La infecció pel virus de la immunodeficiència humana (VIH) es caracteritza per un descens progressiu en la funció i el nombre de limfòcits T CD4+, amb la conseqüent aparició d'infeccions oportunistes. El tractament antiretroviral de gran activitat (TARGA) ha disminuit significativament la morbilitat i mortalitat associades a la infecció pel VIH, però tot i així no permet l'eradicació de la infecció. Aquest és el principal motiu pel qual es busquen teràpies alternatives com les teràpies immunomediades (en la present tesi han estat les interrupcions estructurades del tractament i una vacuna terapèutica de cèl·lules dendrítiques pulsades amb el virus autòleg inactivat per calor), encaminades a estimular el sistema immunològic, principalment la recuperació de la resposta específica cel·lular contra el VIH. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat els següents: (1) analitzar les conseqüències de les interupcions estructurades del tractament sobre la dinàmica de la resposta de les cèl·lules T CD4+ i T CD8+ VIH-1-específiques, sobre les subpoblacions de cèl·lules T, i sobre la resposta limfoproliferativa a antígens policlonals i de record en pacients crònics infectats pel VIH-1 amb un sitema immunològic preservat; (2) estudiar l'eficàcia d'una vacuna terapèutica de cèl·lules dendrítiques pulsades amb virus autòleg inactivat per calor en pacients crònics infectats pel VIH-1 amb un sitema immunològic preservat; (3) estudiar les característiques fenotípiques i funcionals de les cèl·lules T CD4+ i T CD8+ VIH-1-específiques en aquests pacients després del calendari d'immunitzacions amb la vacuna de cèl·lules dendrítiques; i per últim (4) analitzar els epítops immunodominants de les regions p17 i p24 del gen gag dels esmentats pacients per analitzar la influència de la variabilitat d'aquests epítops sobre la resposta immune anti-VIH-1 observada. / The main objectives of this thesis were: (1) To analyze the dynamics of T cells subsets and lymphoproliferative responses during structured treatment interruption cycles and after definitive interruption of HAART in early chronic HIV-1-infected patients; (2) to assess the differentiation and maturation markers as well as functional characteristics of HIV-1-specific CD8+ T lymphocytes in chronic HIV-1-infected patients during dendritic cells therapeutic vaccine; (3) To analyze autologous HIV Gag p17 and p24 sequence variability to know if any mutation in immunodominant peptides occurred after vaccination.

Els transportadors de nucleòsids són fonamentals en la regulació de molts processos fisiològics, modulant els nivells extra- i intracel·lulars dels substrats que internalitzen però a la vegada representen el camí d'entrada de molts anàlegs citotòxics utilitzats en la quimioteràpia i teràpies antivirals. En aquesta tesi s'han dut a terme diversos estudis amb l'objectiu d'intentar determinar mecanismes implicats tant en la localització subcel·lular així com en la regulació dels transportadors de nucleòsids. Així, s'ha demostrat que les diferents isoformes de transportadors de nucleòsids es regulen de manera diferencial en funció dels requeriments de la cèl·lula. Concretament, els resultats obtinguts en un model cel·lular d'epiteli intestinal han demostrat que el transportador equilibratiu ENT1 és sensible a factors proliferatius i en canvi l'expressió i activitat dels transportadors concentratius CNT1 i CNT2 responen a factors que afavoreixen la diferenciació de les cèl·lules. Addicionalment, s'ha posat de manifest que l'activitat del transportador CNT2 està regulada a curt termini per la disponibilitat dels seus substrats mitjançant un mecanisme que no depèn de canvis en la localització subcel·lular del transportador sinó que implica una disminució de la seva afinitat. D'altre banda s'ha demostrat que per l'expressió polaritzada d'aquest transportador a la membrana apical de les cèl·lules epitelials absortives és necessària una seqüència de direccionament present en el extrem N-terminal de la proteïna. Finalment, els resultats obtinguts en aquesta tesi han posat de manifest que aquests transportadors, a més de ser necessaris per mantenir les vies de recuperació o salvage podrien jugar un paper en la senyalització cel·lular. Així el transportador d'alta afinitat d'adenosina CNT2, mitjançant una relació entre el transport d'adenosina i la regulació de l'AMPK, podria participar en la complexa regulació del metabolisme energètic. / Plasma membrane transporters play a crucial role in the function of absorptive epithelia, since they mediate intestinal absorption and renal reabsorption and the secretion of numerous physiological and pharmacological compounds. Among these transport systems, nucleoside transporters are responsible for the uptake of natural nucleosides and most nucleoside-derived drugs. There are two main families of nucleoside transporters, concentrative (CNT) and equilibrative (ENT) transporters and most mammalian cells, as epithelial intestinal cells, coexpress several nucleoside transporters isoforms. In the present study, we have fully characterized the expression pattern of nucleoside transporters in two intestinal epithelial cell lines, IEC-6 and Caco-2 cells. We have analysed the regulation of these membrane transporters in IEC-6 cells upon exposure either differentiating or proliferative agents. We conclude that differentiation of intestinal epithelial cells is accompanied by an increase mature enterocytes features, such concentrative nucleoside transport (located at the brush border membrane), thus preparing the cell for its ultimate absortive function. On the contrary, proliferative stimulus up-regulate the equilibrative nucleoside transporter ENT1, known to be located at the basolateral membrane, allowing the uptake of nucleoside from the bloodstream for the increase demands of the proliferating cell. However, nucleoside transporter may not only respond to the requirement for nucleoside salvage but may also but may also play a role in cell signaling. In fact, the study shows that physiological concentrations of adenosine activate AMPK through a mechanism that requires its transport into the cell and subsequent phosphorylation, resulting in phosphorylation of the downstream AMPK target ACC. This effect is mostly dependent on the high-affinity concentrative adenosine transporter CNT2. Thus, CNT2 may therefore be considered a novel player in the complex regulation of AMPK and energy metabolism.

Las mutaciones en el factor de transcripción HNF1a son la causa más frecuente de diabetes tipo MODY. HNF1a está implicado en una compleja red transcripcional responsable de la diferenciación y función de la célula beta. El estudio de modelos genéticos deficientes para HNF1a será pues de gran relevancia para la comprensión de las bases moleculares de la diabetes MODY y del programa transcripcional responsable del desarrollo de la célula beta, pero también de manera más general, para estudiar como un activador regula la transcripción. El objetivo de este trabajo de tesis es pues emplear diferentes modelos genéticos para comprender aspectos funcionales de HNF1a en un contexto celular in vivo.En una primera parte, nos planteamos responder dónde, cuándo y cúanto HNF1a es necesario para ejercer su función en la célula beta. Diseñamos un modelo de expresión de HNF1a específico de célula beta e inducible por tetraciclina. El sistema sobreexpresaba HNF1a en células beta, lo que inhibía el ciclo celular e inducía apoptosis reduciendo progresivamente la masa de célula beta que acababa derivando en diabetes. Como la inducción de HNF1a en células beta era heterogénea pudimos comprobar que la función de HNF1a tiene autonomía celular y es rescatable postnatalmente sólo en aquellas células deficientes para HNF1a que reexpresaban HNF1a a niveles casi fisiológicos. Concluyendo, en esta primera parte del proyecto se demostró que HNF1a puede ejercer su función en células beta expresándose sólo en células beta, que esta función no está restringida a un momento determinado del desarrollo embrionario y que es altamente dependiente de los niveles de expresión, puesto que tanto mutaciones en heterocigosidad como la sobreexpresión causan diabetes. Estos resultados tienen importantes implicaciones en el diseño de terapias génicas para la cura de la diabetes MODY y en el desarrollo de protocolos de diferenciación in vitro de células beta para su posterior transplante. Así mismo llama la atención sobre los peligros de sobreexpresar factores de transcripción en células beta.En la segunda parte, nos planteamos cómo regula HNF1a la transcripción. Un nuevo nivel de regulación de la transcripción está emergiendo, el posicionamiento génico en subdominios nucleares en fución de la actividad transcripcional. Por otro lado se sabe que HNF1a induce la acetilación de los promotores de sus genes diana. El objetivo de esta segunda parte es estudiar como HNF1a influye las modificaciones de histona a nivel local de cromatina y el reposicionamiento génico en el espacio nuclear para establecer así la relación entre estos dos niveles de regulación de la transcipción. Mediante el uso de un modelo deficiente para HNF1a, demostramos que HNF1a induce la metilación en H3-Lys4 e impide la metilación en H3-Lys27 de sus genes diana. Así mismo estas modificaciones de histona se distribuyen no aleatoriamente en el espacio nuclear formando subdominios. HNF1a induce el reposicionamiento selectivo de sus loci diana de dominios ricos en H3-trimetil Lys27 a dominios activadores ricos en RNA polimerasa II y H3-dimetil Lys4, en concordancia con los cambios observados localmente. Concluyendo, en esta segunda parte demostramos por primera vez que el posicionamiento génico puede ser dependiente de un activador y que afecta selectivamente al locus diana. También demostramos por primera vez que las modificaciones de histona que regulan la transcripción localmente a nivel de la cromatina también tienen una representación espacial en el núcleo de manera que los genes se posicionan en dominios ricos en determinadas modificaciones de histona en función de su actividad transcripcional. Este trabajo de tesis tiene importantes implicaciones en la comprensión de las bases moleculares de una enfermedad humana y añade nuevas perspectivas al estudio de la función de un activador transcripcional. / Mutations in the transcription factor HNF1a are the major cause of MODY type diabetes. HNF1a is implicated in a complex transcriptional network responsible for beta-cell development and function. The study of genetic models deficient for that activator would not only be useful for understanding the molecular bases of a human disease, but also for the study of the transcriptional network implicated in the differentiation of beta-cells and the study of how transcription is actually regulated.The aim of this project of thesis was to understand the function in vivo of HNF1a in beta-cells using genetic models.In the first part, we aimed to assess when, where and how much HNF1a is needed in the beta-cell to be functional. For that purpose, we used a conditional and cell-specific model that overexpressed HNF1a only in beta-cells and in the absence of tetracycline. We demonstrated that the function of HNF1a in beta-cells is cell-autonomous, can be