Lorsqu’une femme est à risque d’accoucher prématurément, des glucocorticoïdes lui seront administrés afin d’accélérer la maturation pulmonaire du bébé. Après la naissance, différents protocoles peuvent être mis en place pour aider l’enfant à respirer dont l’administration du surfactant et la ventilation. Les glucocorticoïdes ont un effet positif sur la maturation pulmonaire. Par contre, ils nuisent au processus de la septation après la naissance. Les glucocorticoïdes retrouvés dans le poumon en développement peuvent provenir de deux sources, soit de la voie classique de la synthèse des glucocorticoïdes par les surrénales, soit des gènes exprimés dans le poumon. Les sites d’expression des gènes codant pour les enzymes de la synthèse des glucocorticoïdes dans le poumon sont inconnus ainsi que le gène de la 20α-hydroxystéroïde déshydrogénase (20α-HSD). Cette dernière inactive le substrat et le produit de la 21-hydroxylase. Des poumons de fœtus de souris au jour de gestation 15,5, 17,5 et 19,5 ainsi que de souriceaux âgés de 0, 5 et 15 jours ont été utilisés pour des hybridations in situ. Cette étude a montré qu’avant la naissance, l’ARNm de la 21-hydroxylase est situé au niveau des cellules épithéliales distales alors que l’ARNm de la 20α-HSD se retrouve plutôt au niveau des capillaires. Les gènes de la 21-hydroxylase et de la 20α-HSD sont exprimés dans les cellules épithéliales proximales ainsi que dans les cellules endothéliales de veines dans la période entourant la naissance. À la fin du stade sacculaire et pendant le stade alvéolaire, le gène de la 21-hydroxylase est exprimé seulement dans les septa et les parois minces tout comme le gène de la 20α-HSD sauf dans le stade alvéolaire où il n’y avait pas de signal significatif. Ainsi, ces résultats suggèrent que la 20α-HSD pourrait participer au contrôle du niveau d’activité de la 21-hydroxylase en modulant la disponibilité de son substrat. / For many years, to reduce the risk of respiratory distress in newborns, antenatal glucocorticoids are administered to the mother about to deliver prematurely to accelerate fetal lung maturation. At birth, surfactant therapy can be used with several assisted ventilation strategies according to the morbidity of the neonate. Postnatal administration of glucocorticoids to the neonate is not recommended as they interfere with organ systems including the lung development process named septation. Previous studies performed in the Dr Tremblay’s laboratory have shown in the whole lung of the mouse: 1) the capability of the fetal lung to express several steroidogenic enzyme genes involved in glucocorticoid synthesis and; 2) the presence of a steroid-metabolizing activity compatible with the regulation of the substrate levels. The major enzymes involved in these processes are the 21-hydroxylase and the 20α-hydroxysteroid dehydrogenase, which are respectively encoded by Cyp21a1 and Akr1c18. The objective of my study was to find the sites of expression for these two genes. To do so, mouse fetal lungs isolated on gestation days 15.5, 17.5, and 19.5, and on postnatal days 0, 5, and 15 days were used for in situ hybridization with 21-hydroxylase and 20α-HSD mRNAs. My results indicate that before birth, 21-hydroxylase mRNA is found in epithelial distal cells whereas the 20α-HSD gene is primarily expressed in capillaries. Around birth, 21-hydroxylase mRNA are associated with the proximal epithelium and endothelial cells of several veins. From the late saccular stage up to the half of the alveolar period, 21-hydroxylase mRNA is only associated with thin walls and septae. The situation was the same for 20α-HSD mRNA except for the alveolar stage during which no signal was detected. These results indicate that the expression profile of these two genes is compatible with the modulation of 21-hydroxylase substrates by the 20α-HSD.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le cortex surrénalien produit des hormones stéroïdes, principalement le cortisol, l’aldostérone et des androgènes. Le cortex surrénalien peut être le siège de tumeurs –adénomes ou cancers-, hyperplasies et dysplasies. Ces lésions sont dans leur grande majorité bénignes. Elles peuvent être associés à une hypersécrétion d’hormone stéroïde, le plus souvent de cortisol (syndrome de Cushing) ou d’aldostérone. Il existe aussi des tumeurs non sécrétantes. Si des classifications moléculaires ont été établies pour les carcinomes, à ce jour il n’existe pas de classification pangénomique des tumeurs bénignes corticosurrénaliennes, qui pourrait renseigner sur les mécanismes de sécrétion autonome et de prolifération de ces lésions. Enfin le déterminisme génétique des dysplasies et hyperplasies n’est que partiellement connu. Au cours de ma thèse, j’ai pu analyser un jeu de données « omics » complet des lésions bénignes corticosurrénaliennes pour plus d’une centaine d’échantillons, incluant du séquençage haut-débit (exome/ciblé pour les mutations, RNA-seq pour l’analyse des microARNs), des puces transcriptome et méthylome, et des puces SNP pour la recherche d’altérations chromosomiques. J’ai pu identifier une classification moléculaire pangénomique relativement convergente entre les différentes « omics », qui concorde avec les types tumoraux et sécrétoires, mais identifie également des sous-groupes nouveaux au sein de ces lésions. Il ressort notamment que les mutations dans ces lésions sont des déterminants essentiels de la classification moléculaire. Ainsi sont regroupées les lésions selon la voie de signalisation ou le gène altéré, notamment la voie PKA/AMPc pour les lésions produisant du cortisol, la voie Wnt/beta-caténine pour les adénomes ne sécrétant pas ou peu de cortisol, et ARMC5 pour un sous-groupe d’hyperplasies macronodulaires. Ces groupes très distincts contiennent également des lésions sans mutation identifiée, avec vraisemblablement des mécanismes alternatifs d’altération de ces voies de signalisation. Dans le groupe des hyperplasies macronodulaires mutées ARMC5, la comparaison avec l’ensemble des autres lésions bénignes fait ressortir une signature d’expression ovarienne forte, marquée par l’expression de FOXL2 et de ses cibles CYP19A1 et PTHLH. Cette marque de différentiation spécifiquement gonadique au sein de la surrénale fait discuter une anomalie de développement. Cette analyse génomique intégrée identifie également des altérations épigénétiques de la stéroïdogenèse. Notamment les tumeurs sécrétant beaucoup de cortisol sont globalement hyperméthylées dans leurs îlots CpG. Par ailleurs l’hyperméthylation de CYP21A2 est vraisemblablement un mécanisme de déficits en 21-hydroxylase intratumoral. Des signatures de miRNA semblent également avoir un impact sur la stéroïdogenèse. Au cours de ma thèse j’ai également analysé l’exome des hyperplasies macronodulaires non mutées ARMC5. Je n’ai pas identifié de nouvelle mutation somatique récurrente. Au niveau de l’exome germinal, j’ai identifié plusieurs gènes candidats récurrents, qui ouvrent la voie à des analyses génétiques (extension de cohorte) et de biologie cellulaire complémentaires. Ce travail est la première caractérisation génomique d’envergure des lésions bénignes de la corticosurrénale. Même si tous les mécanismes ne sont pas élucidés dans le détail, ces données représentent une ressource importante pour orienter les recherches à venir dans la tumorigenèse surrénalienne bénigne et la stéroïdogenèse. / The adrenal cortex produces steroid hormones, mainly cortisol, aldosterone and androgens. The adrenal cortex can be the site of tumors - adenomas or cancers -, hyperplasias and dysplasias. These lesions are in their great majority benign. They may be associated with hypersecretion of steroid hormone, most commonly cortisol (Cushing's syndrome) or aldosterone. There are also non-secreting tumors. Although molecular classifications have been established for carcinomas, to date there is no genome-wide classification of benign adrenocortical tumors, which could provide information on the mechanisms of autonomic secretion and proliferation of these lesions. Finally, the genetic determinism of dysplasia and hyperplasia is only partially known. During my thesis, I analyzed a complete "omics" dataset of benign adrenocortical lesions for more than a hundred samples, including high-throughput sequencing (exome / targeted for mutations, RNA-seq for microRNA analysis), transcriptome and methylome microarrays, and SNP microarrays for chromosomal alterations. I was able to identify a relatively convergent genome-wide molecular classification between the different "omics", which is consistent with the tumor and secretory types, but also identifies new subgroups within these lesions. In particular, it appears that mutations in these lesions are essential determinants of molecular classification. Thus, the lesions are grouped according to the signaling pathway or the altered gene, in particular the PKA / cAMP pathway for lesions producing cortisol, the Wnt / beta-catenin pathway for adenomas that do not secrete little or no cortisol, and ARMC5 for a subgroup of macronodular hyperplasia. These very distinct groups also contain lesions with no identified mutation, presumably with alternative mechanisms of alteration of these signaling