L'objectif de cette thèse est de préparer des microsphères chargées en une protéine modèle, le lysozyme, en utilisant un nouveau copolymère pentabloc. La libération de protéine à partir des microsphères obtenues doit être continue et complète sur une période d’au moins un mois. Des copolymères pentabloc PLGA-P188-PLGA et une protéine modèle, le lysozyme, ont été utilisés. La présence du bloc central P188 la masse molaire du segment PLGA, le type de solvant, la concentration en polymère, la vitesse d’agitation de l’émulsion et la teneur en tensioactif ont tous un effet sur la porosité des microsphères. La teneur en tensioactif et la vitesse d'agitation ont principalement contribué au contrôle de la taille des particules. En ajustant les caractéristiques du segment PLGA et les paramètres du procédé, la libération de la protéine a été améliorée. Une libération prolongée et complète de protéines sur 8 semaines a été obtenue en suivant le modèle d’Higuchi. La modulation du profil de libération de la protéine a été obtenue par un mélange physique de différentes microsphères. Cette stratégie peut-être appliquée à une seule protéine ou dans le cadre d’une thérapie combinée. / The aim of this thesis is to formulate protein-loaded microspheres with penta-block copolymers for a sustained and completed protein release for at least one month. A new PLGA-P188-PLGA penta-block copolymers were used. The presence of a P188 central block facilitated the control of particle morphology and size. LA/GA ratio, the molecular weight of PLGA segment, solvent type, polymer concentration, emulsifying speed and surfactant content all affected microsphere porosity.The surfactant concentration and agitation speed principally contributed to particle size control. By adjusting the polymer characteristics and the process parameters, the protein release was improved remarkably. An 8-week completed and sustained protein release complying with the Higuchi model was achieved. The physical mixing of different microparticles was then studied for modulating release profile.The achievement of protein delivery with controlled release profile raised its applicability, especially for one protein sustained release or combined therapy.

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In order to achieve efficient therapeutic effect, it is important to understand the structure of biomaterials that are used in the therapeutic delivery system. This dissertation is dedicated towards understanding the hydrolysis pattern of plasmid DNA (pDNA) delivery vehicles comprised of poly(glycoamidoamine)s (PGAAs) under physiological conditions and effects of subtle changes in the chemical structure of the PGAAs on its biological performance. The unusual hydrolysis of the tartarate and galactarate based PGAAs was investigated by studying the hydrolysis of small model molecules which mimic the repeat unit of the respective polymers. In the case of galactarate and tartarate based molecules with terminal amines showed faster hydrolysis of the amide bonds. In addition for the tartarate based compounds, it was also found that it is necessary to have terminal amine functionality for the intramolecular hydrolysis to occur. The model compounds consists of two amide bonds and were designed symmetric, however amide bond on only one side of the tartarate moiety show underwent hydrolysis. Further studies show that one side of the amine assists the hydrolysis of the amide bond on the other side of the tartarate moiety. The degradation of poly(L-tartaramidopentaethylenetetramine) (<strong>T4</strong>) was also used to study the sustained release of pDNA from the layer-by-layer constructs of <strong>T4</strong>/pDNA. The thickness of the constructs was characterized by ellipsometry while the UV-visible spectroscopy was used to characterize the loading capacity of the constructs for pDNA. The indirect sustained release of pDNA under the physiological conditions with respect to time was characterized by the cellular uptake studies in HeLa cells. The increase in the uptake of the Cy5 labeled pDNA was seen at extended period of eleven days. The integrity of the sustained released pDNA for the transgene expression was characterized with an assay to see the expression of the green fluorescent protein (GFP) from the <strong>T4</strong>/GFP-pDNA layer-by-layer constructs. PGAAs show a very efficient delivery of the pDNA in a non-toxic manner. The chemical structure of the polymer can dictate the binding with pDNA and also the release of the pDNA form the polymer-pDNA complexes. In order to better understand the fundamentals of the nucleic acid delivery and to better design the nucleic acid delivery vehicles, subtle changes in the chemical structure of the PGAAs were designed and studied for the biological activity. The effect of charge type was investigated by designing and synthesizing guanidine based polymer series analogues to galactarate and tartarate based PGAAs (<strong>G1</strong> and <strong>T1</strong>) which incorporate secondary amines as the charge type on the polymer backbone. The guanidine based polymer series, poly(glycoamidoguanidine)s (PGAGs), show very non toxic behavior in HeLa cells at all the different polymer to pDNA ratio (<i>N/P</i> ratio) studied. Interestingly PGAGs are the only non-toxic guanidine containing polymers which are reported in the literature to the date. The cellular uptake of pDNA assisted from the PGAGs is a little higher than PGAAs compared although both the series of polymers show similar transgene expression. The transgene expression in case of PGAGs also imply the release of the polymer-pDNA complexes from the endosome. In another study of structure-bioactivity relationship based on the degree of polymerization (DP) of poly(galactaramidopentaethylenetetramine) (<strong>G4</strong>), it was found that the increase in the DP of <strong>G4</strong> increases the toxicity of the polymers in the HeLa cells. / Ph. D.

Le sujet de cette thèse consiste à formuler et caractériser de nouveaux matériaux hybrides inorganique/organique pour la formulation et la libération de principes actifs. Ces matériaux sont constitués soit par des hydroxydes doubles lamellaires (HDL) et des phospholipides (PL) soit par des hydroxydes doubles lamellaires et du chitosane. Les matériaux hybrides hydroxydes doubles lamellaires/phospholipides ont été obtenus par échange anionique entre les anions du feuillet d'HDL et les phospholipides chargés négativement sous forme de liposomes. Les techniques d'analyse utilisées (DRX, ATG, UV et MET) ont permis de déterminer l'influence de la nature des anions de compensation des feuillets d'HDL et des phospholipides sur le taux de intercalation de PL dans les HDL et le taux de chargement d'un principe actif modèle : l'estradiol. Nous avons effectué ensuite des cinétiques de libération des phospholipides et de l'estradiol intercalés en faisant varier le pH et la composition du milieu pour déterminer les propriétés de ce matériau en tant que système de libération sous forme d'implant afin de libérer le principe actif sur des temps très longs. Les matériaux hybrides hydroxydes doubles lamellaires/chitosane ont ensuite été synthétisés sous forme de billes par un procède sol-gel nous permettant d'optimiser la morphologie et la texture des matériaux par le contrôle de la viscosité et le choix du mode de séchage (étuve ou spray-drying). Le chitosane a été choisi pour ses propriétés muco-adhésives afin d'envisager une application du matériau sur les muqueuses. Les techniques d'analyse utilisées ont permis de confirmer la présence de HDL dans le chitosane (DRX), de déterminer la morphologie des billes (MET, MEB) ainsi que leur composition (ATG). Des cinétiques de libération au cours de temps et en fonction de pH ont été réalisées sur de billes chitosane/ hydroxydes doubles lamellaires chargées en principe actif (ibuprofène ou phospholipides charge en estradiol) afin de déterminer leur potentiel de libération du PA. Ces nouveaux hybrides inorganique/organique s'avèrent donc être des matériaux très intéressants en tant que systèmes de libération contrôlée de principes actifs dans le domaine pharmaceutique. / The aim of this work involves the preparation and the characterization of new inorganic/ organic hybrids materials as drug delivery systems. These materials are composed of layered double hydroxide (LDH) and phospholipids (PL) or layered double hydroxide and chitosan. The layered double hydroxide/phospholipids hybrids materials were obtained by anionic exchange between the anions from the HDL layers and the liposome composed of phospholipids with negative charges. Different analysis were used such as XRD, TGA, TEM and fluorescence for the characterization of these materials and the determination of parameters such as the nature of the LDH anions nature, the kind of phospholipids as well the ratio of used model drug (17ƒÒ-estradiol) allowing the optimal method. Release kinetic studies of the phospholipids and of the drug were carried out in different release media (pH, nature of ions) to evaluate the potential sustained release properties of these hybrid materials. Layered double hydroxide/chitosan beads were developed by a sol-gel process. Chitosan was chosen for its muco-adhesive properties permitting to broaden the possibility of pharmaceutical applications. This method allowed us to improve the morphology and the texture of the material by controlling the viscosity and the drying process. Materials were characterized by XRD, TGA, SEM and TEM to determine: the presence of LDH, the encapsulated LDH yield and the morphology of the beads. Releases kinetic of a model drug (ibuprofen) encapsulated in layered double hydroxide/chitosan hybrid materials allowed us to test its potential release properties. Such new inorganic/ organic hybrids materials proved to be interesting as sustained release systems in pharmaceutical domain.

