’une méthode de microscopie optique super-résolution. / The main purpose of this PhD work is the study of fluorescent and photochromic molecular systems. Under light illumination, such molecules may undergo radiative and non-radiative deactivation or photoisomerization. In the first part of this work, this competition has been investigated for structurally related photochromic compounds with different fluorescence colors corresponding to both isomers. Efficiency and mechanisms of the deactivation pathways were unraveled at the macroscopic scale. This competition was further studied under microscope with gold nanorods included in the sample, in order to study the effect of localized surface plasmon resonance on the different deactivation processes.The second part of this work consists in the preparation and the photophysical study of organic nanoparticles composed of fluorescent-photochromic dyads. Fluorescence of such nano-objects can be efficiently driven by light : the switching of a few photochromic units is enough to turn off the entire fluorescence of a nanoparticle by intermolecular energy transfer. Observation of this effect at the level of individual nanoparticles allowed the developement of a super-resolution method for optical microscopy.

La mesure de la forme 3D du visage est une problématique qui attire de plus en plus de chercheurs et qui trouve son application dans des domaines divers tels que la biométrie, l'animation et la chirurgie faciale. Les solutions actuelles sont souvent basées sur des systèmes projecteur/caméra et utilisent de la lumière structurée pour compenser l'insuffisance de la texture faciale. L'information 3D est ensuite calculée en décodant la distorsion des patrons projetés sur le visage. Une des techniques les plus utilisées de la lumière structurée est la codification sinusoïdale par décalage de phase qui permet une numérisation 3D de résolution pixélique. Cette technique exige une étape de déroulement de phase, sensible à l'éclairage ambiant surtout quand le nombre de patrons projetés est limité. En plus, la projection de plusieurs patrons impacte le délai de numérisation et peut générer des artefacts surtout pour la capture d'un visage en mouvement. Une alternative aux approches projecteur-caméra consiste à estimer l'information 3D par appariement stéréo suivi par une triangulation optique. Cependant, le modèle calculé par cette technique est généralement non-dense et manque de précision. Des travaux récents proposent la super-résolution pour densifier et débruiter les images de profondeur. La super-résolution a été particulièrement proposée pour les caméras 3D TOF (Time-Of-Flight) qui fournissent des scans 3D très bruités. Ce travail de thèse propose une solution de numérisation 3D à faible coût avec un schéma de super-résolution spatio-temporelle. Elle utilise un système multi-caméra étalonné assisté par une source de projection non-étalonnée. Elle est particulièrement adaptée à la reconstruction 3D de visages, i.e. rapide et mobile. La solution proposée est une approche hybride qui associe la stéréovision et la codification sinusoïdale par décalage de phase, et qui non seulement profite de leurs avantages mais qui surmonte leurs faiblesses. Le schéma de la super-résolution proposé permet de corriger l'information 3D, de compléter la vue scannée du visage en traitant son aspect déformable.