elevação da expectativa de vida e a diminuição no índice de natalidade têm como consequência o envelhecimento da população mundial, com aumento da incidência de doenças neurodegenerativas. Pessoas acometidas por esses males dispõem atualmente de limitados recursos terapêuticos. Estes muitas vezes são só paliativos, com baixa ou nula perspectiva quanto à reversão dos danos instalados. Por isso, o estudo de substâncias possivelmente neuroprotetoras, que apresentam potencial aplicação como novas drogas, tem sido alvo de pesquisas. Estudos realizados a partir das toxinas produzidas por lagartas da mariposa Lonomia obliqua, as quais têm causado inúmeros acidentes na região Sul do Brasil, identificaram uma proteína presente na hemolinfa com atividade antiapoptótica. A mesma demonstrou provável atuação na manutenção do potencial elétrico de membrana mitocondrial elevado, evitando a morte celular por mecanismo apoptótico. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar o perfil proteico e efeito da hemolinfa bruta e fração cromatográfica sobre a viabilidade celular de cultura primária de neurônios hipocampais de ratos após a indução de apoptose. Para avaliação do perfil proteico em amostras da hemolinfa bruta e frações de 3 lotes de lagartas de origens distintas, foi utilizada a abordagem proteômica shotgun, semi-quantitativa. Foram identificadas 76 proteínas totais, sendo 71 na hemolinfa e 40 nas frações. Na avaliação do extrato bruto da hemolinfa predominaram proteínas do tipo antiviral, serino proteases, hemolinas e inibidores de proteases. Já nas frações avaliadas, foram identificadas proteínas dos grupos hemolinas, serino proteases e inibidores de proteases. Os lotes apresentaram diferenças quali e quantitativas nas proteínas identificadas entre si. Em relação à viabilidade celular, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) nas células tratadas com hemolinfa ou frações e induzidas ao dano oxidativo. Porém o tratamento das células com a fração na concentração de 0,05 e 0,1% (v/v) por 24 h foi capaz de manter a viabilidade celular significativamente maior em relação ao controle positivo (p<0,05 e p<0,01 respectivamente). Estes resultados podem contribuir na identificação de proteínas com potencial aplicação como neuroprotetoras. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Increased life expectancy and the decline in births results in aging population, with increasing of neurodegenerative diseases incidence. The therapeutic is limited, often only palliative, with low or no prospect damage reversal. Study of substances with potentially neuroprotective has been the focus of research. Toxic proteins of Lonomia obliqua caterpillars, which have caused several accidents in southern Brazil, were identified in the hemolymph with anti-apoptotic activity. This protein had demonstrated the maintaining of high electric potential of mitochondrial membrane, preventing cell death by apoptosis mechanism. This study aims the evaluation of the protein profile and effect of hemolymph and fraction on cell viability of rats primary cultured hippocampal neurons after induction of apoptosis. Semi-quantitative shotgun proteomics approach was used to evaluate the protein profile of 3 lots of different origin, 71 in hemolymph and 40 in fractions, in a total of 76 proteins. Antiviral protein predominated in crude extract of hemolymph, following by serine proteases, hemolines and protease inhibitors. In fractions were identified hemolines, serine proteases and protease inhibitors. No statistics differences were found (p<0.05) in the cell viability induced of oxidative damage, which were treated with hemolymph or fractions. However, the treatment with the fraction at concentration of 0.05 and 0.1% (v/v) for 24 hours, was able to maintain cell viability significantly higher than positive control (p<0.05 and p<0.01 respectively). These results may contribute to the identification of proteins with potential use as neuroprotective in degenerative conditions.

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2018-09-28T18:12:13Z No. of bitstreams: 2 Marilia_Favalesso_2018.pdf: 1901703 bytes, checksum: 0d9b6ae60903ec7aa858792cf86a51f2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-28T18:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Marilia_Favalesso_2018.pdf: 1901703 bytes, checksum: 0d9b6ae60903ec7aa858792cf86a51f2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lonomia obliqua Walker 1855 (Saturniidae: Hemileucinae) is a species of moth of sanitary interest in Brazil. Their larvae are etiological agents of lonomism, a form of erucism caused by the contact of the human beings with the stinging structures of the species. The most worrying symptoms of lonomism are the systemic hemorrhagic conditions that can lead to several outcomes, including death. The first official notifications of accidents with the species date back to the end of the 80s, in the state of Rio Grande do Sul. Since then, several accidents have been documented in Brazil, mainly in the south and southeast regions of the country. With the increase in the number of victims, health authorities in the state of São Paulo, represented by the “Instituto Butantã”, developed an anti-lonomic serum, which is distributed by the Ministry of Health in places with a higher prevalence of accidents. Hypotheses have been raised on the relation between the growth of the cases of lonomismo and the human occupation; however, little is known about the spatial distribution and ecological aspects of the species to enable the testing of these hypotheses. In view of the above, the present study aimed to produce a map for the potential geographical distribution of L. obliqua in Brazil, based on the combination of different ENM (Ecological Niche Modeling) algorithms. A total of 38 occurrence points were distributed across the geographic area of Brazil and Misiones, Argentina, which were partitioned for calibration and evaluation of the distribution model. Eight continuous climatic variables and only 16 previously considered variables were selected. Different ENM methodologies were tested and compared to TSS (True Skill Statistic) index values. The final model-map was composed of a combination of four algorithms (Gower, Mahalanobis, Maxent and SVM), with pseudo-absences outside a bioclimatic envelope and a number of pseudo-absences equal to that of presences. This model map was binarized from the Low Presence Threshold (LPT) and cut only for Brazil. According to this model map, the areas predicted as suitable for L. obliqua would be restricted to latitudes ~12° and ~32°, and longitudes ~39° and ~57°. When evaluating new sites of occurrence of the specie in Rio Grande do Sul, it was possible to verify that all the municipalities were in areas predicted by the model-map. A characterization of the abiotic variables related to the niche of the specie was also carried out, being these extracted from the area predicted as adequate the presence of the specie in the model map. To help characterize these variables, we also extract categorical descriptors of climate, soil and vegetation (in %). The percentage of land use classes was also extracted in order to contribute to the hypothesis that condition the increase of accidents due to human occupation. In this question, we find a large part of the area predicted within classes of agricultural soils in Brazil, which leads us to ratify the current hypotheses. Thus, the loss of habitat of the species for the agricultural enterprises increases the human contact with the specie, which should increase the number of notifications of the lonomism, generating greater epidemiological concern and habitat conservation for this specie. / Lonomia obliqua Walker 1855 (Saturniidae: Hemileucinae) é uma espécie de mariposa de interesse sanitário no Brasil. Suas larvas são agentes etiológicos do lonomismo, uma forma de erucismo causado pelo contato dos seres humanos com as estruturas urticantes da espécie. Os sintomas mais preocupantes do lonomismo são os quadros hemorrágicos sistêmicos que podem conduzir a diversos desfechos, inclusive o óbito. As primeiras notificações oficiais de acidentes com a espécie datam do final da década de 80, no estado do Rio Grande do Sul. A partir de então, diversos acidentes têm sido documentados no Brasil, principalmente nas regiões sul e sudeste do país. Com o aumento do número de vítimas, autoridades sanitárias do estado de São Paulo, representadas pelo do Instituto Butantã, desenvolveram um soro antilonômico, o qual é distribuído pelo Ministério da Saúde em localidades com maior prevalência de acidentes. Hipóteses têm sido levantadas sobre a relação entre o crescimento dos casos de lonomismo e a ocupação humana; contudo, pouco se conhece sobre a distribuição espacial e aspectos ecológicos da espécie para possibilitar os testes destas hipóteses. Diante do exposto, o presente estudo objetivou produzir um mapa para a distribuição geográfica potencial de L. obliqua no Brasil, baseando-se na combinação de diferentes algoritmos ENM (Ecological Niche Modeling). Foram utilizados 38 pontos de ocorrência distribuídos pela área geográfica do Brasil e região de Misiones, na Argentina, os quais foram particionados para calibração e avaliação do modelo de distribuição. Foram selecionadas oito variáveis contínuas climáticas e de solo entre 16 previamente cogitadas. Diferentes metodologias ENM foram testadas e confrontados quanto a valores de índice TSS (True Skill Statistic). O mapa-modelo final foi composto por uma combinação de quatro algoritmos (Gower, Mahalanobis, Maxent e SVM), com amostragens de pseudo-ausências fora de um envelope bioclimático e número de pseudo-ausências igual ao de presenças. Esse mapa-modelo foi binarizado a partir do limiar LPT (Lowest Presence Threshold) e recortado somente para o Brasil. Segundo este mapa-modelo, as áreas preditas como adequáveis a L. obliqua estariam restritas as latitudes ~12º e ~32º, e as longitudes ~39º e ~57º. Também foi realizada uma caracterização das variáveis abióticas relacionadas ao nicho da espécie, sendo essas extraídas da área predita como adequada a presença da espécie no mapa-modelo. O percentual de classes de uso da terra também foi extraído, a fim de contribuir com as hipóteses que condicionam o aumento de acidentes em função da ocupação humana. Neste quesito, encontramos grande parte da área predita dentro de classes de solos agrícolas no Brasil, o que nos leva a ratificar as hipóteses atuais. Assim, a perda de habitat da espécie para os empreendimentos agrícolas aumenta o contato humano com a espécie, o que deve aumentar o número de notificações do lonomismo, gerando maior preocupação a nível epidemiológico e de conservação de habitat para essa espécie.

Este trabalho teve como principal objetivo, identificar os inimigos naturais de Lonomia obliqua Walker, 1855, lagarta da síndrome hemorrágica em humanos. Através de exemplares de L. obliqua coletados no campo e criados em laboratório, foi possível a obtenção de insetos das ordens Diptera, Hymenoptera e Hemiptera além de Vírus e Nematóide, todos atuando como inimigos naturais. A partir do conhecimento das localidades onde ocorreram os acidentes hemorrágicos, localizou-se e reconheceu-se o hábitat atual desses insetos. Comparando-se as características bióticas e abióticas atuais dessas localidades, geralmente rurais, com aquelas existentes no final do século XIX, época em que ocorreu a formação desses municípios, procurou-se discutir os principais fatores que possivelmente tiveram influência no aumento da população dessa espécie. / The main purpose of this study was to identify the natural enemies of Lonomia obliqua Walker, 1855, the caterpillar responsible for the hemorrhagic syndrome in human beings. From immatures of L. obliqua, collected in the field and reared in the laboratory, insects of the orders Diptera, Hymenoptera and Hemiptera, and also viruses and nematodes, were obtained. Based on the knowledge of the localities where hemorrhagic accidents were registered, the insect habitats were recognized. Comparing biotic and abiotic characteristics of these localities, generally rural, ones with those of the end of the XIX century, when the municipalities were created, an attempt was made to discuss the main factors might have influencing the increase of the species population.

Este trabalho teve como principal objetivo, identificar os inimigos naturais de Lonomia obliqua Walker, 1855, lagarta da síndrome hemorrágica em humanos. Através de exemplares de L. obliqua coletados no campo e criados em laboratório, foi possível a obtenção de insetos das ordens Diptera, Hymenoptera e Hemiptera além de Vírus e Nematóide, todos atuando como inimigos naturais. A partir do conhecimento das localidades onde ocorreram os acidentes hemorrágicos, localizou-se e reconheceu-se o hábitat atual desses insetos. Comparando-se as características bióticas e abióticas atuais dessas localidades, geralmente rurais, com aquelas existentes no final do século XIX, época em que ocorreu a formação desses municípios, procurou-se discutir os principais fatores que possivelmente tiveram influência no aumento da população dessa espécie. / The main purpose of this study was to identify the natural enemies of Lonomia obliqua Walker, 1855, the caterpillar responsible for the hemorrhagic syndrome in human beings. From immatures of L. obliqua, collected in the field and reared in the laboratory, insects of the orders Diptera, Hymenoptera and Hemiptera, and also viruses and nematodes, were obtained. Based on the knowledge of the localities where hemorrhagic accidents were registered, the insect habitats were recognized. Comparing biotic and abiotic characteristics of these localities, generally rural, ones with those of the end of the XIX century, when the municipalities were created, an attempt was made to discuss the main factors might have influencing the increase of the species population.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4328.pdf: 9852557 bytes, checksum: 9a38f4661fc82092a95f76aa328b7cf9 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Financiadora de Estudos e Projetos / In recent years, the technology animal cells culture has allowed the development of many byproducts, especially those with pharmacological interest. Some of these products, the recombinant proteins, can be produced by heterologous expression systems on a commercial scale. Bacteria, yeast, mammalian cells and insects are some of the hosts used in these processes. As source of proteins with farmacological interest, the catterpillar Lonomia obliqua hemolinph was demonstrated to be a helpful organismo. Antiviral, antiapoptotic, antimicrobial and inducing growth proteins, are some of examples. Since the control of viral infections is a major interest to public health, the searching for new antiviral drugs has utmost importance. Several studies have reported the presence of active principles in the arthropods hemolymph. Recently, we demonstrated the existence of an antiviral protein in the hemolymph of the caterpillar Lonomia obliqua. This purified protein induced viral production reduction (TCID50 mL-1) over 157 times in cells infected with the measles virus, 61 times for polio and 61 times for influenza virus H1N1 infections. Thus, the present goals were building and expression of a recombinant plasmid contained coding sequences for expression of viral proteins (using baculovirus) in insect cell Sf-9 system. By this process, it was aimed to test biological activity of the protein. Further sequence analyses of this protein were performed using bioinformatics tools. The RNA of L. obliqua was extracted with Trizol reagent. RNA product was used in RT-PCR reactions with primers specific for the antiviral protein, based on the sequence of the cDNA libraries of L. obliqua tegument and spines, using all possible frame of translation for each cDNA. Restriction sites were inserted in cDNA sequence to insert it in pFastBacTM1 donor vector (Invitrogen). The sequence contained in selected clone of Escherichia coli DH5&#945; was used for transformation into E. coli DH10Bac to obtain a bacmid by transposition process. This bacmid was used for antiviral recombinant protein expression in Sf-9 cells. This recombinant protein activity was tested in Picorna (EMC enchephalomiocardite), Rubeola and Herpes virus. In these trials, it was observed a replication reduction of 10,000, 10,000 and 1,000000 times, respectively. The bioinformatics analysis demonstrated that this protein is secreted, globular and probably belongs to a new class of proteins. / A tecnologia de cultivo de celulas animais tem permitido nos ultimos anos o desenvolvimento de inumeros bioprodutos. Principalmente com interesse farmacologico, alguns desses produtos, as proteinas recombinantes, podem ser produzidas em sistemas de expressao heterologos em escala comercial. Bacterias, leveduras, celulas de mamiferos e de insetos sao alguns dos hospedeiros utilizados nestes processos. Como fonte de proteinas de interesse farmacologico, a hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua mostrou-se um organismo bastante promissor. Proteinas antivirais, antiapoptoticas, antimicrobianas e indutoras de crescimento sao alguns destes exemplos. Como o controle das infeccoes virais e de grande interesse pra saude publica, a busca por novos antivirais e de extrema importancia. Diversos estudos relatam a presenca de principios ativos na hemolinfa de artropodes. Recentemente nos demonstramos a existencia de uma proteina antiviral na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. Esta proteina purificada mostrou-se capaz de reduzir a producao viral (TCID50 mL 1) mais de 157 vezes o virus do sarampo, 61 vezes para o virus da polio e 61 vezes para o virus influenza H1N1. Assim, este estudo objetivou a construcao e expressao de um recombinante contendo sequencias de codificacao da proteina antiviral para a expressao em sistema baculovirus/celula de inseto Sf-9 e a realizacao de testes de atividade biologica e caracterizacao por bioinformatica. Para sintetizar cDNA, o RNA de L. obliqua foi extraido com o reagente Trizol e usado nas reacoes de RT-PCR com primers especificos para a proteina antiviral, com base na sequencia das bibliotecas de cDNA de L. obliqua de tegumento e espiculas, utilizando todos os frames de traducao possiveis para cada cDNA. Sitios de restricao foram inseridos no cDNA para ligacao ao vetor doador pFastBacTM 1 (Invitrogen). O plasmideo recombinante selecionado em Escherichia coli DH5&#945; foi utilizado na transformacao em E. coli DH10Bac para a obtencao do bacmideo pelo processo de transposicao. O bacmideo recombinante foi utilizado para a expressao da proteina antiviral em celulas SF-9. A atividade desta proteina recombinante foi testada em Picornavirus (EMC - encephalomiocardite), Rubeola e Herpes. Nestes testes foi observado que a proteina reduziu em 10.000, 10.000 e 1.000.000 a titulacao viral, respectivamente. As analises de bioinformatica demonstraram que esta proteina e secretada, globular e provavelmente pertenca a uma nova classe de proteinas.