L'épissage des ARN pré-messagers est une étape essentielle pour l'expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. La reconnaissance des exons par la machinerie d'épissage est réalisée grâce à différents éléments cis-régulateurs incluant les séquences consensus d'épissage et les séquences auxiliaires activatrices ou inhibitrices d'épissage. Le pré-ARNm représente une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement des maladies génétiques. L'approche du saut d'exon thérapeutique, destinée à restaurer l'expression d'une protéine totalement ou partiellement fonctionnelle en interférant avec le processus d'épissage, suscite un grand intérêt notamment pour la dystrophie musculaire de Duchenne où la modification du transcrit permettrait d'obtenir une forme modérée de la maladie, la Dystrophie musculaire de Becker. Des oligonucléotides antisens sont utilisés pour masquer les signaux d'épissage de reconnaissance d'un exon par le spliceosome, et induire son excision (ou saut) du transcrit mature. La détermination de la meilleure séquence cible des AONs est une difficulté majeure de cette approche. Pour le gène DMD, nous avons pu établir grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques combinées avec des tests fonctionnels utilisant des minigènes rapporteurs d'épissage, que le ciblage de motifs exoniques qui fixent le facteur d'épissage SF2/ASF permettait d'obtenir la meilleure efficacité des AONs. Par ailleurs, nous avons exploré la régulation de l'épissage des pseudoexons dans le gène DMD, et notamment les mécanismes conduisant à l'inclusion de ces séquences introniques dans le transcrit mature en condition pathologique. L'étude de deux cas exceptionnels d'activation de pseudoexons associée à des remaniements introniques rares (double délétion, inversion) élargit le spectre des mutations à l'origine de ces défauts d'épissage, et illustre le rôle encore mal connu des remaniements introniques en pathologie humaine. / Splicing of pre-messenger RNAs to mature transcripts is a crucial step in eukaryotic gene expression. The recognition of exon by the splicing machinery involves different cis-regulatory elements, including the splice site motifs and auxiliary sequences, which can act by stimulating or repressing splicing. The pre-mRNA represents a new therapeutic target for the treatment of genetic diseases. Notably, the exon skipping strategy is currently one of the most promising therapeutic approaches for the Duchenne muscular dystrophy. It intends to restore the expression of a partially functional protein by interfering with the splicing process, and converts the severe DMD phenotype into the moderate form of the disease, Becker muscular Dystrophy (BMD). Antisense oligonucleotides are used to mask the splicing signals involved in exon recognition by the spliceosome to induce its skipping from the mature transcript and restore an open reading frame. The determination of the best target sequence of the AONs is one of the major hurdles to overcome. For the DMD gene, a bioinformatic and statistical analysis combined with minigenes studies allowed us to establish that targeting binding sites for the splicing factor SF2/ASF maximizes the AONs efficiency. In a second part of this work, we investigated the splicing regulation of pseudoexons in the DMD gene, in particular the mechanisms leading to the inclusion of these intronic sequences in the mature transcript in pathological conditions. The study of two exceptional cases of pseudoexons activation associated with rare intronic rearrangements (double-deletions, inversion) expands the spectrum of missplicing mutations, and demonstrates the potential role of pure intronic rearrangements in human pathology.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique qui détériore la myéline centrale des patients. Des progrès ont été réalisés dans le traitement de la SEP mais il n'existe pas encore de neuroprotecteurs efficaces contre les dommages axonaux entraînant un lourd handicap. Ce travail de thèse a évalué le potentiel du XBD173, un ligand du translocator protein contrôlant la neurostéroïdogenèse et la neuroinflammation, à améliorer les symptômes dans un modèle de SEP induit par la protéolipide-protéine (souris EAE-PLP) qui mime la forme rémittente-récurrente de la SEP (85% des patients). Nos résultats montrent qu'à faible dose, le XBD173, qui diminue les taux sériques d’interleukines pro-inflammatoires et empêche la répression des marqueurs myélinique et axonal, améliore aussi la symptomatologie des souris EAE-PLP. L'effet bénéfique du XBD173 contre les signes cliniques est reproduit chez les souris EAE-MOG mimant la forme progressive de la SEP. La thèse ouvre des perspectives pour l'élaboration de stratégies efficaces contre la SEP sans induire d'effets secondaires majeurs. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease affecting the central myelin. Progress has been made for MS treatment, but effective neuroprotective drugs against MS-evoked axonal damages and severe disability are still missing. This thesis assessed the potential of XBD173, a ligand of the translocator protein controlling neurosteroidogenesis and neuroinflammation, to improve symptoms in the proteolipid protein-induced MS model (EAE-PLP mice) that mimics the relapsing-remitting form affecting 85% of MS patients. Our results show that XBD173 at low dose decreases serum levels of pro-inflammatory interleukins, prevents the repression of myelin and axonal markers, and also ameliorates clinical deficits in EAE-PLP mice. The beneficial effect of XBD173 against clinical symptoms was also observed in the EAE-MOG mice mimicking the progressive MS. Promising perspectives are open for the development of effective strategies against MS with little or no serious side effects.