pathways. In the group of ARMC5 mutated macronodular hyperplasia, the comparison with all other benign lesions shows a strong ovarian expression signature, marked by the expression of FOXL2 and its targets CYP19A1 and PTHLH. This mark of specifically gonadal differentiation in the adrenal gland causes a development anomaly to be discussed. This integrated genomic analysis also identifies epigenetic alterations of steroidogenesis. In particular, tumors secreting a lot of cortisol are globally hypermethylated in their CpG islands. In addition, hypermethylation of CYP21A2 is probably a mechanism of intratumoral 21-hydroxylase deficiency. MiRNA signatures also appear to have an impact on steroidogenesis. During my thesis I also analyzed the exome of unmutated macronodular hyperplasia ARMC5. I did not identify a new recurrent somatic mutation. At the level of the germinal exome, I identified several recurrent candidate genes, which open the way for complementary genetic analyzes (cohort extension) and cell biology. This work is the first major genomic characterization of benign lesions of the adrenal cortex. Although not all mechanisms are fully elucidated, these data represent an important resource for guiding future research into benign adrenal tumorigenesis and steroidogenesis.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules chromaffines des glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines excitables impliquées dans la sécrétion de catécholamines. En réponse à un stress, ces hormones, parmi les premières à être libérées exercent de multiples actions sur leurs organes-cibles, contribuant à la réponse adaptive de l'organisme. Ainsi, élucider la physiopathologie du stress est un enjeu de santé publique et mieux connaître les mécanismes permettant au tissu médullosurrénalien d'optimiser la sécrétion de catécholamines aux besoins de l'organisme est un défi à relever.La sécrétion des catécholamines est liée à l'activité électrique des cellules chromaffines et élucider les mécanismes cellulaires qui en contrôlent l'excitabilité est d'intérêt. L'activité électrique de ces cellules est régulée par le nerf splanchnique ainsi que par des conductances ioniques intrinsèques. Dans ce contexte, les conductances opérant autour du potentiel de repos jouent un rôle majeur dans le déclenchement des potentiels d'action. C'est en particulier le cas du canal NALCN (sodium leak channel), récemment décrit comme régulant le potentiel de repos des neurones. C'est pourquoi nous avons orienté nos travaux vers la caractérisation du rôle de NALCN dans l'excitabilité des cellules chromaffines, dans des tranches de glandes surrénales de souris. L'enregistrement du potentiel de membrane révèle qu'environ 62% des cellules chromaffines présentent des potentiels d'action spontanés et que le profil de décharge suit un mode régulier ou un mode en bouffées. Des enregistrements plus longs révèlent qu'une même cellule présente alternativement ces 2 modes de décharge. Un changement de potentiel de quelques mV autour du potentiel de repos favorise un mode, indiquant que les courants ioniques actifs autour du potentiel de repos sont des composantes cruciales de l'excitabilité cellulaire. NALCN est-il un de ces courants?Pour commencer, nous avons observé, par hybridation in situ, la présence du transcrit codant NALCN dans les cellules chromaffines chez la souris (coll Dr. Ventéo, INM, Montpellier). Nous avons alors cherché à déterminer si NALCN est impliqué dans l'activité électrique des cellules chromaffines. Nous avons utilisé un protocole de diminution de la concentration extracellulaire de Na+, classiquement utilisé pour l'étude électrophysiologique de NALCN. La diminution du Na+ extracellulaire induit une hyperpolarisation et un arrêt des potentiels d'action. Cet effet n'est pas bloqué par la TTX. En potentiel imposé, la diminution du Na+ réduit le courant de maintien, elle n'est ni bloquée par la TTX ni par le Cs+. La courbe courant/potentiel du courant sensible à la réduction du Na+ révèle un courant linéaire entre -130 et -50 mV et un potentiel d'inversion en accord avec la contribution de plusieurs espèces ioniques. Ce courant présente une perméabilité majeure au Na+ vs K+. Ainsi, ces résultats décrivent une conductance ionique partageant des propriétés biophysiques et pharmacologiques similaires à celles de NALCN.Afin de poursuivre dans cette direction, nous avons initié des travaux ambitieux visant à éteindre l'expression du gène codant NALCN dans les cellules chromaffines, au travers d'une stratégie d'injection de virus in vivo. Une construction codant pour un shRNA