Les récepteurs Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) constituent la plus grande famille de récepteurs à activité tyrosine kinase transmembranaires. Leur activité kinase peut être induite par leurs ligands, les éphrines (EFN). Une fois activés, ces récepteurs sont impliqués dans la régulation de la fonction cellulaire par transduction antérograde ou rétrograde du signal EPH-EFN. Au cours de la dernière décennie, nos études ont démontré que les EPH / EFN jouent un rôle important dans la régulation de la pression artérielle par la modulation de la contractilité des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). EPHB6, EFNB1 et EFNB3 ont un effet négatif sur la contractilité des VSMC et la pression artérielle, tandis que EPHB4 et EFNB2 montrent un effet positif. La famille EPH / EFN est donc un nouveau système yin et yang qui ajuste finement l'homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également constaté que les catécholamines urinaires de 24 h sont réduites chez les souris mâles EPHB6 knockout (KO), suggérant que l’EPHB6 régule la pression artérielle non seulement via les VSMC mais aussi par la sécrétion de catécholamine (CAT). La régulation de CAT par l’EPHB6 dépend de la testostérone car (1) les niveaux réduits de CAT ne sont pas observés chez les souris femelles EPHB6 KO ; et (2) la castration chez les souris mâles EPHB6 KO ramène la CAT à des niveaux normaux. Durant ma thèse, nous avons étudié le mécanisme impliqué dans la régulation de la sécrétion et de la synthèse des catécholamines chez les cellules chromaffines des glandes surrénales (AGCC) par la voie de signalisation de l’EPHB6. En ex vivo, la teneur totale en épinéphrine et la sécrétion d'épinéphrine déclenchée par l'acétylcholine (ACh) sont toutes deux réduites dans les glandes surrénales venant des souris KO mâles mais pas dans celles venant des femelles ou de mâles castrés. Ensuite, nous avons observé une diminution de l’afflux de Ca2+ dépendant de l'ACh dans les AGCC venant des souris mâles EPHB6 KO, ce qui découle de l'effet non-génomique de la testostérone. En appliquant le patch clamping de cellules entières sur les AGCC, nous avons démontré que la diminution d’afflux de Ca2+ dans ces cellules est causée par l’augmentation des courants de potassium à grande conductance activé par le calcium (BK). En utilisant l'enregistrement ampérométrique, nous avons constaté que la sécrétion de CAT par les AGCC est compromise en l'absence d'EPHB6. Nous avons également observé une diminution du désassemblage de la F-actine corticale dans les AGCC venant de souris mâles KO associée à une diminution de l'exocytose des vésicules contenant es catécholamines. Ces deux phénomènes n’ont pas été observés chez les femelles KO ni chez les mâles castrés. Des études complémentaires ont montré que le désassemblage défectueux de la F-actine dans les AGCC est régulé par la signalisation inverse de l'EPHB6 à l'EFNB1 via deux voies de signalisations différentes : la voie du membre A de la famille des homologues Ras (RHOA) et la voie de la tyrosine kinase proto-oncogène de la famille Src (FYN) / proto-oncogène c-ABL / la calponine monooxygénase associée aux microtubules et le domaine LIM contenant 1 (MICAL-1). En outre, nous avons observé que la diminution de la teneur totale en épinéphrine dans la glande surrénale venant des souris mâles KO est causée par une expression altérée de la tyrosine hydroxylase (TH), qui est l’enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse des CAT. L'effet non génomique de la testostérone a également participé dans ce processus. Nous avons révélé que la signalisation inverse d'EPHB6 à EFNB1 contribue à la surexpression de TH dans les AGCC par l’augmentation de son niveau de transcription. La voie en aval de cette signalisation inverse implique la petite famille Rac GTPase 1 (RAC1) / MAP kinase kinase 7 (MKK7) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / proto-oncogène c-Jun / activator protein 1 (AP1) / réponse de croissance précoce 1 (EGR1). Ces travaux démontrent pour la première fois un rôle spécifique de la famille EPH / EFN dans la régulation de la biologie médullaire de la glande surrénale. La signalisation rétrograde d’EPHB6 via EFNB1 régule la synthèse et la sécrétion des catécholamines de concert avec la testostérone dans les AGCC. / Erythropoietin-producing hepatocyte (Eph) receptors are the largest family of cell surface transmembrane receptor tyrosine kinases. Their kinase activity can be activated by their ligands, ephrins (EFNs), and involved in cell function regulation through either EPH-EFN forward or reverse signaling