Moduler l’agrégation de protéines amyloïdes est thérapeutiquement pertinent (p. ex. la polyneuropathie amyloïde familiale traitée avec le Tafamidis). Cependant, pour de nombreuses amyloïdoses, il n’existe pas encore de modulateur d'agrégation efficace pour thérapie. Il a été récemment montré que combiner des composés qui modulent l’agrégation d’amyloïdes peut résulter en des effets synergiques. Une stratégie de criblage combinatoire, pour identifier des cocktails synergiques de composés, pourrait donc conduire à une percée thérapeutique pour de nombreuses amyloïdoses. Cependant, les technologies à haut débit existantes ne sont pas adaptées pour le criblage combinatoire.J’ai développé SynAggreg – une technologie in vitro à haut débit très sensible, précise, reproductible, peu coûteuse et flexible - qui permet d'identifier à la fois des inhibiteurs et des accélérateurs d'agrégation, de caractériser leur mécanisme d'action sur la cinétique d'agrégation et de les classer par leur efficacité. SynAggreg est également la première technologie adaptée au criblage combinatoire et pour l’étude d’effets synergiques de manière fiable. Enfin, cette nouvelle technologie peut être facilement adaptée à plusieurs amyloïdoses en remplaçant la partie amyloïde de la protéine de fusion par des techniques de biologie moléculaire. Ainsi, SynAggreg apparaît comme une boîte à outils pour la recherche fondamentale et appliquée et possède un fort potentiel de valorisation. / Modulating amyloid proteins aggregation is therapeutically relevant (e.g. the familial amyloid polyneuropathy treated with Tafamidis). However, for many amyloidoses, there is yet no efficient aggregation modulator for therapy. It was recently shown that combining compounds that modulate the aggregation of amyloids can result in synergistic effects. A combinatorial screening strategy to identify synergistic cocktails of compounds could thus lead to a therapeutic break through for many amyloidoses. However, existing high-throughput technologies are not adapted for combinatorial screening.I developed SynAggreg - a very sensitive, accurate, reproducible, cost effective, flexible and high-throughput in vitro technology - which allows identifying both aggregation inhibitors and accelerators, characterizing their mechanism of action on aggregation kinetics and ranking them by their efficiency. SynAggreg is also the first technology suitable for combinatorial screening and for studying reliably synergistic effects of combinations of compounds. Finally, this new technology can be easily adapted to several amyloidoses by replacing the amyloid part of the fusion protein with molecular biology techniques. Thus, SynAggreg appears as a toolbox for fundamental and applied research, and has a high potential for valorization.

Orientador: Maria Palmira Daflon Gremião / Resumo: Glioblastomas (GBM) representam 77% dos tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) e ainda hoje, apesar de todos os avanços na terapia, continua com prognóstico limitado. A existência de barreiras fisiológicas como a barreira hematoencefálica (BHE) representa o principal obstáculo que impede que concentrações adequadas do fármaco atinjam o local de ação. Por suas vantagens anatômicas, uma estratégia proposta para a administração de fármacos destinados ao SNC consiste no uso da via nasal. Além disso, o uso de terapias combinadas utilizando fármacos capazes de agir em diferentes alvos moleculares deve ser considerada para o tratamento de doenças complexas como GBM. O candidato a fármaco ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (CHC) e o anticorpo monoclonal cetuximab (CTX) já são explorados devido à capacidade de agir em diferentes alvos moleculares nas células tumorais e aplicados em conjunto, como uma nova abordagem combinada, podem melhorar os resultados terapêuticos. De forma complementar, a utilização de sistemas de liberação baseados em nanotecnologia trará inevitavelmente ganhos terapêuticos à combinação proposta, permitindo que atributos específicos sejam agregados ao sistema e possibilite não somente a administração nasal, como também a associação de diferentes fármacos em um único carreador. Assim, o presente estudo propõe o desenvolvimento de diferentes plataformas poliméricas baseadas em poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) e quitosana trimetilada (TMC) ou quito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glioblastomas (GBM) account for 77% of malignant tumors in the central nervous system (SNC), and today, despite all advances in therapy, remains with a limited prognosis. The existence of physiological barriers as the blood brain barrier (BBB) represents the main obstacle that limits appropriate concentrations of drugs designed to therapy. Due to their anatomical advantages, a strategy proposed for direct delivery to SNC involves the use of the nose-to-brain route. Besides, combination therapy that uses multiple drugs against different molecular targets should be considered for complex diseases such as GBM. Drugs like alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHC) and the monoclonal antibody cetuximab (CTX) are already explored for their capacity to act against different hallmarks of cancer and applied together, as a novel combining approach, might improve therapeutic outcomes. Therefore, advances in nanotechnology-based delivery systems will inevitably bring therapeutic gains to the proposed combination since they enable acquisition of important characteristics desired and also the association of different drugs into a single carrier. Thus, the current study proposes the development of different polymeric platforms based on poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and trimethyl chitosan (TMC) /chitosan oligosaccharide (OCS) for CHC encapsulation. Both CHC-loaded developed systems (PLGA/TMC and PLGA/OCS) exhibited nanostructure organization of about 300 to 400 nm, containing chitosan o... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor