Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Resumo: O câncer de pulmão é o câncer que apresenta maior mortalidade no mundo: >1,6 milhões de óbitos por ano segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), sendo o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) o tipo mais frequente (~ 85%) de carcinoma pulmonar. O NSCLC apresenta dois subtipos histológicos principais: adenocarcinoma (LUAD) e carcinoma de células escamosas (LUSC). Pesquisas têm sido realizadas objetivando identificar biomarcadores moleculares úteis como alvo terapêuticos em NSCLC e os telômeros têm sido considerado alvos promissores para terapias antitumoral, devido ao seu papel crucial na integridade, estabilidade e manutenção genômica. Telômeros humanos consistem em DNA repetitivo rico em G associado a proteínas do complexo shelterin e mantido pela ação da telomerase. Estudos recentes mostraram que a expressão de TERT (subunidade catalítica da telomerase) e de alguns componentes do complexo shelterin estão alterados em câncer de pulmão. No entanto, a correlação entre alterações na função telomérica e o desenvolvimento e progressão de NSCLC não foi elucidada. Portanto, o objetivo do presente estudo foi verificar alterações na expressão de genes associados aos telômeros, incluindo os ncRNAs associados à regulação e manutenção dos telômeros em NSCLC, no intuito de identificar novos biomarcadores associados ao desenvolvimento e progressão do NSCLC. Para tanto, foram realizadas análises de expressão de 50 genes associados aos telômeros em amostras de tecido tumoral e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: According to the World Health Organization, lung cancer has a high mortality rate associated with >1.6 million deaths per year, being Non-small cell lung cancer (NSCLC) the most frequent type (~ 85%) of lung carcinoma. Lung adenocarcinoma (LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) are the two major histological subtypes of NSCLC. Research efforts have been made to identify molecular biomarkers useful as therapeutic targets in NSCLC and telomere have been considered very promising targets for anticancer therapies due to their crucial role in genome integrity maintenance and stability. Human telomeres consist of repetitive G-rich DNA associated with proteins of the shelterin complex, maintained by the action of telomerase. Recent studies showed that expression of TERT (telomerase reverse transcriptase component) and of some of the shelterin components are altered in lung cancer. However, the mechanisms of telomere deregulation associated with NSCLC development and progression have not been elucidated. Therefore, our aim was to study expression changes affecting telomere-associated genes and ncRNAs associated with telomere regulation and maintenance in NSCLC. Such alterations may represent novel biomarkers associated with NSCLC development and progression. For this purpose, expression analyzes of 50 telomere-associated genes were performed in samples of tumor tissue and normal lung tissue, adjacent to the tumor, from patients with NSCLC. The following techniques were used: 1... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Gabriel Arantes Galvão Dias dos Santos (arantes_gabriel@hotmail.com) on 2018-05-14T15:21:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertação pós defesa.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-14T17:46:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_gagd_me_bot.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T17:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_gagd_me_bot.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Entre as espécies do gênero Leishmania estão os protozoários que causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Métodos de controle e tratamento ainda são ineficientes e a resistência a drogas é um desafio. Por isso, pesquisas para entender melhor a biologia molecular desses parasitos são encorajadas. Uma possível estratégia para isso, é o estudo dos telômeros, estrutura fundamental para a homeostase do genoma. Os telômeros são estruturalmente diferentes do resto do cromossomo, e contam com proteínas específicas que realizam sua manutenção. A Replication Protein A subunit 1 (RPA-1) é uma proteína que interage de DNA de simples fita que tem diversas funções relacionadas com o metabolismo do DNA eucarioto, incluindo os telômeros. A RPA-1 é parte de um complexo heterotrimérico conservado nos eucariotos, incluindo Leishmania spp.. Recentemente nós mostramos por modelagem molecular que a estrutura terciária da LaRPA-1 difere dos seus ortólogos em humanos e leveduras, além de mostrar interações específicas nos telômeros dos parasitos, que na ausência de homólogos canônicos para telomere-end binding protein (TEP) elegem a LaRPA-1 como um potencial candidato para essa função. Neste trabalho, avaliamos a capacidade da LaRPA-1 como uma TEP, cujo papel principal é proteger a extremidade 3' dos telômeros de ataques por exonucleases. Uma busca estrutural por proteínas que compartilham com as