Il est maintenant reconnu que la ségrégation latérale des composants de la membrane plasmique, ou compartimentation membranaire, joue un rôle important dans la régulation de la fonction de nombreuses protéines membranaires. Les tétraspanines constituent une famille de protéines intégrales à quatre régions transmembranaires possédant une capacité unique à s’associer entre elles et avec des nombreuses autres molécules de surface pour former un réseau d'interactions moléculaires, le « tetraspanins web ». Il a été proposé que via l’organisation de ce réseau, les tétraspanines joueraient un rôle dans la compartimentation membranaire des protéines auxquelles elles s’associent. Elles jouent également un rôle dans la compartimentation cellulaire en contrôlant le trafic de certaines des protéines associées. Le laboratoire a précédemment démontré que six tétraspanines conservées (Tspan5, 10, 14, 15, 17 et 33) de la sous-Famille des TspanC8 (caractérisées par la présence de huit cystéines dans le grand domaine extracellulaire) interagissent directement avec la métalloprotéase ADAM10 et régulent sa sortie du réticulum endoplasmique. Cette protéase ancrée à la membrane est responsable du clivage protéolytique de l'ectodomaine de diverses molécules de surface et est indispensable pour l'activation de la voie de signalisation NOTCH. Nous démontrons que Tspan5 et Tspan14 sont des régulateurs positifs de la voie de signalisation Notch et que Tspan15 est un régulateur négatif, agissant en amont de la γ-Sécrétase. Cette régulation négative est associée à un changement d’environnement membranaire ainsi qu’à une dynamique différente d’ADAM10 comme le montre un suivi de la protéase à l’échelle de la molécule unique. Par ailleurs, l’analyse par spectrométrie de masse quantitative a montré que la capacité d’ADAM10 à s’associer à des composants connus du réseau de tétraspanines était influencée par son interaction avec ces tétraspanines. Enfin, nous avons identifié une région de la cellule enrichie en CD9 qui contenait également ADAM10 lorsque Tspan5 est exprimée, mais ce n’est pas le cas avec Tspan15. Cette étude démontre que les différentes TspanC8 influencent différemment la capacité d’ADAM10 à cliver certains de ses substrats et illustre la capacité des tétraspanines à réguler l’activité de leurs protéines partenaires en contrôlant leur compartimentation membranaire. / It is now recognized that the lateral segregation of components of the plasma membrane or membrane compartmentalization, play an important role in the regulation of many membrane proteins functions. Tetraspanins are a family of integral membrane proteins with four transmembrane domains with a unique ability to associate with one another and with many other surface molecules to organize a molecular interactions network, the “tetraspanins web”. It was suggested that via the organization of this network, the tetraspanin play a role in membrane compartmentalization of proteins to which they associate. Tetraspanins also play a role in cellular compartmentalization by controlling the trafficking of some associated proteins. In the lab, it has been shown that six conserved tetraspanin (Tspan5, 10, 14, 15, 17 et 33) of the TspanC8 subgroup (characterized by the presence of eight cysteines in the large extracellular domain) interact directly with the metalloproteinase ADAM10 et mediates its exit from the endoplasmic reticulum. This membrane-Anchored metalloprotease mediated ectodomain shedding of various integral molecules and is essential for Notch signaling pathway activation. We demonstrate that both Tspan5 and Tspan14 are positive regulators of Notch signaling pathway, whereas Tspan15 appears as negative regulator, acting in upstream γ-Secretase. This downregulation is associated with a modification of membrane environment as well as different dynamics of ADAM10, as shown by monitoring of protease using single molecule tracking. Furthermore, quantitative mass spectrometry analysis revealed that ADAM10 ability to associate with known components of “tetraspanin web” was influenced by its interaction with these tetraspanins. Finally, we have identified a CD9 enriched cell area which also contained ADAM10 when Tspan5 is expressed but not with Tspan15.This study demonstrates that different TspanC8 influence differently the ADAM10 ability to cleave some of its substrates and illustrate the ability of tetraspanins to regulate the activity of their proteins partners by controlling their membrane compartmentalization.

