Le mélanome, la tumeur cutanée la plus agressive, est devenu un problème majeur de santé publique dans de nombreux pays. Diagnostiqué précocement, il peut être traité par excision chirurgicale, mais le pronostic pour les mélanomes plus avancés est très mauvais car cette tumeur est résistante à toutes les thérapies utilisées à ce jour. Dans le but de développer de nouvelles thérapies pour traiter cette tumeur, nous étudions les voies de signalisation qui jouent un rôle prépondérant dans la prolifération, la survie et la différenciation des mélanocytes et des mélanomes. Il s’agit de la voie des MAPK, la voie PI3K et la voie de l’AMP cyclique (AMPc). Nous avons tout d’abord démontré que certaines phosphodiestérases (PDE ; les inhibiteurs physiologiques de la voie de l’AMPc) sont surexprimées dans les lignées de mélanomes et inhibent ainsi la différenciation de ces cellules. La surexpression des PDEs est nécessaire à la transformation des mélanocytes par l’oncogène Ras alors que la réactivation de la voie de l’AMPc dans les lignées de mélanome inhibe leur prolifération. Ces données suggèrent qu’une stratégie thérapeutique qui aurait pour objectif de stimuler la différenciation des mélanomes en réactivant la voie de l’AMPc pourrait permettre d’inhiber leur prolifération. Nous avons par ailleurs montré que la protéine kinase B-Raf, qui est fréquemment mutée dans les mélanomes, était cependant inactivée dans les mélanomes contenant une mutation de Ras. Nous avons démontré que cette inhibition était due à une régulation négative de B-Raf par son substrat Erk. En effet, Erk phosphoryle B-Raf sur sa partie amino-terminale pour empêcher son interaction avec Ras. Ce mécanisme de régulation négative de B-Raf force ces lignées de mélanomes à utiliser l’isoforme C-Raf. Ce travail a des conséquences sur le traitement du mélanome. En effet, si B-Raf n’est pas utilisé pour l’activation de la voie des MAPK dans les mélanomes mutés N-Ras, les inhibiteurs de B-Raf en développement clinique seront inefficaces dans ces cancers. Nous avons par ailleurs démontré qu‘un inhibiteur des kinases B-Raf et C-Raf, en développement clinique (Sorafenib), induisait l’activation de ces kinases par hétérodimérisation en régulant leur phosphorylation. Ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de régulation des proto-oncogènes B-Raf et C-Raf qui pourraient jouer un rôle important dans la résistance des mélanomes aux inhibiteurs de Raf qui sont actuellement en développement clinique. / Melanoma, the most aggressive skin tumor, has become a major public health problem in many countries. Diagnosed early, it can be treated by surgical excision, but the prognosis for advanced melanoma is very poor because the tumor is resistant to all therapies used today. In order to develop new therapies to treat this tumor, we study the signaling pathways that play a major role in the proliferation, survival and differentiation of melanocytes and melanoma. These are the MAPK, PI3K pathway and the cyclic AMP (cAMP). We first demonstrated that some phosphodiesterases (PDEs; physiological inhibitors of cAMP pathway) are overexpressed in melanoma lines and thus inhibit the differentiation of these cells. Overexpression of PDEs is necessary for melanocyte transformation by oncogenic Ras when the reactivation of the cAMP pathway in melanoma lines inhibits their proliferation. These data suggest a therapeutic strategy that would aim to stimulate the differentiation of melanoma by reactivating the cAMP pathway could help to inhibit their proliferation. We have also shown that the protein kinase B-Raf, which is frequently mutated in melanoma, however, was inactivated in melanomas containing a mutation of Ras. We demonstrated that this inhibition was due to a downregulation of B-Raf by Erk substrate. Indeed, Erk phosphorylates B-Raf on its amino-terminal to prevent its interaction with Ras. This negative regulatory mechanism of B-Raf melanoma is forcing these lines to use isoform C-Raf. This work has implications for the treatment of melanoma. Indeed, if B-Raf is not used for the activation of MAPK in N-Ras mutated melanoma, the B-Raf inhibitors in clinical development will be ineffective in these cancers. We also demonstrated that a kinase inhibitor of B-Raf and C-Raf, which is in clinical development (Sorafenib), induces the activation of these kinases by heterodimerization in regulating their phosphorylation. These results reveal new mechanisms of regulation of proto-oncogene B-Raf and C-Raf, which could play an important role in the resistance of melanoma to Raf inhibitors, which are currently in clinical development.