Une nouvelle plateforme hydrogel uniquement formée par l’association de nanocapsules lipidiques (NCLs) a été développée en s’inspirant de précédents travaux utilisant une gemcitabine modifiée. Afin de limiter la toxicité de l’hydrogel, la gemcitabine a été remplacée par la cytidine, rendue amphiphile par une chaîne aliphatique (Cyt-C16). Placée à l’interface huile/eau des NCLs, la Cyt-C16 permet la formation d’un réseau tridimensionnel de NCLs à l’origine de la gélification. Un plan de mélange a permis d’optimiser les procédés de formulation de 4 tailles de NCLs modèles. Les propriétés viscoélastiques des hydrogels sont modulables. Plus les concentrations en NCLs et Cyt-C16 sont élevées, plus le gel est « rigide », indépendamment de la taille des NCLs qui doit être supérieure à 50 nm pour permettre la gélification. Les hydrogels sont injectables et permettent une libération prolongée de NCLs (de taille mono-disperse), sans toxicité supplémentaire in vitro, du fait de la présence de la Cyt-C16. De plus, uniquement solubilisée dans l’huile,la Cyt-C16 permet d’obtenir un organogel, dont les propriétés viscoélastiques sont renforcées en augmentant sa concentration. L’injection sous-cutanée (SC) in vivo des deux gels est bien tolérée et entraine une réaction inflammatoire locale comparable à celle provoquée par un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ces deux formes pourront être utilisées pour libérer de façon prolongée différents actifs. Deux applications précliniques des hydrogels ont été explorées, l’une utilisant la voie SC pour cibler les ganglions lymphatiques, la seconde permettant un traitement local des suites opératoires d’une résection de glioblastome. / An innovative hydrogel platform obtained by the association of lipid nanocapsules (LNCs) was based on the previous work on modified gemcitabine. To limit the inherent toxicity of the hydrogel, gemcitabine was replaced by cytidine, then modified by an aliphatic chain (Cyt-C16). The hydrogel network was allowed by H-bond interactions between cytidine moieties exposed at the oil/water interfaces of LNCs. An experimental plan provided the formulation processes for 4 optimized sizes of model LNCs. The gelation was only possible for LNC sizes higher than 50 nm, and the hydrogel viscoelastic properties are versatile. The hydrogel is more “rigid” when LNC and Cyt-C16 concentrations increase, independently of the LNC size. The hydrogels are injectable and allow a sustained release of LNCs (withmonodisperse size), without additional in vitrocytotoxicity due to Cyt-C16. Moreover, when solubilized in oil, Cyt-C16 alone produced an organogel platform, whose viscoelastic properties are strengthened increasing its concentration. Both types of gels showed a good biocompatibility after an in vivo subcutaneous (SC) injection, with a local inflammatory response similar to that of induced by an approved excipient. These two forms could be used to sustain the release of various drugs, and two preclinical applications of hydrogels have been explored : one using the SC route to target lymph nodes, and the second for local treatment after glioblastoma resection.