Le Virus de l’Hépatite C (HCV) est un problème majeur de santé publique qui touche plus de 170 millions de personnes dans le monde. Le HCV cible essentiellement les hépatocytes où il effectue son cycle de réplication qui peut-être divisé en trois étapes majeures : l’entrée de la particule virale qui aboutit à la libération de l’ARN viral dans le cytoplasme, la traduction/réplication du génome viral et l’assemblage/sécrétion des particules néosynthétisées. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés à l’étape d’entrée qui est un processus complexe multiséquentiel faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires. Le virus se lie d’abord à la surface cellulaire via des facteurs d’attachement puis interagit avec des facteurs d’entrée spécifiques tels que la tétraspanine CD81, le récepteur scavenger B1 et les protéines de jonctions serrées CLDN-1, -6, -9 et OCLN. La particule virale est ensuite internalisée via une endocytose dépendante de la clathrine, puis sous l’action du pH acide des endosomes les enveloppes virale et cellulaire fusionnent permettant la libération de la capside virale dans le cytoplasme de la cellule infectée. Parmi les facteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du HCV, deux protéines de la famille des tétraspanines ont été identifiées, CD81 et CD63. Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires capables de former des microdomaines enrichis en tétraspanines en interagissant entre elles ainsi qu’avec des protéines dites partenaires. Nous avons testé l’implication dans l’entrée virale des tétraspanines exprimées dans les hépatocytes. Ainsi, nous avons montré que CD151 semble également important pour l’entrée du HCV. CD151 aurait un rôle indirect sur l’entrée en jouant sur l’organisation membranaire, en empêchant CD81 de former des clusters qui restreignent l’entrée du virus. Nous avons aussi étudié le rôle que pouvait jouer les polymorphismes de facteurs d’entrée sur l’entrée virale. Sur une cohorte de patients toxicomanes infectés par le HIV mais non infectés par le HCV, deux mutations ont été identifiées, R209Q dans CLDN-6 et P24A dans OCLN, qui n’étaient pas présentes dans les populations contrôles ou coinfectées par le HCV. Chez les patients toxicomanes, il est très rare que les patients infectés par le HIV ne le soient pas par le HCV, suggérant une résistance naturelle de ces patients à l’infection. Nous avons émis l’hypothèse que ces deux mutations pouvaient bloquer l’entrée du HCV. Cependant, la caractérisation de ces mutations a montré qu’elles n’avaient pas d’effet fonctionnel in vitro. Enfin, nous avons exploré l’effet de la Monensine, un ionophore polyéther, sur l’infection par le HCV. Cette molécule augmente le pH des endosomes via ses capacités de transfert d’ions à travers les membranes cellulaires. Nous avons montré qu’elle inhibe l’entrée du HCV en bloquant la fusion. De manière intéressante, la transmission cellule-cellule, un mécanisme d’entrée du virus encore mal caractérisé, était également bloquée par la Monensine, suggérant une étape de fusion dépendante du pH pour cette voie. Nous avons généré des mutants de résistance à la Monensine, notamment le clone FL-8 qui portait deux mutations dans les glycoprotéines d’enveloppe, Y297H dans E1 et I399T dans E2. Les particules virales portant ces deux mutations infectaient les cellules de manière indépendante du pH, présentaient des propriétés physicochimiques différentes et ne se transmettaient plus de cellule à cellule. En conclusion ces études soulignent l’importance de l’organisation membranaire pour l’entrée du virus via certains facteurs cellulaires tels que CD151. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la transmission cellule-cellule était dépendante du pH et que des mutations ponctuelles dans E1 et E2 permettent une fusion indépendante du pH. En revanche, des polymorphismes naturels de CLDN-6 et OCLN n’affectent pas leur capacité à supporter l’entrée virale. / Hepatitis C Virus (HCV) is a global health problem with over 170 million infected people worldwide. HCV targets mainly the hepatocytes and its lifecycle is divided into three steps. Viral particle entry leads to the release of viral genomic RNA into the cytoplasm where translation and replication take place. Then, new viral particles are assembled and secreted. During my thesis, we focused on the entry step. Indeed, HCV entry is a complex multistep process that requires numerous cellular factors. First, the virus interacts with attachment factors and then interacts with specific cellular factors including the tetraspanin CD81, the scavenger receptor B1 and the tight junction proteins CLDN-1, -6, -9 and OCLN. The viral particle is next internalized through a clathrin-dependent endocytosis. Finally, fusion at low pH occurs between viral and endosomal membranes leading to the release of the capsid into the cytoplasm. Among cellular factors involved in HCV entry, two members of the tetraspanin superfamily were identified, CD81 and CD63. Tetraspanins are transmembrane proteins able to organize themselves in tetraspanin-enriched microdomains through tetraspanin-tetraspanin interactions and interactions with partner proteins. We tested the involvement in HCV entry of tetraspanins expressed in hepatocytes. Interestingly, we showed that CD151 is also involved in HCV entry. CD151 seems to play an indirect role in HCV entry through regulating membrane organization, especially by preventing CD81 clustering, which is unfavourable to HCV entry. We also studied the effect of some entry factors polymorphisms on viral entry. In a cohort of drug users infected by HIV but not by HCV, we identified two mutations, R209Q in CLDN-6 and P24A in OCLN, not found in control or coinfected patients. It is very rare for drug users patients infected by HIV not to be infected by HCV, suggesting a natural resistance of these patients to HCV infection. We hypothesized that the two mutations identified might impair HCV entry. However, the characterization of these mutations showed that they did not have a functional effect in vitro. Finally, we investigated the effect of Monensin, a polyether ionophore, on viral entry. This molecule increases endosomal pH through its ions transfer properties across cell membranes. We showed that Monensin inhibits HCV entry through impairing the fusion step. Interestingly, HCV cell-to-cell transmission, another poorly characterized entry pathway, was also blocked by Monensin, suggesting that a pH-dependent fusion step is also required for this transmission route. We generated resistant mutants to Monensin, notably the FL-8 mutant carrying two mutations in envelope glycoproteins, namely Y297H in E1 and I399T in E2. Viral particles expressing these two mutations infected cells in a pH-independent manner, displayed different biophysical properties and were not cell-to-cell transmitted. To conclude, these studies highlight the importance of membrane organization for viral entry through cell factors like CD151. We also pointed out that cell-to-cell transmission is a pH-dependent process. In addition, point mutations in E1 and E2 are sufficient to enable HCV to be pH-independent for its entry. However, polymorphisms in CLDN-6 and OCLN seem to have no effect on viral entry.