dirigé contre NALCN, a été injectée dans la glande surrénale gauche. Les résultats sont très encourageants, montrant i) la présence, dans les glandes injectées, de cellules chromaffines transduites et ii) une diminution significative de l'expression de NALCN dans les glandes injectées avec le ShRNA-anti NALCN. Cette approche de transduction virale mérite d'être poursuivie.En conclusion, et même si les résultats actuels ne permettent pas d'affirmer avec certitude que NALCN contribue à l'excitabilité des cellules chromaffines, ce travail de thèse apporte néanmoins une contribution majeure à l'étude de l'excitabilité de ces cellules et ouvre des perspectives attractives quant au rôle de NALCN. / Adrenal chromaffin cells are excitable neuroendocrine cells involved in the secretion of catecholamines. Once delivered into the blood circulation, these hormones exert multiple actions, leading to physiological adjustments enabling the organism to cope with stress. Deciphering the physiology/pathology of stress is a major public health issue, especially in the field of the mechanisms that lead to optimal catecholamine secretion.The electrical activity of chromaffin cells critically shapes the catecholamine secretory pattern. Elucidating the mechanisms regulating the firing discharge is therefore of interest. In situ, chromaffin cell excitability is regulated by both the splanchnic nerve inputs and the intrinsic ion conductances expressed in cells. Regarding this, the conductances operating near the resting membrane potential are crucial in the cell competence to spontaneously fire. In particular, the background current flowing through the sodium leak channel NALCN has been recently reported to tune the resting potential of neuronal cells. This finding prompted us to investigate the possible contribution of NALCN to chromaffin cell excitability in mouse acute adrenal slices. The first part of my thesis was aimed at investigating chromaffin cell electrical firing pattern. Whole-cell recordings indicate that about 62% of mouse chromaffin cell spontaneously fire and exhibit two discharge patterns, a regular firing mode and a bursting mode. Long-lasting recordings of spontaneous electrical activity reveal that the two firing modes can occur in the same cells. When the membrane potential is challenged around the resting value, the firing pattern alternate between the two modes, indicating that currents operating around the resting membrane potential are key components in regulating cell excitability. Is NALN one of these currents?To answer this question, we first unveiled, by in situ hybridization, the presence of the transcript encoding NALCN in mouse chromaffin cells (coll with Dr. Ventéo, INM, Montpellier). Second, we performed electrophysiological experiments using protocols and pharmacological agents commonly used to study NALCN currents. Decreasing external NaCl leads to a robust membrane hyperpolarization, abrogating action potentials. This effect is not blocked by TTX. In voltage-clamp conditions, external Na+ reduction leads to a decrease in the holding current. This effect is not blocked by Cs+. Depolarizing voltage ramps unveil that the current blocked by lowering external Na+ blocks is linear between -130 and -50 mV, and displays a reversal potential arguing for a non-selective conductance. The ionic permeability is dominant for Na+ over K+. Collectively, our results describe a voltage-independent and non-selective cationic conductance operating near the resting potential of mouse chromaffin cells. Its electrophysiological and pharmacological properties recapitulate two NALCN attributes.In the third part, we developed an ambitious approach aiming at silencing NALCN expression specifically in chromaffin cells in vivo. Viral vectors encoding anti-NALCN shRNA under the control of the tyrosine hydroxylase promoter, as well as appropriate positive and negative viral constructs, were injected in the left gland. As promising results, transduced cells were detected in the injected glands only and a significant decrease in NALCN expression was observed in glands injected with the anti-NALCN shRNA. As such, the data collected from in vivo manipulation of NALCN expression are encouraging and this approach deserves to be pursued.This thesis describes a Na+-sensitive current operating near the resting membrane potential of mouse chromaffin cells, sharing biophysical and pharmacological properties with NALCN. Even though further experiments are needed to ascertain that NALCN supports this conductance, our work contributes to a better knowledge of chromaffin cell excitability.