TEP domínios de interação proteína-DNA, mostrou que no genoma de Leishmania spp. não existem homólogos estruturais para as mesmas. Aqui mostramos por diferentes abordagens que a LaRPA-1 tem a capacidade de interagir com no mínimo uma repetição telomérica e também é capaz de proteger in vitro a simples fita telomérica rica em G (5’ TTAGGG 3’) da digestão por Exonuclease I bacteriana cuja atividade é no sentido 3’-5’. Somando esses dados, com dados anteriores que mostram que a LaRPA-1 tem preferência pela fita telomérica rica em G e o fato dela ter sido co-purificada com a atividade de telomerase sugerem fortemente que ela está diretamente relacionada com a manutenção da maquinaria telomérica, podendo inclusive ser considerada a principal ligante de simples fita telomérica rica em G (3’ G-overhang) em Leishmania spp. / Among the protozoa parasites of the Leishmania genus are the causative agents of leishmaniasis, a neglected tropical disease endemic in many countries, including Brazil. Disease control and treatment are still inefficient and parasite drug resistance is a challenge. Therefore, efforts for the establishment of intensive research to better understand the molecular biology of these parasites are encouraged. One possible strategy is to study parasite telomeres, a vital chromosome structure important to maintain genome homeostasis. Telomeres are significantly different from the rest of the chromosome and are associated with proteins involved in their maintenance. Replication Protein A subunit 1 (RPA1), a single-stranded DNA-binding protein that plays multiple roles in eukaryotic DNA metabolism, including telomeres, is part of a conserved heterotrimeric complex which is present in most eukaryotes including Leishmania spp. Recently, using molecular dynamics simulations we have shown that the tertiary structure of LaRPA-1 differs from human and yeast RPA-1 and that it also shows parasitespecific interactions with telomeric DNA. In the absence of real homologues to telomere-end binding proteins, LaRPA-1 could be considered a potential candidate. If LaRPA-1 is a telomere-end binding protein, one of its main role would be to protect the telomeric 3`-end termini from nuclease attack. A structural search for proteins that share with the TEP domains of protein-DNA interaction, showed that in the genome of Leishmania spp. there are no structural homologues for them. In this work, we show by different methods, that in vitro LaRPA-1 can bind at least one telomeric repeat and it can also protect the telomeric G-rich sequence (5’ TTAGGG 3’) from the bacterial 3’-5’Exonuclease I digestion. These data compiled to previous data showing that LaRPA-1 preferentially binds the G-rich telomeric DNA and that it co-purifies with telomerase activity strongly suggest that LaRPA-1 is directly involved with parasite telomere maintenance and, possibly, is the main G-rich single-stranded (3’ G-overhang) telomere-binding protein in Leishmania spp.

Telômeros são complexos DNA-proteína presentes nas extremidades dos cromossomos. Os telômeros se encurtam a cada divisão celular, sendo o comprimento telomérico, portanto, considerado um biomarcador do envelhecimento celular. Esse encurtamento é vinculado a diversas doenças relacionadas à idade avançada. Na doença de Alzheimer (DA), têm sido associados com diversas vias fisiopatológicas, como a neuroinflamação e o estresse oxidativo, porém seus mecanismos ainda são pouco conhecidos. A maioria dos estudos sobre comprimento telomérico na DA é realizada em DNA leucocitário, pouco se sabendo sobre seu estado no sistema nervoso central. O lítio é um importante estabilizador de humor, com efeitos neuroprotetores amplamente evidenciados, mas pouco se sabe sobre seu efeito na manutenção do comprimento telomérico. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do tratamento crônico com lítio no comprimento telomérico em diferentes regiões cerebrais (córtex parietal, hipocampo e epitélio olfatório) de camundongos triplo transgênicos para DA (3xTg-AD) e selvagens. Dezoito animais transgênicos e 22 selvagens foram tratados por oito meses com ração contendo 1,0 g (Li1) ou 2,0 g (Li2) de carbonato de lítio/kg, ou ração padrão (Li0). O comprimento telomérico do DNA extraído destes tecidos foi quantificado por PCR em tempo real. O tratamento crônico com lítio foi associado a telômeros mais longos no córtex parietal (Li1, p=0,04) e hipocampo (Li2, p=0,02) dos camundongos 3xTg-AD comparados com os respectivos selvagens. Nossos achados sugerem que o tratamento crônico com lítio afeta a manutenção do comprimento telomérico, mas que a magnitude desse efeito depende da concentração de lítio ministrada e das características do tecido envolvido. Esse efeito foi apenas observado quando comparando os animais triplo transgênicos com os selvagens, indicando que a presença da patologia, no caso a DA, se faz necessária para a modulação do comprimento telomérico promovida pelo lítio / Telomeres are DNA-protein complexes present in the extremities of chromosomes. Telomeres shorten at each