Ce travail porte sur la tétraspanine Co-029/Tspan8 et son rôle dans la progression tumorale dans le cancer du côlon. Les tétraspanines constituent une famille de glycoprotéines membranaires qui ont la propriété de s’associer directement à d’autres protéines membranaires pour former des complexes primaires. Ces complexes primaires s’assemblent ensuite pour former des complexes d’ordre secondaire réalisant ainsi une compartimentation membranaire, appelée « Tetraspanin Web » ou microdomaines enrichis en tétraspanines. De nombreuses études cliniques et expérimentales ont établi une corrélation entre le niveau d'expression de certaines tétraspanines et la progression tumorale, notamment la formation de métastases.L’objectif de ce travail était de faire avancer la compréhension du mécanisme par lequel la tétraspanine Co-029/Tspan8 peut moduler l’action d’autres molécules de surface comme des récepteurs de facteurs de croissance ou des molécules d’adhérence sur la migration cellulaire, nécessaire à l’invasion et au processus métastatique. Nous avons utilisé comme outils cellulaires, des lignées n’exprimant pas ou peu de Co-029/Tspan8 et les mêmes lignées transduites exprimant fortement cette tétraspanine. Nous avons identifié de nombreux partenaires de Co-029/Tspan8 par co-immunoprécipitation, pontage covalent et spectrométrie de masse (SM), en particulier EGFR, CD44 et ECE1.L’EGFR dans les cellules inhibe la migration cellulaire seulement quand Co-029/Tspan8 est exprimé, ce qui a été démontré par l’inhibition d’expression par ARN interférence ou l’utilisation des inhibiteurs de l’EGFR comme AG-1478 ou le Cetuximab. Cet effet est supprimé soit par la double inhibition d’EGFR et Co-029/Tspan8 ou par traitement simultané avec l’anticorps anti-Co029. Nous avons observé, d’une part une nette augmentation de l’association d’EGFR aux complexes à tétraspanines en présence de Co-029/Tspan8 et, d’autre part une augmentation de la phosphorylation d’EGFR (pEGFR) suggérant un mécanisme possible impliquant la signalisation de ce récepteur.Nous avons également observé que l’effet de CD44 sur la migration de cellules isolées est dépendante de Co-029/Tspan8. Comme de nombreux types de tumeurs, ainsi que leurs métastases expriment des niveaux élevés de variants de CD44 tels que le cancer gastro-intestinal ou le cancer du sein, nous avons étudié les isoformes de CD44 associées au Co-029/Tspan8. Nous avons retrouvé les peptides des exons variables v8-v10 de CD44 par immunoprécipitation de CD44 sur notre modèle cellulaire exprimant Co-029/Tspan8 après analyse en spectrométrie de masse. CD44 v8-v10 correspond à des produits des 3 derniers exons de la région variable de CD44. D’autre part, pour étudier si l'effet de CD44 pouvait être médié par une interaction avec EGFR, nous avons mesuré le niveau de pEGFR dans les cellules traitées par ARN interférence ciblant CD44. Nous avons observé qu’une réduction de l'expression de CD44 était accompagnée d’une réduction de 50% de pEGFR spécifiquement dans les cellules exprimant Co-029/Tspan8.Finalement, l’analyse des complexes à tétraspanines en spectrométrie de masse nous a permis de découvrir un nouveau partenaire de Co-029/Tspan8, l’enzyme de conversion de l’endothéline de type 1 (ECE1). Il s’agit d’une une enzyme membranaire de la famille des métallopeptidases à Zn qui génère la forme active de l’endothéline. Il est exprimé dans différents types de cancer et est associé à un phénotype invasif. Sa présence dans les complexes à tétraspanines dépend de Co-029/Tspan8 et cette association augmente son activité de clivage de la Big-endothéline, précurseur de l’endothéline. Nous avons étudié la relation fonctionnelle entre Co-029/Tspan8 et ECE1 dans des tissus digestifs normaux en comparant des souris sauvages et des souris dont nous avons inactivé le gène Co-029/Tspan8. / This work deals with the tetraspanin Co-029/Tspan8 and its role in tumor progression in colon cancer. Tetraspanins are a family of glycoproteins that have the property to associate directly with other membrane proteins to form primary complexes. These primary complexes then assemble into secondary order complexes realizing a membrane compartmentalization, called "Tetraspanin Web " or Tetraspanins Enriched Microdomains. Numerous clinical and experimental studies have established a correlation between the expression level of certain tetraspanins and tumor progression, including metastasis.The objective of this work was to advance the understanding of the mechanism by which the tetraspanin Co-029/Tspan8 can modulate the action of other surface molecules such as receptors for growth factors or adhesion molecules on cell migration, required for invasion and metastasis. We use as cellular tools, lines expressing little or no Co-029/Tspan8 and the same transduced cell lines strongly expressing this tetraspanin. We have identified several partners for Co-029/Tspan8 by co-immunoprecipitation, cross-linking and mass spectrometry (MS), particularly EGFR, CD44 and ECE1.EGFR expression in cells inhibits cell migration only when Co-029/Tspan8 is expressed, which was demonstrated by the inhibition of expression by RNA interference or the use of EGFR inhibitors such as AG-1478 or cetuximab. This effect is reversed either by dual inhibition of EGFR and Co-029/Tspan8 or by co-treatment with anti-Co029 antibody. We have observed, on the one hand a marked increase in the association of EGFR with tetraspanins complexes