Le déficit en 21-hydroxylase est la cause la plus fréquente des hyperplasies congénitales des surrénales. Un grand nombre de nouvelles mutations a été trouvé dans le laboratoire qui centralise la plus grande cohorte de familles au niveau international et l'évaluation de leur sévérité était primordiale pour optimiser la prise en charge des patients (thérapeutique, conseil génétique). Grâce à l'analyse approfondie du phénotype des patients et au développement d'études fonctionnelles (in vitro, in silico), nous avons pu évaluer le retentissement de la plupart des 85 nouvelles mutations ; nous avons choisi comme témoins des mutations fréquentes de sévérité connue et nous avons comparé nos résultats avec ceux de la littérature. L'analyse plus approfondie d'une quinzaine de mutations rares a confirmé l'existence de bonnes corrélations phénotype-génotype comme ceci est décrit dans cette pathologie. Par ailleurs, les études structurales que nous avons développées ont permis d'améliorer les connaissances sur les relations structure-fonction des cytochromes P450 en général.

L'utilisation de transgènes actifs dans le cortex surrénalien de souris a permis de dériver de nouvelles lignées cellulaires de la zone fasciculée de la corticosurrénale (lignées ATC) et de tester le pouvoir transformant de gènes candidats au développement de tumeurs corticosurrénaliennes. Les cellules ATC produisent de la corticostérone et expriment l'ensemble des gènes impliqués dans la stéroïdogenèse sous le contrôle de l'ACTH. Elles ont permis d'explorer les rôles antagonistes des facteurs de transcription SF1 et DAX1 dans le mécanisme d'action de l'ACTH. Les modèles cellulaires et murins surexprimant IGF2 ou ayant perdu en partie l'expression de p57kip2 ont conduit à rejeter leur implication individuelle dans le développement des corticosurrénalomes. Nous avons montré que l'expression dans la corticosurrénale de souris d'une sous unité régulatrice RIalpha tronquée de la PKA reproduit l'hyperactivité endocrine rencontrée dans les hyperplasies micronodulaires pigmentées des surrénales

Le déficit en 21-hydroxylase est la cause la plus fréquente des hyperplasies congénitales des surrénales. Un grand nombre de nouvelles mutations a été trouvé dans le laboratoire qui centralise la plus grande cohorte de familles au niveau international et l’évaluation de leur sévérité était primordiale pour optimiser la prise en charge des patients (thérapeutique, conseil génétique). Grâce à l’analyse approfondie du phénotype des patients et au développement d’études fonctionnelles (in vitro, in silico), nous avons pu évaluer le retentissement de la plupart des 85 nouvelles mutations ; nous avons choisi comme témoins des mutations fréquentes de sévérité connue et nous avons comparé nos résultats avec ceux de la littérature. L’analyse plus approfondie d’une quinzaine de mutations rares a confirmé l’existence de bonnes corrélations phénotype-génotype comme ceci est décrit dans cette pathologie. Par ailleurs, les études structurales que nous avons développées ont permis d’améliorer les connaissances sur les relations structure-fonction des cytochromes P450 en général. / Steroid 21-hydroxylase deficiency is the most common enzymatic defect causing congenita ladrenal hyperplasia. A large number of new mutations has been detected in the laboratory, which centralizes the biggest cohort of families in the world, and evaluation of their severity wasessential to optimize the care of the patients (treatment, genetic counselling). Thanks to detailed analysis of the patients phenotype and to the development of functional studies (in vitro, in silico), we were able to evaluate the severity of most of the 85 novel mutations; we decided touse as controls frequent known mutations and to compare our results with those of literature. Themore detailed analysis of about fifteen rare mutations confirmed the existence of goodcorrelations phenotype-genotype as this is described in this pathology. Moreover, the structural studies we developed led to improve the knowledge on structure-function relationship of theP450 cytochromes family.