rescued postnatally and is tightly dependent on its expression levels, since both mutations in heterozygosity and overexpression lead to diabetes. These results have important implications in the development of gene therapies for MODY3 patients and for the establishment of good protocols for beta-cell differentiation in vitro for transplantation. This study also highlights the risk of misexpressing transcriptions factors in beta-cells. In the second part, we aimed to understand how HNF1a regulates transcription using an HNF1a-deficient model. HNF1a induces changes locally at the chromatin level by preventing the methylation of H3-Lys27 and inducing the acetylation and methylation of H3-Lys4 of its targets nucleosomes. HNF1a also induces the repositionning of its target loci from H3-methyl Lys27 rich domains to active RNA polymerase II and H3-methyl Lys4 rich domains in the nuclear space, concordantly with the changes observed locally. Thus, for the first time we show that an activator can locus-selectively determine the subnuclear positioning of its targets and that histone modifications have a functional representation in the nuclear space. This thesis add novel insights to our understanding of the in vivo function of a transcriptional activator, and for the first time link subnuclear gene repositioning to a human transcriptional disease.

La imposibilidad de erradicar el virus de la immunodeficiencia humana (VIH-1) del organismo humano con las pautas terapéuticas de alta eficacia (TARGA), la adherencia a pautas terapéuticas complejas y el riesgo a una importante toxicidad farmacológica aguda y crónica, son los principales problemas en la administración prolongada de los fármacos antirretrovirales. Es iminente la necesidad de diseñar nuevas estrategias de tratamiento y en este sentido se han desarrollado las terapias inmuno-mediadas, siendo un ejemplo las interrupciones estrucutradas del tratamiento (IET), dirigidas a controlar la replicación del VIH en base a la recuperación de la respuesta inmune específica. Con estos antecedentes, el estudio virológico de la dinámica y evolución del VIH a lo largo de las diferentes interrupciones estructuradas del tratamiento, permitirá un mejor conocimiento de los cambios observados en la replicación viral durante el periodo de las IET, ya sea debido a factores inmunológicos, virológicos o ambos, para ello se determinó la dinámica viral durante las IET y su relación con la respuesta celular T VIH-1 específica en un grupo de pacientes sometidos a IET, en un grupo de pacientes sometidos a IET y un immunomodulador, la hidroxiurea y en un un grupo de pacientes sometidos a IET y un inmunosupresor, el ácido micofenólico. También se realizó un estudio de evolución del virus en el primer grupo de pacientes. Por último, el estudio de las mutaciones de resistencia en estos pacientes ayudarán a determinar el riesgo que puede comportar la aplicación de esta terapia a la práctica clínica.Los resultados obtenidos en el análisis de la dinámica viral fueron que en todos los pacientes se observó un rebrote de la carga viral en cada una de las interrupciones del tratamiento. Cabe destacar que se observaron atenuaciones significativas en el rebrote de la carga viral a lo largo de las IET.Un 25% de los pacientes mantuvieron valores de estabilización del la carga viral <5000 copias/ml durante una media de 52 semanas de la última interrupción, en los que se observó un incremento de la respuesta celular inmune específica frente al VIH-1. En la totalidad de los pacientes se consiguieron cargas virales indetectables una vez reintroducido el tratamiento.En los resultados obtenidos en la evolución genética del virus a lo largo de las IET no se observó una tendencia a la homogenización de las cuasiespecies virales. No se observaron diferencias significativas en la variabilidad genética entre los virus de pacientes con capacidad o no de neutralizar la replicación viral. En cambio si se detectó la reactivación con la consiguiente reemergencia de provirus ancestrales en el rebrote de carga viral como consecuencia de la interrupción del tratamiento. Al estudiar el riesgo de selección de mutaciones de resistencia durante las IET se observó que un 26% de los pacientes presentaban mutaciones, de los cuales la mitad los seleccionaron de novo durante el periodo de las IET. De estos pacientes un 23% presentaron mutaciones de novo a los inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (ITIANN), 12% a los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN). No se detectaron mutaciones de resistencia a los inhibidotes de la proteasa (IP).El riesgo de selección de las mutaciones de resistencia fue superior a los ITIANN debido a la larga vida media de estos fármacos, hecho que se debe tener en cuenta cuando se realiza este tipo de estrategia terapéutica.