Orientador: José Luiz Rybarczyk Filho / Resumo: A toxicogenômica é um campo emergente que possibilita o estudo dos efeitos de uma determinada droga a nível molecular em sistemas modelos. Uma das principais questões é se podemos substituir os estudos in vivo pelos estudos in vitro. As ciências ômicas possibilitam a resposta para esse tipo de questionamento pois fornecem técnicas como, por exemplo, o microarray, que permite o conhecimento dos transcritos (RNAs) de um dado organismo. O Projeto Toxicogenômico Japonês fornece dados para Homo sapiens, com somente experimentos in vitro, e para Rattus norvegicus, com experimentos in vitro e in vivo, tratados com 131 drogas (aprovadas pelo FDA) em diferentes concentrações de dose e tempos de amostragem, totalizando, aproximadamente, 20000 chips de microarray. A partir desses dados foi possível responder a questão inicial e observar as diferenças existentes entre cada modelo. Por meio da linguagem de programação R normalizamos os dados, obtemos os genes diferencialmente expressos e o respectivo enriquecimento funcional, dessa forma observamos as diferenças entre cada modelo. Em seguida realizamos uma análise comparativa dos modelos in vivo e in vitro adaptando a metodologia do mapa modular proposta por Segal e colaboradores. Essa metodologia tem como objetivo principal obter módulos, que são sets de genes (dados do Gene Ontology, KEGG e Reactome) que agem em conjunto para realizar uma função específica. Além de extrair módulos caracterizaremos os valores de expressão em relação as c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: José Luiz Rybarczyk Filho / Resumo: A toxicogenômica é uma área de estudo que se utiliza de dados provindos de tecnologias das ciências ômicas e de metodologias de análise de dados da bioinformática para caracte- rizar perfis biológicos de compostos a fim realizar um estudo sobre seu comportamento no sistema biológico. Um dos problemas na análise de dados de expressão gênica é que existem diversas metodologias disponı́veis, cada uma aborda os dados brutos de maneira diferente e consequentemente fornecem resultados diferentes. Porém estes resultados não estão necessa- riamente errados, por essa razão abordar dados toxicogenômicos de diversas maneiras pode ajudar pesquisadores a tecer hipóteses sobre os mecanismos das drogas. Isso pode implicar em redução de custos na fase pré-clı́nica do desenvolvimento de medicamentos e numa melhor qualidade de tratamento para os pacientes. A abordagem mais comum na análise de dados de expressão gênica é o enriquecimento funcional dos genes que se mostrem diferencialmente expressos. Entretanto é possı́vel que informações relevantes possam ser obtidas utilizando métodos com outras considerações. Para avaliar esta hipótese o presente trabalho tem por objetivo analisar dados de expressão gênica disponı́veis em bases de dados on-line referentes a 3 drogas antineoplásicas testadas em fı́gado de Rattus norvergicus (estudos in vivo e in vi- tro) e Homo sapiens (estudo in vivo apenas) para avaliação de ontologias alteradas em cada droga. Duas metodologias de bioinformática foram utiliz... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toxicogenomics is an area that uses data generated by omics technologies and bioinformatics to characterize biological profiles of chemical compounds in order to analyze the biological system’s behavior in response to said compounds. A commom problem in the analysis of gene expression data is the large amount of methodologies available, each one approaches the raw data differently and consequently provide different results. But these results are not necessarily wrong, for that reason approaching toxicogenomic data in several ways may help researchers to hypothesize about a drug’s mechanisms. This may imply cost reduction in the pre-clinical phase of drug development and in a better quality of treatment for patients. The most common approach in the analysis of gene expression data is the functional enrichment of differentially expressed genes (EFDEGs). However, it is possible that relevant information can be obtained using methods with other considerations. To evaluate this hypothesis this work aims to analyze gene expression data available in the OPEN TG-GATEs online database about 3 antineoplastic drugs tested in the liver of Rattus norvergicus (in vivo and in vitro) and Homo sapiens (in vivo only) for the evaluation of altered ontologies in each drug. Two bioinformatics methodologies were used to analyze these data. The traditional analysis of differentially expressed genes (EFDEGs) and the analysis of groups of functionally associated genes determined by shannon entropy (A... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

SOUSA, Nathanna Mateus de. Isolado proteico de Amburana cearensis (Allemao) A. C. Smith como nova fonte de proteínas alimentares: caracterização funcional e análise toxicogenômica comparativa com outras proteínas vegetais. 2014. 142 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T19:20:21Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_nmsousa.pdf: 3236916 bytes, checksum: e4eec635ae5a1e4bb155ae301ef06c63 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:39:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_nmsousa.pdf: 3236916 bytes, checksum: e4eec635ae5a1e4bb155ae301ef06c63 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_nmsousa.pdf: 3236916 bytes, checksum: e4eec635ae5a1e4bb155ae301ef06c63 (MD5) Previous issue date: 2014 / Amburana cearensis (cumaru) is an underutilized legume from Caatinga. Because of their high protein content its seeds are a possible novel source of food protein. Were determined the best conditions for protein extraction and preparation of protein isolate (IPAc).Analysis were carried out also with the defatted flour (FDAc) and with a marketed soybean protein isolate (IPS). IPAc showed protein content of 90% and amino acid composition compatible with the IPS’s composition, with remarkable low methionine content. Some functional properties were measured in order to predict the adequacy of the isolates as an ingredient for food industry. The results for FDAc, IPAc and IPS were, respectively: solubility 20-79; 9-99 e 3-76%; water holding capacity 1.7; 3.9 e 7.5 g/g; oil holding capacity 1.5; 6.3 e 1.6 g/g; emulsion formation / stability 52 / 46%; 55 / 51% e 53 / 21%; foamability / stability 47 / 32%; 65 / 53% e 33 / 8; least gelling concentration (LGC) 18, 16 and 12%. In order to investigate whether IPAc e IPS exhibit signs of toxicity, two cell lines of human adenocarcinoma (MCF-7 e Caco-2) were exposed to these isolates as well as to others prepared from soyabean (IPGm), white bean (IPPv), Jack bean (IPCe) and castor bean (IPRc), to the protein fraction from castor bean (FPRc), to the lectins PHA-E and ConA (50 µg/mL) and to the chemical control (Crtl_Quim). Subcitotoxic doses were determined by viability test to later exposure assay for 24 h. The MCF-7 cell’s RNA were extracted and hybridized to a microarray containing the complete human genome. The expression profiles after the exposition to the proteins were compared to that ones generated after PBS and Crtl_Quim and hierarchicaly clustered. Crtl_Quim, IPAc and IPGm were unsuitable for further analysis by their overestimated effect. Analysis of biological pathways and process showed that genes involved with the cholesterol biosynthesis, ER stress and immune response were upregulated and genes involved with cell cycle and DNA replication were downregulated after exposure of cells to IPPv, IPCe, PHA-E and ConA. The samples IPRc and FPRc upregulated genes involved with apoptosis and immune response and downregulated genes involved with cell cycle and cAMP signaling. Connectivity Map analysis showed high correlation of ConA, PHA-E and IPCe with drugs that are Ca2+ and K+ channel blockers, while IPRc and FPRc showed biological function similar to at least six drugs inhibitors of protein synthesis. It’s possible to conclude that the IPAc has a high potentiality as a novel protein food with wide applicability in the food industry and should, however, be