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Final publication is available at http://ajp.amjpathol.org/ / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19583号 / 医博第4090号 / 新制||医||1014(附属図書館) / 32619 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小池 薫, 教授 中山 健夫, 教授 福田 和彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

Neuroblastoma is a highly metastatic and invasive tumour with poor prognosis. Despite recent advances in the treatment of neuroblastoma, mortality is still high due to uncontrolled metastatic disease, and novel therapeutic approaches for the treatment of neuroblastoma are therefore desperately needed. A potential novel approach for therapy of neuroblastoma relates to the polysialic acid decoration of the neural cell adhesion molecule (PSANCAM). PSA-NCAM is selectively re-expressed in a number of tumours including neuroblastoma, where it is thought to modulate tumour dissemination. Expression is strongly associated with poor clinical prognosis and an aggressive tumour phenotype. Inhibition of the enzymes responsible for synthesis of PSA, the polysialyltransferases (polySTs) presents a novel and selective therapeutic opportunity. The aims of the studies described in this thesis are to evaluate PSANCAM expression and function in neuroblastoma, and to develop and utilise cell-based models to pharmacologically investigate novel polyST inhibitors. PSA-NCAM was seen to be highly expressed in neuroblastoma clinical specimens and associated with phenotypes of tumour aggressiveness. A screening panel consisting of cell lines with a range of PSA-NCAM expression types was established and utilised to develop assays for pharmacologically assessing novel polyST inhibitors. Using cytidine monophosphate (CMP), a naturally-occurring inhibitor of polySTs, the robustness of the assays was confirmed before progression to evaluate novel molecules. From 16 compounds identified in an in vitro screen of polyST inhibition, three promising polyST inhibitors were identified. These promising polyST inhibitors modulated PSA-NCAM expression on the tumour cell surface and led to a significant reduction in cell migration. Therefore the work presented in this thesis suggests that targeting polySTs is a promising novel therapeutic strategy for neuroblastoma and further research in this area is warranted. / Mu'tah University and Jordan Armed Forces, Hashemite Kingdom of Jordan. / The full text will be available at the end of the extended embargo period: 5th March 2027

Introduction : les lésions médullaires sont sources de déficits et souvent de handicap majeur. Afin de limiter les conséquences de ces traumatismes la recherche scientifique expérimente des stratégies thérapeutiques visant à  réduire la lésion et à   régénérer le tissu nerveux. Malheureusement la neuroprotection seule n'a jusqu'à  présent pu démontrer de réel bénéfice clinique et actuellement de nombreux espoirs reposent sur la neurorégénération via les thérapies cellulaires. Dans cet esprit nous avons développé et validé un modèle lésionnel chez le rat puis réalisé dans la lésion des greffes de cellules progénitrices embryonnaires humaines afin de promouvoir la régénération du tissu nerveux. Matériel et méthode : nous avons développé chez le rat un modèle de compression médullaire par inflation d'un ballonnet dans l'espace épidural en région thoracique (T9). Les animaux lésés présentent initialement une paraplégie sensitivo-motrice complète suivi d'une faible récupération neurologique spontanée (10%) à J7. Grâce à  ce modèle nous avons étudié les stratégies de régénération du tissu par la transplantation in situ dans la moelle lésée de cellules progénitrices. Des greffes de cellules progénitrices neurales embryonnaires ont ainsi été réalisées en région lésée ainsi que dans les métamères sus et sous jacents. Les cellules souches provenant d'embryons humains étaient préalablement transduites in vitro pour exprimer la Neurogénine 2. La Neurogénine 2 est un facteur neurotrophique permettant d'influencer la différenciation cellulaire en neurones.Résultats : le modèle de compression développé est fiable et reproductible. La validation pharmaceutique réalisée par l'administration d'une molécule neuroprotectrice: un antagoniste des récepteurs à  NMDA (Gacyclidine), confirme d'une part sa pertinence pour l'évaluation