Les glucocorticoïdes (GC), généralement sécrétés par le cortex surrénalien, exercent de très nombreuses fonctions dans l’organisme, via leur liaison au récepteur des glucocorticoïdes (GR). Les rares mutations inactivatrices du GR déjà décrites, sont responsables d’un syndrome de résistance aux GC et peuvent conduire à une hypertension artérielle (HTA), une hyperplasie surrénalienne (HBS), un hirsutisme et une obésité. Dans ce travail, nous avons caractérisé fonctionnellement 13 variants hétérozygotes du GR (expression, transactivation, localisation subcellulaire,...). Six variants du GR, découverts par séquençage à haut débit (NGS) ne sont pas pathogènes alors que 7 mutations hétérozygotes originales délétères ont été identifiées dans le cadre du protocole hospitalier de recherche clinique (Muta-GR). Ce PHRC a permis de préciser une prévalence à 5% de mutations inactivatrices du GR dans une cohorte de 100 patients avec HBS associée à une HTA et/ou un hypercortisolisme biologique sans signe clinique de Cushing.Une haploinsuffisance du GR, démontrée par la diminution d’induction par la déxamethasone du gène cible FKBP5, a été mise en évidence dans les fibroblastes cutanés de certains patients porteurs de mutations inactivatrices du GR. Ces patients présentent souvent un hypercorticisme avec hypokaliémie, aldostérone et rénine basse, signant un pseudohyperaldostéronisme. Nous avons démontré que le gène HSD11B2 codant pour l’enzyme 11β-HSD2, assurant l’inactivation des GC, est une cible directe du GR comme démontré par transfection transitoire de gène-rapporteur, RT-qPCR, LC/MSMS et ChIP. L’établissement des modèles de knock-in de mutations GR par stratégie Crispr/cas9 dans des lignées cellulaires préadipocytaires ou corticosurrénaliennes humaines s’est soldé par un échec. Ce travail devrait faciliter la sélection des patients chez qui la recherche de mutation inactivatrice du GR doit être faite et invite à un suivi régulier de ces patients. / Glucocorticoids (GC) regulate many essential biological functions by activating the glucocorticoid receptor (GR). GR loss-of function mutations are responsible for GC resistance syndrome, often associated with high blood pressure, hirsutism, bilateral adrenal hyperplasia (BAH) and obesity. Herein, functional characterization of 13 GR variants is presented (expression and binding studies, transactivation assays, subcellular localization) 6 variants were discovered with next-generating sequencing and had no functional impact on GR signaling while 7 GR loss-of-function mutations were mainly discovered during the National Clinical Hospital Research Program, Muta-GR. This PHRC discloses a 5% prevalence of GR loss-of-function mutations in a cohort of 100 patients with BAH, biological hypercortisolism and/or hypertension without Cushing signs. A GR haploinsuffisiency was demonstrated by a reduced dexamethasone-induced FKBP5 expression in skin fibroblasts of some patients harbouring GR loss-of-function mutations. These patients often presented with hypercorticism, hypokalemia, low renin and aldosterone levels, consistent with a pseudohypermineralocorticism. We showed that HSD11B2 encoding the 11β-HSD2 enzyme inactivating GC, is a direct GR target gene by transient transfection of reporter gene, RT-qPCR, LC/MSMS and ChIP. We failed to introduce GR loss-of-function mutations in human preadipocytes and adrenocortical cells by Crispr/Cas 9 technology. This work should facilitate selection of patients in whom GR mutation may be search, enabling an appropriate follow-up.