modified in the method of obtaining aiming the improvement in its solubility and eliminating the residual salt. / Amburana cearensis (cumaru) é uma leguminosa subutilizada da Caatinga. O alto teor proteico das sementes faz delas uma possível nova fonte de proteínas alimentares. Foram determinadas as melhores condições de extração proteica para posterior produção do isolado proteico de cumaru (IPAc). As análises também foram conduzidas com a farinha delipidada (FDAc) e com um isolado proteico de soja comercial (IPS). IPAc apresentou teor proteico > 90% e composição de aminoácidos comparável a IPS, com notável deficiência em metionina. Foram determinadas algumas propriedades funcionais para predizer sua adequação como ingrediente na indústria alimentícia. Os resultados para FDAc, IPAc e IPS foram, respectivamente: solubilidade 20-79; 9-99 e 3-76%; capacidade de retenção de água 1,7; 3,9 e 7,5 g/g; capacidade de retenção de óleo 1,5; 6,3 e 1,6 g/g; capacidade emulsificante / estabilidade 52 / 46%; 55 / 51% e 53 / 21%; capacidade espumante / estabilidade 47 / 32%; 65 / 53% e 33 / 8 e menor concentração geleificante 18, 16 e 12%. Para investigar se IPAc e IPS apresentam indícios de toxicidade, células de adenocarcinoma humano foram expostas por 24 h aos isolados. Para comparação, também foi realizada exposição com os isolados de soja (IPGm), feijão comum (IPPv), feijão de porco (IPCe) e mamona (IPRc), a fração proteica de mamona (FPRc), as lectinas PHA-E e ConA e o controle químico (Crtl_Quim). O RNA das células foi hibridizado em microarranjos contendo o genoma humano completo. Os perfis de expressão gênica após exposição às proteínas foram comparados aos de PBS e Crtl_Quim e agrupados hierarquicamente. Crtl_Quim, IPAc e IPGm se mostraram inadequados para a continuação das análises por provocar um efeito superestimado. A análise de vias e processos biológicos afetados apontou que genes envolvidos com a biossíntese de colesterol, estresse do RE e resposta imune foram superexpressos e genes envolvidos com o ciclo celular e replicação do DNA foram subexpressos após exposição a IPPv, IPCe, PHA-E e ConA. As amostras IPRc e FPRc regularam para cima genes envolvidos com a apoptose e resposta imune e para baixo genes envolvidos com o ciclo celular e sinalização do cAMP. Análise do mapa conectivo mostrou alta correlação de ConA, PHA-E e IPCe com drogas bloqueadoras de canais de Ca2+ e de K+; enquanto IPRc e FPRc apresentam função biológica semelhante a pelo menos seis drogas inibitórias da síntese proteica. Conclui-se que IPAc tem grande potencialidade como novo alimento proteico com grande aplicabilidade na indústria de alimentos, devendo, no entanto, sofrer modificações no método de obtenção visando a melhora na solubilidade e a eliminação do sal residual.

O câncer é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. O envelhecimento da população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, indica que esse índice tende a aumentar a cada ano. Como o câncer é uma doença complexa, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese e na resposta aos tratamentos atuais são essenciais para mudar esse cenário. Gemcitabina e rebecamicina são moléculas que apresentam atividade antitumoral, sendo que a primeira é usada como agente único no tratamento de adenocarcinoma pancreático, ou em conjunto com outras drogas em vários tipos de câncer, enquanto que alguns análogos da segunda já foram utilizados em testes clínicos de fase II em câncer de mama e pulmão. A gemcitabina é um análogo de desoxicitidina que interrompe a síntese de DNA, além de apresentar efeito inibitório sobre várias proteínas, como ribonucleotídeo redutase. A rebecamicina e vários de seus análogos são indolocarbazóis que incluem moléculas intercalantes de DNA, além de inibidores da topoisomerase I e de algumas proteína quinases, como PKC e Chk1. Alguns indolocarbazóis apresentam também importante atividade antimicrobiana. Os mecanismos de resistência a essas drogas são pouco conhecidos e alguns já foram sugeridos; porém, ainda não há consenso sobre as vias celulares envolvidas. A proposta desse trabalho foi identificar genes associados às respostas a gemcitabina e análogos de rebecamicina, usando Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. Avaliamos a atividade biológica de nove análogos de rebecamicina sintéticos, destacando o composto mais promissor para estudos mais aprofundados. Por meio de análise direta de fenótipo em escala genômica, identificamos genes cuja deleção resulta em hipersensibilidade ao análogo de rebecamicina, dentre eles um sensor de estresse relacionado à via Pkc1/Mpk1 quinase (SLG1), uma lisina deacetilase (RPD3) e uma lisina demetilase (JHD2). Esses três genes estão relacionados a uma maior atividade de proteínas de resistência multidroga, sugerindo que diversas vias regulatórias são importantes na resposta a indolocarbazóis. Também verificamos, por análise quantitativa de fenótipo (ensaio Bar-Seq), que a deleção de genes com funções atualmente pouco relacionadas à gemcitabina conferiam maior sensibilidade a droga, como uma arginina metiltransferase (HMT1) e uma subunidade do complexo Cop9 sinalossomo (CSI1), o qual está relacionado a regulação da atividade de diversas proteínas, incluindo ribonucleotídeo redutase. Em conjunto, nossos resultados demonstram que vias ainda não relacionadas a resposta a esses compostos podem ser de grande contribuição para a compreensão dos mecanismos de resistência aos mesmos, auxiliando no desenvolvimento de novos tratamentos e fármacos. / Cancer is one of the main causes of death throughout the world. Population aging, especially in developing countries, points to an increase in cancer incidence over the coming years. As cancer is a complex disease, a better understanding of the mechanisms involved in carcinogenesis and in the current treatments is essential to change this scenario. Gemcitabine and rebeccamycin are molecules that present antitumoral activity. The first one is currently used as a single agent in pancreatic cancer treatment or in combination with other drugs in several types of cancer, while analogs of the second have been tested in phase II clinical trials in breast and lung cancers. Gemcitabine is a deoxycytidine analog that inhibits DNA synthesis, and also presents inhibitory effects over several proteins, such as ribonucleotide reductase. Rebeccamycin and its analogs are indolocarbazoles which include DNA intercalant molecules, as well as topoisomerase I and protein kinase inhibitors, such as PKC and Chk1. The mechanisms related to the resistance to these drugs are poorly understood and some of them have been suggested; even though, there is no consensus about the cellular pathways involved. The aim of this work was to identify genes associated to the response to gemcitabine and rebeccamycin analogs using Saccharomyces cerevisiae as a model cell. We evaluated the biological activity of nine synthetic rebeccamycin analogs, selecting the most promising compound for deeper studies. In a genome-wide qualitative phenotypic analysis, we have identified genes whose disruption resulted in hypersensitivity to the rebeccamycin analog. Among them, we found a stress-sensor involved in Pkc1/Mpk1 kinase pathway (SLG1), a lysine deacetylase (RPD3) and a lysine demethylase (JHD2). These three genes are related to an increased multidrug resistance activity, suggesting that several regulatory pathways play a role in the response to indolocarbazoles. We also found, by means of a quantitative phenotypic analysis (Bar-Seq assay), increased sensitivity to gemcitabine in null-mutants of genes whose functions are currently poorly related to the drug, like an arginine methyltransferase (HMT1) and a subunit of Cop9 signalosome complex (CSI1), which is related to activity regulation of several enzymes, including ribonucleotide reductase. Together, our results show that pathways which were previously unrelated to the response to these compounds can be useful for a better understanding of their resistance mechanisms, providing insights into new drug development and therapy.

O câncer é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. O envelhecimento da população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, indica que esse índice tende a aumentar a cada ano. Como o câncer é uma doença complexa, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese e na resposta aos tratamentos atuais são essenciais para mudar esse cenário. Gemcitabina e rebecamicina são moléculas que apresentam atividade antitumoral, sendo que a primeira é usada como agente único no tratamento de adenocarcinoma pancreático, ou em conjunto com outras drogas em vários tipos de câncer, enquanto que alguns análogos da segunda já foram utilizados em testes clínicos de fase II em câncer de mama e pulmão. A gemcitabina é um análogo de desoxicitidina que interrompe a síntese de DNA, além de apresentar efeito inibitório sobre várias proteínas, como ribonucleotídeo redutase. A rebecamicina e vários de seus análogos são indolocarbazóis que incluem moléculas intercalantes de DNA, além de inibidores da topoisomerase I e de algumas proteína quinases, como PKC e Chk1. Alguns indolocarbazóis apresentam também importante atividade antimicrobiana. Os mecanismos de resistência a essas drogas são pouco conhecidos e alguns já foram sugeridos; porém, ainda não há consenso sobre as vias celulares envolvidas. A proposta desse trabalho foi identificar genes associados às respostas a gemcitabina e análogos de rebecamicina, usando Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. Avaliamos a atividade biológica de nove análogos de rebecamicina sintéticos, destacando o composto mais promissor para estudos mais aprofundados. Por meio de análise direta de fenótipo em escala genômica, identificamos genes cuja deleção resulta em hipersensibilidade ao análogo de rebecamicina, dentre eles um sensor de estresse relacionado à via Pkc1/Mpk1 quinase (SLG1), uma lisina deacetilase (RPD3) e uma lisina demetilase (JHD2). Esses três genes estão relacionados a uma maior atividade de proteínas de resistência multidroga, sugerindo que diversas vias regulatórias são importantes na resposta a indolocarbazóis. Também verificamos, por análise quantitativa de fenótipo (ensaio Bar-Seq), que a deleção de genes com funções atualmente pouco relacionadas à gemcitabina conferiam maior sensibilidade a droga, como uma arginina metiltransferase (HMT1) e uma subunidade do complexo Cop9 sinalossomo (CSI1), o qual está relacionado a regulação da atividade de diversas proteínas, incluindo ribonucleotídeo redutase. Em conjunto, nossos resultados demonstram que vias ainda não relacionadas a resposta a esses compostos podem ser de grande contribuição para a compreensão dos mecanismos de resistência aos mesmos, auxiliando no desenvolvimento de novos tratamentos e fármacos. / Cancer is one of the main causes of death throughout the world. Population aging, especially in developing countries, points to an increase in cancer incidence over the coming years. As cancer is a complex disease, a better understanding of the mechanisms involved in carcinogenesis and in the current treatments is essential to change this scenario. Gemcitabine and rebeccamycin are molecules that present antitumoral activity. The first one is currently used as a single agent in pancreatic cancer treatment or in combination with other drugs in several types of cancer, while analogs of the second have been tested in phase II clinical trials in breast and lung cancers. Gemcitabine is a deoxycytidine analog that inhibits DNA synthesis, and also presents inhibitory effects over several proteins, such as ribonucleotide reductase. Rebeccamycin and its analogs are indolocarbazoles which include DNA intercalant molecules, as well as topoisomerase I and protein kinase inhibitors, such as PKC and Chk1. The mechanisms related to the resistance to these drugs are poorly understood and some of them have been suggested; even though, there is no consensus about the cellular pathways involved. The aim of this work was to identify genes associated to the response to gemcitabine and rebeccamycin analogs using Saccharomyces cerevisiae as a model cell. We evaluated the biological activity of nine synthetic rebeccamycin analogs, selecting the most promising compound for deeper studies. In a genome-wide qualitative phenotypic analysis, we have identified genes whose disruption resulted in hypersensitivity to the rebeccamycin analog. Among them, we found a stress-sensor involved in Pkc1/Mpk1 kinase pathway (SLG1), a lysine deacetylase (RPD3) and a lysine demethylase (JHD2). These three genes are related to an increased multidrug resistance activity, suggesting that several regulatory pathways play a role in the response to indolocarbazoles. We also found, by means of a quantitative phenotypic analysis (Bar-Seq assay), increased sensitivity to gemcitabine in null-mutants of genes whose functions are currently poorly related to the drug, like an arginine methyltransferase (HMT1) and a subunit of Cop9 signalosome complex (CSI1), which is related to activity regulation of several enzymes, including ribonucleotide reductase. Together, our results show that pathways which were previously unrelated to the response to these compounds can be useful for a better understanding of their resistance mechanisms, providing insights into new drug development and therapy.

FARIAS, D. F. Biossegurança alimentar de proteínas Cry: dos métodos clássicos à era ômica. 2013. 242 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:13:54Z No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 µg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 µg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 µg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 µg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 µg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 µg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 µg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack. / Atualmente são liberadas para comercialização no mercado agrobiotecnológico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodão expressando proteínas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistência ao ataque de insetos. Contudo, essas proteínas são ativas contra lepidópteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira é um coleóptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, têm-se feito um grande esforço na busca por novas moléculas Cry ativas contra coleópteros. Utilizando técnicas de evolução molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteína mutante Cry8Ka5, que é várias vezes mais tóxica contra o bicudo do que a proteína original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleópteros, Cry8Ka5 está sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodão Bt, bem como de outras culturas Bt de importância econômica. No entanto, como parte das exigências legais para a liberação comercial de uma planta transgênica, essa proteína recombinante deve ser testada quanto a sua biossegurança alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergênicos, tóxicos e/ou antimetabólicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliação de BA da proteína mutante Cry8Ka5 e da proteína Cry1Ac, já incorporada em várias culturas Bt comercializadas. A última foi utilizada como proteína controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seção do trabalho. Nesse âmbito, a avaliação de BA proposta cobriu desde as exigências legais até a execução de metodologias, até então, nunca propostas para avaliação de segurança de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capítulos. O Capítulo 1 objetivou realizar uma revisão da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteínas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislação vigente em BA de plantas GM. Já o Capítulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 através do método de duas etapas baseado em pesos de evidência que, por sua vez, atende a todas as recomendações da CTNBio. Neste caso, a proteína Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares já foram realizadas com essa molécula. Baseando-se nos métodos oficiais, é possível concluir que não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histórico de uso seguro; 2. A proteína Cry8Ka5 não mostrou similaridade significativa de sua sequência de aminoácidos primária com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteínas Cry mostraram possuir modo de ação bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptível à digestão em fluído gástrico simulado; 5. A proteína Cry8Ka5 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteína/Kg de peso corpóreo, via oral, dose única). Por sua vez, o Capítulo 3 objetivou avaliar a proteína Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotóxicos em uma série de testes clássicos e alternativos, além de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteínas não causaram efeitos cito- ou genotóxicos em linfócitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL em todos os testes), não promoveram hemólise em suspensões de eritrócitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL para todas as espécies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alterações na topografia de membrana celular de eritrócitos humanos do tipo O, na concentração de 1.000 µg/mL, detectadas via microscopia de força atômica. Além disso, as proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac não apresentaram citotoxicidade elevada contra naúplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 µg/mL, respectivamente) e não inibiram o crescimento de quatro cepas de bactérias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 µg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o Capítulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um “pool” de peptídeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestão sequencial in vitro, sobre o perfil de expressão gênica de células de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cólon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alterações no perfil de expressão gênica das células Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitélio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentração (100 µg/mL). Nos testes de exposição com células MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteína Cry1Ac causou alterações significativas no padrão de expressão gênica. Contudo, esse efeito não foi detectado após tratamento dessas células com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condições reais de exposição às moléculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos três últimos capítulos mostraram-se bastante úteis e, após tudo que foi exposto, foi possível confirmar o caráter inócuo da proteína Cry1Ac, bem como concluir que a proteína Cry8Ka5 é uma ferramenta biotecnológica segura para o desenvolvimento de plantas de algodão Bt para conferir resistência ao ataque do bicudo-do-algodoeiro.