in the presence of Co-029/Tspan8 and, secondly an increase in the phosphorylation of EGFR (pEGFR) suggesting a mechanism linked to signaling of this receptor.We also observed that the CD44 effect on migration of isolated cells is dependent on Co-029/Tspan8. As many types of tumors and their metastases express high levels of CD44 variants such as gastrointestinal cancer or breast cancer, we studied CD44 isoforms associated with the tetraspanin Co-029/Tspan8. We found the peptides variable exons v8-v10 of CD44 by immunoprecipitation of CD44 in our cellular model expressing Co-029/Tspan8 after mass spectrometry analysis. CD44 v8-v10 corresponds to products of the last 3 exons of the variable region of CD44. On the other hand, to investigate whether the effect of CD44 could be mediated by interaction with EGFR, we measured the level of pEGFR in cells treated by RNA interference targeting CD44. We observed that a reduction in CD44 expression was accompanied by a 50% reduction of pEGFR specifically in cells expressing Co-029/Tspan8.Finally, the analysis of tetraspanin complexes by mass spectrometry allowed us to find a new partner of Co-029/Tspan8, the type 1 endothelin-1 converting enzyme (ECE1). It is a membrane enzyme of the family of Zn dependent metallopeptidases which generates the active form of endothelin. It is expressed in various types of cancer and is associated with an invasive phenotype. Its presence in the tetraspanin complexes depends on the presence of Co-029/Tspan8 and this association increases its cleavage activity of Big-endothelin, the endothelin precursor. We investigated the functional relationship between Co-029/Tspan8 and ECE1 in normal digestive tissues by comparing wild-type mice and mice in which we inactivated the Co-029/Tspan8 gene.

Les mécanismes moléculaires d'assemblage et de bourgeonnement des virus tels que le VIH-1 dans les cellules infectées sont encore relativement mal connus. Toutefois, il semble établi que la multimérisation de la protéine Gag s'effectue à la membrane plasmique et que le bourgeonnement des particules virales a lieu au niveau de zones enrichies en tétraspanines. Ces protéines transmembranaires forment un réseau d'interactions protéiques à la surface de la cellule et s'organisent en microdomaines différents des radeaux lipidiques, bien qu'enrichis en cholestérol.En utilisant la technique de suivi de molécules uniques fluorescentes sur des cellules HeLa exprimant la protéine Gag, l'objectif de mon travail de thèse était d'abord de déterminer l'influence de l'assemblage et le bourgeonnement de pseudoparticules virales sur la dynamique et la répartition membranaires des tétraspanines CD9 et CD81. Nos résultats renforcent l'émergence d'un nouveau concept, selon lequel les composants cellulaires et viraux, plutôt que de se regrouper au niveau de plateformes membranaires préexistantes, s'organisent en structures de taille croissante où les tétraspanines sont peu à peu concentrées avec leurs partenaires pour former une architecture propice à l'assemblage et la sortie du VIH-1.Par ailleurs, nous avons montré que CD81 était plus confiné et moins dynamique que CD9 et avons donc étudié les mécanismes moléculaires expliquant cette différence de comportement membranaire. L'utilisation du pistage en molécule unique couplé à des marquages d'ensemble, l'emploi de protéines chimériques et de drogues spécifiques ont permis de révéler que la dynamique membranaire de CD81 est restreinte par le réseau d'actine, via l'ezrine, mais implique aussi EWI-2 et CD9P-1, deux partenaires membranaires de CD9 et de CD81. Enfin, cette étude montre que cette interaction avec le cytosquelette est impliquée dans le recrutement de CD81 et indirectement de CD9, lors de l'assemblage du VIH. / Molecular mechanisms of assembly and budding of HIV-1 particles in infected cells are still a matter of debate. However it is now well established that Gag assembly occurs at the plasma membrane and that budding involves tetraspanin-enriched areas. Tetraspanins are transmembrane proteins that form a network of protein interaction at the cell surface organized into microdomains enriched in cholesterol but distinct from rafts.Using single molecule tracking of fluorescent markers with Gag-expressing HeLa cells, the aim my PhD thesis was first to determine the influence of Gag assembly and budding of pseudo particles on the dynamics and partitioning of the tetraspanins CD9 and CD81 at the plasma membrane. Our results support an emerging concept that cellular and viral components, instead of clustering at preexisting microdomains or platforms, direct the organization of growing structures where tetraspanins are more and more concentrated with their partners, in order to form a membrane scaffold that helps HIV-1 assembly and egress.In a second work, we showed that CD81 is more confined and less dynamic than CD9, and tried to clarify the molecular mechanisms involved in this differential behavior at the plasma membrane. Single molecule tracking, in addition to ensemble labeling experiments, CD9/CD81 chimeric proteins, as well as specific drugs, demonstrated that CD81 membrane dynamics is restricted by the actin network through ezrin proteins, but also implicates EWI-2 and CD9P-1, primary partners of CD9 and CD81. Finally, this study reveals that this interaction with the cytoskeleton is in part responsible of the recruitment of CD81 and indirectly of CD9 during HIV-1 assembly.

Les ADAMs forment une sous-famille d’enzymes appelées “métalloprotéases”. Elles sont impliquées dans de nombreux processus aussi bien physiologiques que pathologiques de par leur capacité à cliver un certain nombre de substrats tels que des facteurs de croissance, des cytokines ou des protéines d’adhérence. Malgré de nombreuses études sur l’activité des ADAMs, on ne connaît que très peu d’éléments de leur régulation.Les tétraspanines constituent une super-famille de protéines membranaires ayant en commun une structure particulière. Elles sont impliquées dans un grand nombre de processus biologiques fondamentaux tels que la migration, les interactions intercellulaires, la réponse immunitaire, la fusion des gamètes… Les tétraspanines interagissent non seulement entre elles mais aussi avec un certain nombre de partenaires protéiques à la membrane plasmique, formant ainsi un réseau multi-moléculaire appelé « réseau de tétraspanines » ou « tetraspanin web ». Les travaux précédents de notre laboratoire ont montré que la métalloprotéase ADAM10 est associée au réseau de tétraspanines. Cependant, la tétraspanine en association directe avec ADAM10 permettant à cette dernière d’être incluse dans le réseau n’avait jusqu’ici pas été identifiée.Tout d’abord, afin d’établir un modèle permettant une mesure de la modulation de l’activité d’ADAM10 par les tétraspanines, nous avons démontré que l’engagement des tétraspanines par des anticorps monoclonaux augmente le clivage d’E-cadhérine par ADAM10. De plus, l’activation d’un récepteur muscarinique à l’acétylcholine permet aussi une augmentation du clivage d’E-cadhérine mais de manière ADAM17-dépendante cette fois. La transactivation de l’EGFR n’est pas impliquée dans la régulation muscarinique du clivage de l’E-cadhérine alors que l’activation directe de l’EGFR par un de ses ligands conduit, elle, à une stimulation de ce clivage.Revenant à notre quête initiale des conséquences de l’interaction entre ADAM10 et les tétraspanines, nous avons démontré que la métalloprotéase ADAM10 interagit avec l’ensemble des membres de la sous-famille de tétraspanines à 8 cystéines « TspanC8 » regroupant Tspan5, Tspan17, Tspan14, Tspan15, Tspan10 et Tspan33. Ces interactions ainsi que l’expression relative de chacun des membres des TspanC8s influent sur la sortie d’ADAM10 du réticulum endoplasmique. ADAM10 et son interaction avec les TspanC8s sont conservées dans l’Evolution et jouent un rôle dans la régulation de la voie de signalisation Notch. Lorsque nous avons examiné plus en détail l’interaction entre la tétraspanine Tspan5 et ADAM10, nous avons découvert qu’elle avait un effet négatif sur les expressions membranaires et totales d’ADAM10. De plus, cette interaction semble impliquée dans la prolifération de la lignée cellulaire PC3 dérivée de cancer de la prostate. En effet, la surexpression de Tspan5 cause une croissance diminuée de cette lignée. Cette inhibition semble due à un ou plusieurs facteurs solubles qui pourraient être sécrétés moins efficacement par les cellules surexprimant Tspan5 que par leurs homologues sauvages. Egalement, de manière inattendue, les cellules PC3 surexprimant Tspan5 sont totalement insensibles aux drogues ciblant le récepteur à tyrosine-kinase EGFR alors que la croissance des PC3 sauvages est très réduite après de tels traitements. Ceci impliquant donc que la croissance de ces dernières est au moins partiellement dépendante de la signalisation EGFR. Enfin, nous montrons qu’un autre récepteur à tyrosine-kinase appelé EphA2 pourrait avoir un rôle important dans la régulation de la dépendance à la signalisation EGFR des cellules PC3. / ADAMs are a sub-family of enzymes called “metalloproteases” which are implicated in a variety of physiological as well as pathological processes through their ability to cleave a number of substrates including growth factors, cytokines or adhesion proteins. Despite numerous studies on ADAM activity, very little is known about their regulation.Tetraspanins form a super-family of membrane proteins with a common conserved structure. They are implicated in numerous biological processes including migration, intercellular interactions, immune response, gamete fusion… Tetraspanins are known to interact with one another and with a restricted number of protein partners at the cell surface, thus forming a multi-molecular network referred to as « the tetraspanin web ». Previous studies in our laboratory have shown that the metalloprotease ADAM10 is associated to the tetraspanin web. Nevertheless, the tetraspanin in direct interaction with ADAM10 enabling it to be part of the web was not identified at the time. To begin with, in order to establish a model providing a read-out for a modulation of ADAM10 activity by tetraspanins, we demonstrate that tetraspanin engagement by monoclonal antibodies enhances E-cadherin shedding by ADAM10. Furthermore, muscarinic receptor activation also augments E-cadherin