Le travail de recherche mené au cours de cette thèse a été effectué dans le cadre d’une collaboration industrielle et a porté sur l’étude des caractéristiques physico-chimiques d’une matrice lipidique à libération prolongée. L’originalité de cette dernière tient à sa forme galénique, des microsphères calibrées d’environ 400 µm de diamètre, fabriquées par procédé de prilling puis conditionnées en sachets.Les caractérisations entreprises au cours de cette thèse ont été menées progressivement en partant de l’étude du comportement thermique individuel des constituants (excipients lipidiques et principe actif), puis de leurs mélanges pour définir les conditions d’existence et les caractéristiques structurales des phases solides qu’ils engendrent, notamment lors du prilling. Plusieurs diagrammes d’état partiels ont été construits pour permettre de cerner l’organisation de la matrice formant le produit fini et disposer de leviers fiables pour corriger d’éventuelles déviations du procédé de fabrication. Cette analyse était également indispensable pour décrire précisément le processus de libération du principe actif et en déterminer les paramètres cinétiques. / The research conducted in this thesis, during an industrial collaboration, is focused on the study of physicochemical characteristics of a sustained release lipid matrix. The originality of this matrix is its dosage form, microspheres of 400 microns in diameter, manufactured by a prilling process and packaged in stick-packs.The characterizations conducted during this thesis have been carried out gradually starting from the study of the thermal behavior of individual components (lipidic excipients and drug) and their mixtures to define the phase formation conditions and the structural characteristics of the solid phases generated, especially during the prilling process. Partial phase diagrams were constructed to understand the final product matrix organization and to identify actions to correct any deviations in the process. This analysis was also needed to accurately describe the drug release mechanism and to determine the kinetic parameters.

L’objectif général de cette thèse a été d’étudier le potentiel de billes à base de molécules d’α-cyclodextrine et d’huile de soja, pour l’administration orale de principes actifs peu solubles dans l’eau.Nous avons tout d’abord vérifié qu’il était possible d’encapsuler dans les billes des molécules actives (la progestérone et l’indométacine) autres que les rétinoïdes et le diazépam, avec une teneur élevée et un rendement de fabrication satisfaisant. L’étude du comportement des billes nues lyophilisées, en termes de stabilité et de libération dans des milieux digestifs simulés, nous a permis de proposer un mécanisme de libération de la molécule encapsulée qui se déroule en plusieurs étapes: i) hydratation des billes, ii) dissolution de la matrice hydrophile d’α-cyclodextrine, iii) libération de gouttelettes d’huile contenant le principe actif puis de la fraction dissoute dans l’huile par un phénomène de partage, iiii) fragmentation des billes fragilisées et libération totale de l’huile. La présence de sels biliaires dans le milieu, accélère à la fois la libération et la quantité dissoute, en fragilisant les billes et en réduisant la valeur du coefficient de partage du principe actif entre l’huile et le milieu digestif. Nous avons montré in vitro et in vivo qu’il est possible de moduler la libération d’un principe actif à partir d’une même formulation de départ, en jouant sur l’organisation du système (émulsion sèche, billes nues, billes coquées par un nouvel ajout d’α-cyclodextrine sur les billes nues). Les études in vivo chez le rat ont révélé que l’émulsion sèche se comporte comme une forme à libération immédiate, les billes coquées comme une forme à libération prolongée et les billes nues comme une forme à libération intermédiaire. Enfin, la libération du principe actif encapsulé peut également être modulée en modifiant le mode de séchage des billes. Comparativement à la lyophilisation, le séchage à l’étuve modifie les propriétés des billes en augmentant leur résistance dans les milieux digestifs simulés et prolonge la libération de la molécule encapsulée. / The general aim of this thesis was the study of the potential of beads, made of α-cyclodextrin and soybean oil, for the oral delivery of poorly water soluble drugs. We have first verified that it was possible to encapsulate in beads, active molecules (progesterone and indomethacin), other than retinoid and diazepam, with a high drug loading and a satisfying yied. The study of the behaviour of freeze-dried naked beads, in terms of stability and drug release in simulated gastro-intestinal fluids, allowed to propose a mechanism for the release of the encapsulated drug, involving several steps: i) hydration of the freeze-dried beads, ii) dissolution of α-CD hydrophilic matrix, iii) release of oily droplets containing the active drug and then of the fraction of drug dissolved in oil, following a partition phenomenon, iiii) fragmentation of the weakened beads and at last the total release of oil. The presence of bile salts in the medium accelerates both the release and the dissolved amount, by weakening the beads and reducing the partition coefficient value of the active molecule between oil and digestive medium.We have shown in vitro as well as in vivo that it is possible to modulate the release of a model drug from the same initial formulation, according to the degree of organization of the system (dry emulsion, naked beads, coated beads obtained by an additional amount of α-cyclodextrine to the preformed naked beads). In vivo studies in rats have highlighted that dry emulsion behaves as a fast release formulation, the coated beads as a sustained release formulation and the naked beads as an intermediate one. Finally, the release of the encapsulated drug can also be modulated by modifying the drying method of the beads. Compared to freeze-drying, oven-drying modifies the properties of the beads by increasing their resistance in simulated gastro-intestinal fluids and sustaining the release of the encapsulated drug.

Les systèmes in situ sont des liquides à base de polymère et de solvant organique pharmaceutiquement acceptable, contenant le principe actif. Après injection sous-cutanée, lors du contact avec les fluides corporels, le polymère précipite sous forme d'implant (ISI) ou de microparticules (ISM) qui se dégradent progressivement en libérant le principe actif. Dans ce travail, des ISI et des ISM réalisés à partir d'un copolymère d'acide lactique et glycolique ont été développés pour la libération prolongée de S-nitrosothiols (RSNO), des donneurs de monoxyde d'azote. L'influence du type de formulation, du solvant, de l'hydrophobie du principe actif et de l'environnement (in vitro ou in vivo) sur la solidification, la dégradation de la matrice polymérique et sur la libération du RSNO ont été étudiés. Les expériences in vivo ont prouvé la prolongation par la formulation de l'effet des RSNO sur la pression artérielle chez le rat (jusque 42 h). Néanmoins, le temps de dégradation des formulations est supérieur à 1 mois et doit donc être optimisé pour une application de longue durée. Le potentiel de ces formulations dans un modèle d'infarctus a été évalué. La faisabilité d'une injection directe dans le myocarde infarci a été démontrée. D'après les premiers résultats, ces implants chargés en RSNO permettraient d'améliorer la perfusion du coeur. Enfin, la porosité de ces systèmes augmente durant leur dégradation, ce qui rend la matrice susceptible de recruter et d'héberger des cellules. In vitro, des ISI ont permis l'adhésion et la prolifération de cellules musculaires. Ces formulations adaptées aux RSNO pourraient constituer un outil thérapeutique dans le cadre des maladies ischémiques / In situ forming injectable systems are liquids based of a polymer and a pharmaceutically acceptable organic solvent, to which drug is added. After subcutaneous injection, contact with aqueous body fluids triggers polymer precipitation as implant (ISI) or microparticles (ISM). This matrix degrades then slowly while releasing the drug. In this work, ISI and ISM made of a copolymer of lactic and glycolic acid were developed for sustained release of S-nitrosothiols (RSNO), prodrugs of nitric oxide. Influence of formulation type, solvent, drug hydrophobicity and environment (in vitro vs in vivo) on polymeric matrix solidification, degradation and on RSNO release was studied. In vivo experiments proved that formulation extend (until 42 h) RSNO effect on arterial pressure of rats. However, matrix life-span is higher than 1 month, thus need optimization in view of an application requiring a long lasting release. Evaluation of these formulations has begun in a model of cardiac infarction. First, the feasibility of a direct injection into the infarct area has been established. Second, first results seem to indicate that these implants loaded with RSNO could enhance heart perfusion. Finally, porosity of these systems increases during their degradation, allowing cell recruitment and colonization of resulting matrix. An in vitro study conducted on implants with porosity artificially increased showed adhesion and proliferation of muscular cells seeded onto the systems. As a result, in situ formulations are suitable drug delivery systems for S-nitrosothiols, and represent a potential therapeutic tool, in particular in the field of ischemic diseases

Les connaissances actuelles indiquent la nécessité d’induire une réponse immunitaire à large spectre et notamment des anticorps multifonctionnels pour protéger de l’infection par le VIH. Les approches vaccinales traditionnelles n’étant pas capables d’induire d’anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) suffisamment puissants contre le VIH-1, des stratégies alternatives sont étudiées afin d’induire ces bnAbs. Les avancées majeures concernent le développement de (i) glycoprotéines d’enveloppe optimisées comme immunogène, (ii) vecteurs transportant et présentant l’immunogène de manière efficace et (iii) la forme galénique permettant d’augmenter la durabilité de la réponse protectrice. Dans ce contexte, l’objectif de ce doctorat est d’évaluer les réponses immunitaires induites par des nanoparticules biodégradables fonctionnalisées avec des glycoprotéines d’enveloppe du VIH et d’optimiser la libération prolongée in vivo de l’immunogène. Dans un premier temps, nous avons comparé plusieurs glycoprotéines et sélectionné une glycoprotéine d’isolat primaire optimisée (SOSIP BG505) pour ses capacités à s’adsorber de manière stable à la surface des nanoparticules biodégradables, tout en exposant les épitopes de neutralisation, et capable d’induire in vivo une réponse immunitaire systémique. Nous avons ensuite conçu un hydrogel thermosensible à base de poloxamers capable d’incorporer ces nanoparticules tout en gardant leur stabilité colloïdale et analysé leur biodistribution par imagerie corps entier chez la souris. L’injection par voie sous cutanée de cet hydrogel permet d’induire une réponse immunitaire humorale forte, stable et des IgGs de forte affinité. Cette nouvelle formulation, innovante et simple à mettre en place, apparait comme une nouvelle stratégie de vaccination applicable à de nombreuses pathologies virales nécessitant l’induction d’anticorps neutralisant de forte affinité et à large spectre / Current knowledge indicates the need to induce a broad-spectrum immune response including multifunctional antibodies to protect against HIV infection. As traditional vaccine approaches are not capable of inducing potent broad-spectrum neutralizing antibodies (bNAbs) against HIV-1, alternative strategies are being investigated to induce these bnAbs. Major advances include the development of (i) optimized envelope glycoproteins as immunogens, (ii) efficiently carrying and immunogenic carriers, and (iii) the dosage form that would increase the durability of the protective response. In this context, the objective of this PhD is to evaluate the immune responses induced by biodegradable nanoparticles functionalized with HIV envelope glycoproteins and to optimize the in vivo sustained release of the immunogen.First, we compared several glycoproteins and selected an optimized primary isolate glycoprotein (SOSIP BG505) for its ability to be adsorbed to the surface of biodegradable nanoparticles, while exposing neutralization epitopes, and capable of inducing a systemic immune response in vivo. We then designed a thermosensitive, poloxamers-based hydrogel, capable of incorporating these nanoparticles while maintaining their colloidal stability and we have analyzed their biodistribution by whole-body imaging in mice. The subcutaneous injection of this hydrogel makes it possible to induce a strong, stable humoral immune response with high affinity IgGs. This new formulation, innovative and easy to implement, appears as a new vaccination strategy applicable to many viral diseases requiring the induction of high affinity neutralizing antibodies and broad spectrum