de stratégies thérapeutiques et d'autre part que l'excitotoxicité est un élément majeur des processus physiopathologiques survenant dans la phase secondaire de la lésion. Sur un suivi de 35 jours, les animaux greffés avec des cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2 présentent une récupération motrice significative. Cette récupération est corrélée à  la restauration partielle des fibres sérotoninergiques et de la localisation membranaire de leur récepteur en sous lésionnel. Les groupes contrôles et greffés uniquement avec des cellules souches non transduites n'atteignent pas, quant à eux, des scores efficaces et présentent une récupération fonctionnelle inférieure à celle des animaux non greffés. L'identification des cellules transplantées dans le tissu lésé grâce à des différents marquages (EGFP et HuNu) ne permet pas de retrouver ces cellules un mois après la transplantation.Conclusion : ces résultats sont encourageants et sont en faveur d'un bénéfice supporté par la greffe de cellules transduites pour exprimer la Neurogénine 2. Ces cellules sans survivre au delà  de un mois apporteraient un support trophique permettant une régénération et une récupération fonctionnelle. La restauration du système sérotoninergique dont on connaît l'implication dans la locomotion expliquerait ces résultats qui méritent cependant une validation sur un modèle gros animal (singe, porc) avant une application clinique. / Spinal cord injuries (SCI) lead to deficits and often to major handicaps. To limit consequences of SCI, research focuses on the development of therapeutic strategies that aimed either at the reduction of the lesion and/or nervous tissues regeneration. Unfortunately, up to now the sole neuroprotective strategy did not demonstrate beneficial effects at the clinical level and there is thus more and more hopes based on neuroregenerative strategy in particular based on cell transplantation. In that aim, we have developed and characterized a rat injury model and grafted in the lesion site human embryonic progenitors to promote regeneration of nervous tissues.We have set up a rat model of spinal cord compression using an inflated balloon in the epidural space at the thoracic level (T9). Injured animals presented an initial complete sensory-motor paraplegia followed by a limited spontaneous neurological recovery (10%) one week after traumatism. Using this model, we have studied a regenerative strategy based on in situ progenitor cells transplantation in the injured spinal cord. Grafting of human embryonic progenitors had been done in the lesion site and in metamers located bellow and above the lesion. Human embryonic progenitors had been previously engineered in vitro to produce Neurogenin 2, a neurotrophic factor, that favours cell differentiation into neural lineages. The developed spinal cord compression model is reliable and reproducible. Pharmacological validation using a neuroprotective molecule, an antagonist of NMDA receptors (Gacyclidin), not only confirmed the pertinence of this model for the evaluation of therapeutic strategies but also that excitotoxicity plays a major role in the physiopathological processes involved in the secondary phase after lesion.Thirty five days after transplantation, rats that had been grafted with Neurogenin 2 expressing human embryonic progenitors demonstrated a significant motor recovery. This recovery was associated with a partial restoration of serotonin innervations bellow the lesion site and translocation of 5HT1A receptors to the plasma membrane of motoneurons. Animals transplanted with naïve cells presented a lower functional recovery than injured rat that had not been grafted. Moreover, one month after transplantation, grafted cells were not identifiable in the injured spinal cord. These encouraging results favour a beneficial effect of Neurogenin 2-expressing cells transplantation. One month after grafting, hENPs were undetectable in the injured spinal cord, thus functional recovery appears to be indirect and is likely due to trophic support supply. Partial restoration of serotonin innervations, whose role is well known in the locomotor function, may explain part of the observed functional recovery. These results clearly require to be validated in bigger animal models (monkey, pig) before any translation to the clinic.