shedding but this time in an ADAM17-dependent manner. This occurs without the intervention of EGFR transactivation whereas a direct EGFR activation is able to stimulate E-cadherin shedding. Refocusing on the initial subject of the consequences of an interaction between ADAM10 and the tetraspanins, we conclusively show that the metalloprotease ADAM10 interacts with members of the conserved TspanC8 subfamily consisting of tetraspanins Tspan5, Tspan17, Tspan14, Tspan15, Tspan10 and Tspan33. These interactions and the relative expression of each of the TspanC8 members play a role in ADAM10 trafficking. ADAM10 and TspanC8 interactions are conserved throughout the Evolution and play a role in Notch signaling pathway regulation. When we examined in more details the particular interaction between the tetraspanin Tspan5 and ADAM10, we discovered that it had a negative effect on ADAM10 membrane as well as total expression. Moreover, this interaction seems to have implications on prostate cancer PC3 cell proliferation as Tspan5 overexpression causes a diminished growth rate. This inhibition could be caused by one or more soluble factors which could be less secreted by cells overexpressing Tspan5 than wild-type counterparts. Furthermore, oddly enough, PC3 cells overexpressing Tspan5 were completely unaffected by drugs targeted against the tyrosine-kinase receptor EGFR whereas this type of treatment impaired PC3 WT cell growth which therefore seems at least partly dependent on EGFR signalling. Finally, we reveal that another tyrosine-kinase receptor called EphA2 could play the proeminent role of regulating EGFR signalling-dependence in PC3 cells.

L’importance des activités protéolytiques associées à la membrane plasmique dans divers processus biologiques fondamentaux est de mieux en mieux définie. Les protéases de la famille ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), et ADAM10 en particulier, ont suscité un intérêt tout particulier du fait de l’importance de leurs substrats (récepteur de l’EGF, TNFα, Notch, APP…). Néanmoins, peu d’études se sont intéressées aux mécanismes régulant le trafic d’ADAM10.Les tétraspanines sont une super-famille de protéines de surface impliquées dans de nombreux processus biologiques fondamentaux parmi lesquels la migration, les interactions intercellulaires, la réponse immunitaire, la fusion des gamètes… L’une des caractéristiques majeure des tétraspanines est leur capacité à organiser un réseau d’interactions moléculaires appelé le « tetraspanin web ». De précédentes études menées dans le laboratoire ont montré qu’ADAM10 est associé au « tetraspanin web ». Néanmoins, la tétraspanine en interaction directe avec ADAM10 permettant son association au réseau n’est pas encore connue. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la régulation d’ADAM10 par les tétraspanines. Nous avons ainsi pu identifier une sous-famille de tétraspanines à 8 cystéines, les TspanC8 (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 et Tspan33), comme étant capables d’interagir directement avec ADAM10 et de réguler sa sortie du réticulum endoplasmique. Nous avons montré que Tspan5, Tspan14, Tspan15 et Tspan33 sont capables de réguler l’expression de surface d’ADAM10 et que Tspan10 et Tspan17 entrainent l’accumulation d’ADAM10 dans un compartiment endosomal tardif. Les TspanC8 pourraient également contribuer à la régulation de la spécificité de substrat d’ADAM10 puisque nous avons montré que l’expression des TspanC8 humaines Tspan5 et Tspan14 augmente l’activation de la voie Notch alors que Tspan15 n’a pas d’effet. Par ailleurs, les TspanC8 de Drosophile sont capables d’interagir directement avec Kuzbanian (l’orthologue d’ADAM10), permettent son accumulation à la surface cellulaire et régulent l’activation de la voie Notch dans différents contextes développementaux. Nous proposons que les TspanC8 soient une nouvelle famille de protéines ayant une fonction très conservée dans la régulation de l’activité et du trafic d’ADAM10, capables de réguler l’activation de la voie Notch. / Increasing evidence suggests a critical implication of membrane-associated protease activities in numerous biological processes. ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) proteases, and especially ADAM10, are of particular interest because of the importance of their substrates (EGF receptor, TNF α, Notch, APP…). However, few studies focus on the mechanisms of ADAM10 trafficking. Tetraspanins are a super-family of proteins implicated in numerous biological processes including migration, intercellular interactions, immune response, gamete fusion… One of the most striking features of tetraspanins is their ability to organise multi-molecular complexes called « Tetraspanin Web ». Previous studies in the laboratory have shown that ADAM10 is associated to the « Tetraspanin Web ». Nevertheless, the tetraspanin in direct interaction with ADAM10 that drives its association to the web is not known. In this study, we focused on ADAM10 regulation by tetraspanins. We identified a subfamily of tetraspanins with 8 cysteines in their large extracellular domain that we called TspanC8 (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 and Tspan33) that can directly interact with ADAM10 and regulate its egress from the endoplasmic reticulum. We have shown that Tspan5, Tspan14, Tspan15 and Tspan33 regulate the surface expression of ADAM10 and that Tspan10 and Tspan17 accumulate ADAM10 in a late endosomal compartment. TspanC8 could also contribute to substrate specificity since Tspan5 and Tspan14 can increase Notch activation when Tspan15 cannot. Drosophila TspanC8 directly interact with the Drosophila ADAM10 ortholog Kuzbanian, increase its accumulation at the cell surface and modulate Notch activation in several developmental contexts. We propose that TspanC8 constitute a new family of Notch regulators with conserved functions in the regulation of ADAM10 trafficking and activity.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:29Z : No. of bitstreams: 1 Publico-393.pdf: 1637068 bytes, checksum: 4fe3757007f6a049eac930eb08b63c88 (MD5) / O melanoma é o tipo de câncer de pele menos frequente, mas que tem um grande poder de letalidade devido ao seu potencial de formar metástases. Para as células adquirirem a capacidade de formar metástases, estas precisam ter a característica de sobreviver independente de interações com a matriz extracelular e consequentemente apresentar resistência ao anoikis. Por isso, a importância de se estudar as alterações que ocorrem com células tumorais que adquirem essa capacidade. Em nosso laboratório foi desenvolvido um modelo que nos permite estudar diferentes etapas da gênese do melanoma. Melanócitos murinos melan-a que sobreviveram depois de 1, 2, 3 e 4 ciclos de impedimento de ancoragem por 96 horas apresentaram modificações na morfologia e crescimento independente de PMA, e foram denominadas 1C, 2C, 3C e 4C, respectivamente. Diferentes linhagens de melanoma (4C11-, 4C11+, Tm1, Tm5, etc) foram estabelecidas após submeter os esferóides sobreviventes da 4C à diluição limitante. Dados prévios de nosso laboratório mostraram aumento da expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna de melanócitos e aumento da resistência ao anoikis. Melanócitos melan-a superexpressando o gene Timp1 adquirem fenótipo de resistência ao anoikis. No entanto, o mecanismo pelo qual Timp1 medeia essa sinalização de sobrevivência não é conhecido. Dados da literatura mostram interação entre CD63, Timp1 e 1-integrinas em células epiteliais de mama humana e que essa interação regula processos fisiológicos como apoptose. Além disso, a glicosilação aberrante em moléculas de adesão celular, como integrinas, pode conferir às células capacidade de sobreviver em condições independentes de ancoragem. O objetivo do presente estudo foi analisar a possível interação entre CD63, Timp1 e 1-integrinas ao longo da transformação maligna de melanócitos, a presença de N-glicosilação aberrante em β1-integrinas e o impacto da N-glicosilação aberrante na resistência ao anoikis. Observou-se interação entre CD63 e Timp1 e CD63 e 1-integrinas nas linhagens 4C, 4C11- e 4C11+, estabelecidas após ciclos de impedimento de ancoragem, já a interação entre Timp1 e 1-integrinas foi observada somente nas linhagens de melanoma 4C11- e 4C11+. A expressão de 1-integrinas na superfície celular está aumentada na linhagem de melanoma agressivo 4C11+, assim como a expressão de Mgat-V e N-glicosilação aberrante. Além disso, o perfil eletroforético da 1-integrina sugere que a mesma apresenta aumento de N-glicosilação aberrante na linhagem de melanoma metastático 4C11+. O tratamento de células de melanoma 4C11+ com o inibidor de N-glicosilação swainsonine resulta em menor capacidade destas células em resistir ao anoikis. Este parece ser o primeiro estudo descrevendo a interação entre Timp1, CD63 e 1-integrinas em células tumorais. Assim, o presente trabalho favorece o entendimento de como Timp1 regula resistência ao anoikis ao longo da transformação maligna de melanócitos. / Although malignant melanoma is the less frequently diagnosed skin cancer, it shows a poor prognosis due its chemoresistance and metastasis development. One of the adquired abilities of transformed cells is anoikis resistance and this property is closely related to metastasis formation. In our laboratory, we developed a model that allows us to study different steps of melanocyte malignant transformation. Melan-a melanocytes surviving after 1, 2, 3 and 4 deadhesion cycles showed modified morphology and independent PMA growth and have been named, 1C, 2C, 3C and 4C cells, respectively. Different melanoma cell lines were established after submitting 4C spheroids to limiting dilution. Previous results of our group showed increased expression of Timp1 along melanoma genesis and its correlation with anoikis resistance. However, the mechanism involved in this signaling is unknown. Published data demonstrated interaction between CD63, Timp1 and 1-integrins in human breast epithelial cells and its role in apoptosis. Furthermore, aberrant glycosylation in cell adhesion molecules such as integrins provides to cells the ability to survive under anchorage-independent conditions. The aim of this work was analyze the possible interaction among CD63, Timp1 and 1-integrins along melanocyte malignant transformation, possible aberrant N-glycosylation patterns of β1-integrins and their impact in anoikis resistance. Aberrant N-glycosylation patterns were observed in tumorigenic cells. We observed interaction between CD63 and Timp1 and between CD63 and 1-integrins in the melan-a-derived cells 4C, 4C11, and 4C11 +, and interaction between Timp1 and 1-integrins only in melanoma cell lines 4C11 - and 4C11 +. The presence of Timp1 in supernatant from 4C11+ conferred to melan-a cells anoikis resistance. The expression of 1-integrins in our study model is increased in aggressive melanoma lineage, 4C11+, as well as the expression of Mgat-V and aberrant N-glycosylation on cell surface. Moreover, the electrophoretic profile of  1-integrin suggests that melanoma metastatic 4C11+. Lineage present increased aberrant N-glycosylation in this molecule. Treatment of melanoma cells 4C11 + with the N-glycosylation inhibitor, swainsonine, resulted in reduced capacity of these cells to resist to anoikis. This seems to be the first study describing the interaction between Timp1, CD63 and 1-integrin in tumor cells and may contribute to a better understanding of how Timp1 regulates resistance to anoikis during the melanocyte malignant transformation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant et dérivent le plus souvent de précurseurs lymphoïdes B. D’importants progrès thérapeutiques ont permis d’améliorer considérablement le pronostic. Néanmoins, 15 à 20 % des enfants rechutent encore. Ces rechutes peuvent survenir de façon isolée ou combinée dans la moelle osseuse, le site primitif des lymphoblastes, et/ou dans des organes extramédullaires tels que le testicule ou le système nerveux central. Notre équipe a montré que la protéine transmembranaire CD9 jouait un rôle majeur dans la migration des blastes dans ces sites et notamment le testicule, par l’activation de la voie RAC1 en réponse à la stimulation des cellules par le CXCL12. Ici, nous avons mis en évidence qu’un faible niveau d’oxygène, caractéristique commune aux niches médullaire et extramédullaires, régulait positivement l’expression de CD9 aux niveaux transcriptionnel et protéique, via la voie majeure de réponse à l’hypoxie, dépendante du facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a). Nous montrons que HIF1a se fixe directement sur le promoteur de CD9 pour induire sa transcription. Nous montrons aussi que la protéine CD9 est essentielle aux propriétés d’adhérence et de migration des blastes dans des conditions de basse oxygénation, et que son action pourrait s’exercer à travers RAC1 comme en normoxie. Nos résultats dans des expériences de xénogreffe à des souris indiquent que la voie HIF1a favorise la dissémination des blastes, possiblement à travers la régulation qu’elle exerce sur CD9. Ainsi, ce travail contribue à mieux comprendre le rôle de CD9 dans la pathogenèse des LAL de l’enfant. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) are the most frequent cancer in children and derive most often from B-cell precursors. Huge therapeutic improvements have allowed to reach high survival rates near 90% at 10 years from diagnosis. However, 15-20% of children still relapse with a significant risk of death. Relapses can occur in bone marrow and/or extramedullary sites such as testis or central nervous system, usually referred as “sanctuary sites”. Our previous work showed that the transmembrane protein CD9 plays a major role in lymphoblasts migration into these sites, especially in testis, through the activation of RAC1 signaling upon blasts stimulation with C-X-C chemokine ligand 12 (CXCl12). Here, we addressed the question of putative common factors shared by bone marrow and extramedullary niches which could upregulate CD9 expression and function. Consequently, we found that low oxygen levels could actually enhance CD9 expression both at mRNA and protein levels. We further determined that Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a), the master transcription factor involved in hypoxia response, binds directly CD9 promoter to induce its transcription. We also showed that CD9 protein is crucial for leukemic cell adhesion and migration at low oxygen levels, possibly through its action on RAC1 signaling. Mouse xenograft experiments indicate that HIF1a signaling pathway favors ALL cells dissemination, which may involve CD9 as well. The present work increments our understanding of CD9 implication in ALL pathogenesis.

No description available.