transduction. In the last decade, we have revealed the previously unknown function of EPHs/EFNs in the regulation of blood pressure by modulating the contractility of vascular smooth muscle cells (VSMCs). EPHB6, EFNB1, and EFNB3 have a negative effect on the VSMCs contractility and blood pressure, while EPHB4 and EFNB2 show a positive effect instead. Thus, EPH/EFN family is a novel yin and yang system that finely tunes blood pressure homeostasis. EPHB6 also targets cells responsible for catecholamine (CAT) secretion in addition to the VSMCs, since we found that the 24-h urine catecholamines are reduced in male EPHB6 knockout (KO) mice. This phenotype in EPHB6 KO mice is testosterone-dependent because the reduced CAT levels are not observed in female KO mice; castration in KO male mice reverts the CAT levels to a normal range. In this research, we investigated the mechanism for the regulation of catecholamine secretion and synthesis in adrenal gland chromaffin cells (AGCCs) by EPHB6 signaling. In ex vivo, the total content of epinephrine and the acetylcholine (ACh)-triggered epinephrine secretion were both reduced in the adrenal gland from KO male but not female or castrated mice. Then, we found a reduced ACh-dependent Ca2+ influx in AGCCs from male EPHB6 KO mice, and this effect depended on the non-genomic effect of testosterone. The results of whole-cell patch clamping on AGCCs indicated that the enhanced large-conductance calcium-activated potassium (BK) currents were responsible for the reduced Ca2+ influx in these cells. Using amperometry recording, we found that CAT secretion by AGCCs was compromised in the absence of EPHB6. The cortical F-actin disassembly in AGCCs from KO male but not female or castrated mice was reduced, accompanied by decreased catecholamine vesicle exocytosis. Further study showed such defective F-actin disassembly in AGCCs was regulated by the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 via the Ras homolog family member A (RHOA) and proto-oncogene Src family tyrosine kinase (FYN)/proto-oncogene c-ABL/microtubule-associated monooxygenase calponin and LIM domain containing 1 (MICAL-1) pathways. Further, we observed that the reduced total content of epinephrine in the adrenal gland from male KO mice was caused by impaired expression of tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme in CAT biosynthesis. The non-genomic effect of testosterone was also involved in this process. We revealed that the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 contributed to the up-regulation of TH expression in AGCCs by enhancing its transcription. The downstream pathway of this reverse signaling involved Rac family small GTPase 1 (RAC1)/MAP kinase kinase 7 (MKK7)/c-Jun N-terminal kinase (JNK)/ proto-oncogene c-Jun/activator protein 1 (AP1)/early growth response 1 (EGR1). The present research, for the first time, revealed the specific role of the EPH/EFN family on the regulation of the adrenal gland medullary biology. The EPHB6 reverse signaling through EFNB1 in concert with testosterone regulates the catecholamine synthesis and secretion in AGCCs.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

ARMC5 est une protéine qui contient sept motifs Armadillo répétitifs organisés en tandem et un domaine BTB. Nous avons observé que cette protéine était fortement exprimée dans les organes lymphoïdes, les glandes surrénales et le cerveau. Les souris avec une délétion d’Armc5 (souris KO) étaient de petite taille, et présentaient une diminution de la prolifération et la différenciation des lymphocytes T. L’absence d’ARMC5 entraînait une déficience de la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes CD4+ et CD8+ dans les modèles expérimentaux d’encéphalomyélite auto-immune et d’infection au virus de la chorioméningite lymphocytaire, respectivement. Par la suite, plusieurs études ont révélé que la mutation ARMC5 était associée à l’hyperplasie macronodulaire bilatérale primitive des surrénales (HMBPS), qui représente une cause rare du syndrome de Cushing. Nous avons ensuite confirmé que l’hyperplasie des glandes surrénales s’était développée chez les souris KO âgées, et qu’elle s’accompagnait d’une légère augmentation des taux sériques de glucocorticoïdes. Comme ARMC5 ne présentait pas d’activité enzymatique, il était probable qu’elle faisait appel à d’autres protéines pour exercer sa fonction. Nous avons identifié plusieurs protéines qui se liaient à ARMC5, et plus particulièrement le complexe ARMC5/Cullin3 qui formait une ubiquitine ligase (E3) spécifique de la sous-unité RPB1 de l’ARN polymérase II. ARMC5 contrôlait le processus d’ubiquitination de RPB1 qui, par conséquent, s’accumulait dans plusieurs organes majeurs : les glandes surrénales, les ganglions lymphatiques, le cerveau, les poumons, le foie, etc. chez la souris KO. Ces résultats démontrent un rôle clé de l’ubiquitine ligase dans la dégradation de la protéine RPB1. Une accumulation similaire a également été observée dans les tissus hyperplasiques des surrénales provenant de patients atteints d’HMBPS et porteurs de la mutation ARMC5, ce qui souligne la pertinence clinique de nos résultats de recherche fondamentale dans les maladies humaines. Un défaut de dégradation de RPB1 augmentait le pool d’ARN polymérase II. Par ailleurs, nous avons identifié un groupe de gènes fortement surexprimés dans les glandes surrénales déficientes en ARMC5, parmi lesquels figurent les gènes effecteurs qui seraient impliqués dans l’hyperplasie des surrénales chez les souris KO et l’HMBPS chez les patients porteurs de la mutation ARMC5. Finalement, nous avons montré que la délétion ou la mutation d’Armc5 augmentait considérablement le risque des anomalies du tube neural chez les souris et les humains. Chez les patients souffrant de myéloméningocèle, nous avons constaté neuf différentes mutations faux-sens délétères, dont une diminuait l’interaction entre ARMC5 et RPB1. L’augmentation du pool d’ARN polymérase II dans les cellules précurseurs neurales (CPN), causée par la délétion ARMC5, influençait un groupe particulier de gènes, dont certains (p. ex. Folh1) seraient susceptibles de participer au développement du tube neural. En résumé, l’association ARMC5 et Cullin3 forme un complexe E3 qui cible RPB1 provoquant son ubiquitination et sa dégradation. En absence d’un tel mécanisme, on observe une perturbation de l’homéostasie de l’ARN polymérase II, qui mène à une diminution de la réponse immunitaire médiée par lymphocytes T, le développement d’HMBPS et un risque accru d’anomalies du tube neural. / ARMC5 protein contains seven tandem Armadillo repeats and one BTB domain. We observed that Armc5 was highly expressed in the lymphatic organs, adrenal glands, and brain. Armc5 knockout (KO) mice were small in size and exhibited compromised T cell proliferation and differentiation. The absence of ARMC5 resulted in an impairment of the CD4 + cell- and CD8 + cell-mediated immune response in the experimental autoimmune encephalomyelitis model and lymphocytic choriomeningitis virus infection model, respectively. Subsequently, several studies revealed that ARMC5 mutations were related to primary bilateral macronodular adrenal hyperplasia (PBMAH), which is a rare cause of Cushing’s syndrome. We then confirmed that adrenal gland hyperplasia was indeed developed in aged Armc5 KO mice with mildly increased serum glucocorticoid levels. Since ARMC5 did not exhibit enzymatic activity, its function likely depends on the interaction with other proteins. We identified several proteins that binds to ARMC5, most notably ARMC5 binding to Cullin3, forming a ubiquitin ligase (E3) specific for RNA polymerase II subunit I (RPB1). ARMC5 regulated the ubiquitination of RPB1, and its deletion resulted in RPB1 accumulation in major organs (e.g., adrenal glands, lymph nodes, brain, lung, and liver), indicating the critical role of this E3 in RPB1 degradation. A similar accumulation was also found in hyperplasia tissues from adrenal glands of PBMAH patients carrying ARMC5 mutations, underscoring the clinical relevance of our basic research findings in human disease. Defective degradation of RPB1 led to an enlarged RNA polymerase II (Pol II) pool. In addition, we have identified a group of genes strongly upregulated in KO adrenal glands, including the effector genes which would be involved in adrenal gland hyperplasia in Armc5 KO mice and PBMAH patients carrying ARMC5 mutation. Finally, we have shown that deleting or mutating Armc5 significantly augments the risk of neural tube defects in mice and humans. In patients with myelomeningocele, we found nine deleterious missense mutations in ARMC5, one of which weakened the interaction between ARMC5 and RPB1. The enlarged Pol II pool in Armc5 KO neural precursor cells (NPCs) influenced a particular group of genes, some of which (e.g., Folh1) are thought to be involved in the development of the neural tube. In summary, ARMC5 and CUL3 form an E3 complex, which targets RPB1 causing its ubiquitination and degradation. In the absence of such a mechanism, there is a disturbance of RNA polymerase II homeostasis, which leads to a decrease in the T cell-mediated immune response, the development of PBMAH and an increased risk of neural tube defects.