cell division, being the telomere length, therefore, considered a cell aging biomarker. This telomere shortening is associated to several age-related diseases. In Alzheimer\'s disease (AD), telomere length has been linked to several pathophysiological pathways, such as neuroinflammation and oxidative stress, though its mechanism are still poorly understood. Majority of studies regarding telomere length in AD are based in leucocyte DNA, with little information about its status in the central nervous system. Lithium is an important mood stabilizer, with neuroprotective effects widely evidenced, but little is known about its effects in telomere length maintenance. The objective of this present study was to evaluate the effect of chronical lithium treatment on telomere length in different brain regions (parietal cortex, hippocampus and olfactory epithelium) of wild type and triple transgenic mice model for AD (3xTg-AD). Eighteen transgenic and 22 wild type male mice were treated for eight months with chow containing 1.0g (Li1) or 2.0g (Li2) of lithium carbonate/kg, or standard chow (Li0). Telomere length of extracted DNA from theses tissues was quantified by real-time PCR. Chronic lithium treatment was associated with longer telomeres in the parietal cortex (Li1, p=0.04) and in the hippocampus (Li2, p=0.02)of 3xTg-AD compared with the respective wild type.Our findings suggest that chronic lithium treatment does affect telomere maintenance, but the magnitude of this effect depends on the working concentrations of lithium and characteristics of the involved tissue. This effect was only observed when comparing triple transgenic with wild type mice, suggesting that the presence of AD pathology was required for the lithium modulation of telomere length

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_MarceloSantos_D.pdf: 9189361 bytes, checksum: 79ecad917f6be7c8b200b549dafc493e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leishmaniose é um espectro de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Durante a infecção, os parasitos usam diferentes estratégias para sobreviver as defesas do hospedeiro, incluindo superar a exposição intensa a espécies reativas de oxigênio (ROS), principais responsáveis por causar danos no DNA, sobretudo nos telômeros, induzindo instabilidade genômica, senescência e morte celular. Telômeros são estruturas nos terminais dos cromossomos compostos por sequências de DNA repetitivas e proteínas, cuja função é proteger as extremidades dos cromossomos, evitando fusões terminais e degradação nucleolítica. Neste trabalho nós induzimos estresse oxidativo agudo em formas promastigotas de L. amazonensis através do tratamento com 2 mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 1h, o qual foi capaz de aumentar os níveis de ROS intracelular, como demonstrado pela reação utilizando CM-H2DCFDA. Além disso, o estresse oxidativo induziu danos no DNA, como mostrado por análise quantitativa de 8-oxodG e núcleos positivos para o ensaio TUNEL. Observamos também, através de parâmetros qualitativos e quantitativos (Southern blot, telomere-PCR e flow-FISH), que o estresse oxidativo, assim como em mamíferos, induziu encurtamento dos telômeros. Analisando a co-localização e interação proteína:DNA por FISH-IIF e ensaios ChIP, foi possível demostrar que o estresse oxidativo causou erosão da extremidade 3¿G overhang, fazendo com que a proteína LaRPA-1 perdesse seu sítio de interação nos telômeros. Além disso, pudemos observar uma maior afinidade de LaRPA-1 para com a fita telomérica rica em C, nesse caso uma região de simples-fita gerada dentro da dupla fita telomérica, provavelmente como consequência do reparo de DNA, sugerindo a participação de LaRPA-1 na resposta a danos oxidativos. Por análise de curvas de crescimento e incorporação de EdU, foi possível observar que o estresse oxidativo induziu diminuição acentuada no número de parasitos em cultura, enquanto os sobreviventes continuaram proliferando e replicando DNA. Observamos também que o estresse oxidativo agudo provocou arrest de ciclo celular na fase G2/M em parte da população em crescimento exponencial. Em conjunto, esses resultados sugerem a presença de um sistema muito eficiente de resposta a danos oxidativos no DNA telomérico, que permite que os parasitos sobrevivam e repliquem DNA mesmo após um estresse agudo / Abstract: Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites of the genus Leishmania that affects million people around the world. During infection, parasites use different strategies to survive host defenses including overcoming exposure to Reactive Oxygen Species (ROS), mainly responsible for causing DNA damage, especially at telomeres which frequently results in genome instability, senescence and cell death. Telomeres are chromosomes end termini structures composed by repetitive DNA coupled with proteins whose function is to protect chromosome ends and avoid end-fusion and nucleolytic degradation. In this work, we induced acute oxidative stress in promastigote forms of Leishmania amazonensis