Sur près de 70 millions de personnes vivant avec l’épilepsie (PVE) dans le monde, 150 000 vivent au Pérou et 52 000 au Laos, avec un déficit de traitement (proportion de PVE qui ne reçoit pas de médicaments antiépileptiques adaptés), respectivement de 75% et 97%. Notre objectif principal était de caractériser l’utilisation des plantes médicinales dans la prise en charge de l’épilepsie. Les objectifs spécifiques visaient à : (i) faire l’état des lieux des connaissances sur les plantes médicinales utilisées comme antiépileptiques dans les pays d’Asie, d’Amérique Latine et d’Afrique, (ii) déterminer la place de la phytothérapie dans l’itinéraire thérapeutique des PVE (iii) évaluer l’efficacité pharmacologique d’extraits de plantes utilisées pour soigner l’épilepsie dans deux communautés rurales du nord du Pérou. D’abord, nous avons utilisé une approche bibliographique exhaustive de la littérature spécialisée. L’approche de terrain au Pérou et au Laos a combiné des outils épidémiologiques et ethnopharmacologiques. La troisième partie de ce travail était une étude pilote ayant pour objectif d’évaluer la faisabilité et la pertinence de réaliser des tests pharmacologiques de l’efficacité de plantes sur différents modèles d’épilepsie. Nous avons identifié 106 publications portant sur l’utilisation de plantes dans l’épilepsie(études réalisées entre 1982 et 2017). Sur le terrain, le pourcentage de recours aux remèdes à base de plantes était de 66,7% au Pérou et de 71,1% au Laos. Au total, 66 espèces végétales ont été citées par les patients et tradipraticiens au Pérou et 87 au Laos. Un effet antiépileptique potentiel avec les extraits de Valeriana officinalis et Melissa officinalis a été observé. La place de la médecine traditionnelle est telle dans l’itinéraire thérapeutique d’un patient épileptique qu’il serait intéressant qu’elle soit partie intégrante du système de soins. / Of the 70 million people living with epilepsy (PWE) worldwide, 150,000 live in Peru and 52,000in Laos, where the epilepsy treatment gap are respectively 75% and 97%.Our main objective was to characterize the use of medicinal plants in the management ofepilepsy. The specific objectives were: (i) to review the current state of knowledge onmedicinal plants used as antiepileptics in Asian, Latin American and African countries, (ii) to determine the place of phytotherapy in the therapeutic itinerary of PWE, (iii) to evaluate the pharmacological efficacy of plant extracts used to treat epilepsy in two rural communities in northern Peru.We first used a comprehensive bibliographic approach of the specialized literature. The field approach in Peru and Laos combined epidemiological and ethnopharmacological tools. The third part of this work was a pilot study to assess the feasibility and relevance of conducting pharmacological tests of plant efficacy in epilepsy models.We identified 106 publications on the use of plants in epilepsy between 1982 and 2017. Thepercentage of herbal remedies used was 66.7% in Peru and 71.1% in Laos. A total of 66 plant species were mentioned by patients and traditional healers in Peru and 87 in Laos. A potential antiepileptic effect with extracts of Valeriana officinalis and Melissa officinalis has been observed. The place of traditional medicine is such that it would be interesting if it were an integral part of the health care system.

Este estudo apresenta o trabalho do psicanalista e hipnoterapeuta americano Milton Hyland Erickson a partir de seus dados biográficos e de sua relevância para a chamada terapia estratégica, propondo, em consonância com sua experiência profissional, uma nova epistemologia para a mudança; propõe ainda uma comparação entre a trajetória de Freud e a de Erickson em relação à hipnose, bem como um apanhado histórico sobre essa técnica. Com base nessa recuperação teórica, os padrões ericksonianos de linguagem são investigados à luz do Metamodelo e do Modelo Milton, criações de Richard Bandler e John Grinder, tomando por base alguns conceitos da Programação Neurolinguística (PNL) tais como sistemas representacionais, filtros, modelagem, espelhamento e rapport. Empreende-se uma análise do discurso ericksoniano a partir de três casos selecionados dentre seus atendimentos clínicos, evidenciando os padrões de linguagem apresentados nas categorias e subcategorias do Metamodelo e do Modelo Milton, com o objetivo de validá-los tanto teórica quanto empiricamente / This study aimed at scrutinizing Milton Hyland Ericksons theoretical framework and therapeutic methodology with a view to the understanding of their relevance to the so-called strategic therapy. That aim was carried out through analyses of issues such as Ericksons professional experience, his shared points and differences with Freudian hypnosis and particularly his patterns of discourse as well as his very clinical technique. Those analyses were accomplished under the guidance of the Metamodel and the Milton Model as proposed by Richard Bandler and John Grinder within the references and concepts comprised in the Neuro-Linguistic Programming such as representational systems, filters, modeling, mirroring and rapport. In order to ground and illustrate the theoretical analyses, this work was enriched by the scrutiny of three Ericksonian clinical cases. This strategy proved to be effective since it has provided evidences about both Ericksons language patterns and empirical data for the observation of the categories and subcategories of the Metamodel and Miltons Model, as a kind of a quest for validation of his theory and methods. The results put into light Ericksons understanding of the therapeutic work