by treating parasites with 2mM hydrogen peroxide (H2O2) for 1 hour, which was able to increase intracellular ROS levels, as demonstrated by CM-H2DCFDA reaction. In addition, oxidative stress induced DNA damage, as confirmed by quantitative analysis of 8-oxodG and TUNEL-positive nuclei. We have also observed using qualitative and quantitative parameters (Southern blot, telomere-PCR and flow-FISH) that oxidative stress, as in mammals, induced telomere shortening. Analysing the protein:DNA co-localization and interaction by FISH-IIF and ChIP assays, it was possible to show that oxidative stress is able to induce erosion of the 3¿G overhang, inducing a displacement of LaRPA-1 from its telomeric interaction site. In addition, we observed an increase in the affinity between LaRPA-1 and the telomeric C-rich strand, in this case, a single-strand region inside the double-strand telomeric DNA generated probably as a consequence of DNA repair, suggesting the participation of LaRPA-1 in oxidative DNA damage response. Analysis of growth curves and EdU incorporation showed that oxidative stress induced a decrease in the number of parasites in culture, while the survivors continued proliferating and replicating DNA. Moreover, as result of acute oxidative stress, part of the parasites in exponential growth shows a G2/M cell cycle arrest. Taken together, these results suggest the presence of a very efficient oxidative damage response in the telomeres that allows parasites to survive and to replicate DNA even after acute stress / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6236.pdf: 2944020 bytes, checksum: dcbf2b2eaca77c3425524a77887f4d6b (MD5) Previous issue date: 2014-06-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aging process affects many systems of the human body, including: autonomic nervous system, which can be assessed by heart rate variability (HRV); cellular structures, such as telomere length; and mechanisms of regulation of the inflammatory process, which can be evaluated by inflammatory markers such as high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP). The combined analysis of these variables enables the study of the aging process in a multidimensional way. Additionally, the effects of hormone replacement therapy (HRT) on HRV are contradictory. In this way, we conducted the study I, which aimed to investigate the effects of HRT on HRV in healthy postmenopausal women. Two groups were evaluated: Group 1 (G1): 20 women who did not use HRT (60 ± 5.89 years) and group 2 (G2): 20 women undergoing HRT (59 ± 5.70 years). The electrocardiogram was recorded in supine position for 10 min. Spectral analysis included low and high frequency in absolute (LF and HF) and normalized (LFnu and HFnu) units. LF/HF ratio was also calculated. Symbolic analysis (0V%, 1V%, 2LV% e 2UV%), Shannon and conditional entropy were calculated. LF, LFnu and LF/HF ratio were higher, whereas HFnu was lower in G2 than in G1. Correlations between complexity indices and HFnu were significant and positive only in G1. We conclude that women undergoing HRT had higher cardiac sympathetic modulation and reduced cardiac vagal modulation compared to women not using HRT. Moreover, the expected positive relationship between cardiac vagal modulation and HRV complexity was found only in the group not undergoing HRT, indicating that vagal modulation in women under therapy drop below a minimum value necessary to the association to become apparent, suggesting an unfavorable cardiac autonomic modulation in spite of HRT. Considering the findings of the study I, we chose to adopt the use of the therapy as an exclusion criterion for the study II. Thus, the study II aimed to examine the aging effect on heart rate variability in supine and standing, on serum hsCRP and leukocyte telomere length, as well as to verify the age at which the changes caused by aging process are accentuated. One hundred and ten volunteers were divided into five groups according to age: G21-30 years, G31-40 years, G41-50 years, G51-60 years, and G61-70 years. Venous blood samples were collected for measurements of serum hsCRP and telomere length. ECG signals were recorded in rest supine and standing (15 min in each posture). HRV was assessed by spectral analysis in low and high frequencies in absolute (LF e HF) and normalized (LFnu e HFnu) units; symbolic analysis (0V%, 1V%, 2LV% e 2UV%); Shannon entropy; and complexity index (CI) and normalized CI (NCI) from conditional entropy. The main results were: 1) HF and 2UV% reduction (vagal modulation) in G51-60, and 0V% increase (sympathetic modulation) and NCI reduction (complexity) in G61-70, in supine; 2) less efficient response to postural change from supine to standing with advancing age; 3) hsCRP increase in G51-60; 4) telomere shortening in G61-70; 5) in supine, HRV indices showed stronger relationship with the principal component of most relevance from the multivariate principal component analysis, compared to hsCRP and telomere length. Considering that HRV indices in supine had a stronger association with the aging process, we can conclude that the decrease in cardiac vagal modulation may have influenced the increase in serum hsCRP (although normal values), in G51-60, since this effect is described by the cholinergic anti-inflammatory pathway. Decreased cardiac vagal modulation and increased hsCRP may have contributed to the telomere shortening identified in the following decade (G61-70). In this way, we must consider the importance of preventive actions prior to the onset of aging effects, particularly in the 41-50 age range, in an attempt to attenuate the natural effects of senescence. / O envelhecimento exerce influência sobre vários sistemas do corpo humano, dentre eles: sistema nervoso autonômico, que pode ser avaliado pela variabilidade da frequência cardíaca (VFC); estruturas celulares, como o comprimento de telômeros; e mecanismos reguladores de processos inflamatórios, que podem ser avaliados por marcadores inflamatórios, como a proteína C-reativa ultra sensível (PCRus). A análise conjunta dessas variáveis permitiria o estudo do processo de envelhecimento de forma multidimensional. Adicionalmente, são controversos os efeitos da terapia de reposição hormonal (TRH) sobre a VFC. Assim, foi realizado o estudo I, o qual teve por objetivo investigar os efeitos da TRH na VFC em mulheres pós-menopáusicas saudáveis. Foram avaliados dois grupos: grupo 1 (G1): 20 mulheres que não faziam uso de TRH (60 ± 5,89 anos) e grupo 2 (G2): 20 mulheres submetidas à TRH (59 ± 5,70 anos). O eletrocardiograma foi registrado na posição supina por 10 min. A análise espectral incluiu a baixa e a alta frequência em unidades absolutas (BF e AF) e normalizadas (BFun e AFun). A relação BF/AF também foi calculada. A análise simbólica (0V%, 1V%, 2LV% e 2UV%), e entropias de Shannon e condicional também foram calculadas. BF, BFun e a razão BF/AF foram maiores, enquanto AFun foi menor no G2 do que no G1. As correlações entre índices de complexidade e AFun foram significativos e positivos apenas no G1. Concluímos que mulheres submetidas à TRH apresentaram maior modulação cardíaca simpática e menor modulação cardíaca vagal em comparação às que não faziam a terapia. Além disso, a relação positiva esperada entre modulação cardíaca vagal e a complexidade da VFC foi encontrada apenas no grupo não submetido à TRH, indicando que a modulação vagal em mulheres sob a terapia não atinge um valor mínimo necessário para a associação se tornar aparente, sugerindo uma modulação autonômica cardíaca desfavorável, apesar da TRH. A partir dos achados do estudo I, optou-se por adotar, como critério de exclusão para o estudo II, o uso da terapia. Assim, o estudo II teve por objetivo analisar o efeito do envelhecimento sobre a VFC nas posições supina e ortostática, os níveis séricos da PCRus e o comprimento de telômeros leucocitários, além de verificar em qual faixa etária se acentuam as alterações provocadas pelo processo de envelhecimento. Foram avaliados 110 voluntários, divididos em cinco grupos, de acordo com a idade: G21-30 anos, G31-40 anos, G41-50 anos, G51-60 anos e G61-70 anos. Amostras de sangue venoso foram coletadas para medidas de PCRus e comprimento de telômeros. Os sinais eletrocardiográficos foram registrados em repouso nas posições supina e ortostática (15 min em cada postura). A VFC foi avaliada por índices de baixa e alta frequências em unidades absolutas (BF e AF) e normalizadas (BFun e AFun) da análise espectral; índices 0V%, 1V%, 2LV% e 2UV% da análise simbólica; entropia de Shannon; e índice de complexidade (IC) e IC normalizado (ICN) da entropia condicional. Os principais resultados foram: 1) redução de AF e 2UV% (modulação vagal) em G51-60, além de aumento de 0V% (modulação simpática) e diminuição de ICN (complexidade) em G61-70 na posição supina; 2) resposta menos eficiente à manobra de mudança postural de supino para ortostatismo com o avanço da idade; 3) aumento da PCRus em G51-60; 4) encurtamento do comprimento de telômeros em G61-70; 5) na posição supina, os índices da VFC apresentaram relação mais alta com o componente principal de maior relevância, proveniente da análise multivariada por componentes principais, em comparação à PCRus e ao comprimento de telômeros. Considerando-se que os índices da VFC na posição supina apresentaram uma associação mais forte com o envelhecimento, podemos concluir que a diminuição da modulação cardíaca vagal possa ter contribuído para o aumento dos níveis séricos de PCRus (apesar dos valores estarem dentro de faixa de normalidade), na faixa etária de 51 a 60 anos, uma vez que este efeito é descrito pela via anti-inflamatória colinérgica. A diminuição da modulação cardíaca vagal e o aumento da PCRus podem ter contribuído para o encurtamento de telômeros, identificado na década seguinte, de 61 a 70 anos. Dessa maneira, torna-se importante a proposição de ações preventivas em faixas etárias anteriores ao início das alterações provocadas pelo envelhecimento, especialmente na década de 41 a 50 anos, na tentativa de atenuar os efeitos naturais da senescência.