Este estudo apresenta o trabalho do psicanalista e hipnoterapeuta americano Milton Hyland Erickson a partir de seus dados biográficos e de sua relevância para a chamada terapia estratégica, propondo, em consonância com sua experiência profissional, uma nova epistemologia para a mudança; propõe ainda uma comparação entre a trajetória de Freud e a de Erickson em relação à hipnose, bem como um apanhado histórico sobre essa técnica. Com base nessa recuperação teórica, os padrões ericksonianos de linguagem são investigados à luz do Metamodelo e do Modelo Milton, criações de Richard Bandler e John Grinder, tomando por base alguns conceitos da Programação Neurolinguística (PNL) tais como sistemas representacionais, filtros, modelagem, espelhamento e rapport. Empreende-se uma análise do discurso ericksoniano a partir de três casos selecionados dentre seus atendimentos clínicos, evidenciando os padrões de linguagem apresentados nas categorias e subcategorias do Metamodelo e do Modelo Milton, com o objetivo de validá-los tanto teórica quanto empiricamente / This study aimed at scrutinizing Milton Hyland Ericksons theoretical framework and therapeutic methodology with a view to the understanding of their relevance to the so-called strategic therapy. That aim was carried out through analyses of issues such as Ericksons professional experience, his shared points and differences with Freudian hypnosis and particularly his patterns of discourse as well as his very clinical technique. Those analyses were accomplished under the guidance of the Metamodel and the Milton Model as proposed by Richard Bandler and John Grinder within the references and concepts comprised in the Neuro-Linguistic Programming such as representational systems, filters, modeling, mirroring and rapport. In order to ground and illustrate the theoretical analyses, this work was enriched by the scrutiny of three Ericksonian clinical cases. This strategy proved to be effective since it has provided evidences about both Ericksons language patterns and empirical data for the observation of the categories and subcategories of the Metamodel and Miltons Model, as a kind of a quest for validation of his theory and methods. The results put into light Ericksons understanding of the therapeutic work

Les mutations dans le génome mitochondrial humain sont souvent associées à de graves maladies neuromusculaires. Mon projet de thèse a consisté tout d’abord au développement d’une stratégie thérapeutique basée sur l’import mitochondrial de molécules d’ARN. J’ai pu démontrer que l’expression stable de molécules d’ARN recombinantes dans les cellules humaines permet de diminuer le taux de mutations pathogéniques de l’ADN mitochondrial. Dans une seconde partie, j’ai élaboré une nouvelle méthode, CoLoC-seq, permettant l’identification à grande échelle des ARN localisés dans les mitochondries. En appliquant cette méthode sur des cellules humaines, j’ai pu confirmer l’adressage mitochondrial de certains ARN cytosoliques non-codant et identifier de nouveaux ARN potentiellement importés. Ces données permettront d’élargir les connaissances sur les voies d’adressage mitochondrial des ARN, leurs mécanismes et leur régulation, et d’optimiser les stratégies thérapeutiques basées sur l’import d’ARN. / Mutations in the human mitochondrial genome are often associated with severe neuromuscular disorders. The first part of my thesis project consisted in the development of a therapeutic strategy based on the mitochondrial import of RNA molecules. I demonstrated that the stable expression of recombinant RNA molecules in human cells induced the decrease of the pathogenic mutation load in mitochondrial DNA. In the second part, I developed a nex method, CoLoC-seq, for the large-scale identification of RNA species localized in the mitochondria. By applying this method to human cells, I confirmed the mitochondrial targeting of some non-coding cytosolic RNAs and identified new potentially imported RNAs. These data will broaden the knowledge on the pathway of RNA targeting into the mitochondria, its mechanisms and regulation, and will allow optimization of the therapeutic strategies based on RNA import.

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinants. / Mitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases.