Los ensayos in vitro de transformación celular abarcan el proceso multifásico que va desde la conversión neoplásica hasta el establecimiento del fenotipo tumorigénico. En la presente tesis doctoral, el ensayo in vitro Balb/3T3, con una línea celular inmortalizada de fibroblastos de ratón, ha sido aplicado para determinar la citotoxicidad y el potencial carcinogénico de una serie de compuestos metálicos seleccionados por su interés ambiental, laboral y biomédico, adoptando una estrategia específica de trabajo en varias etapas. Esto ha implicado una optimización muy precisa del protocolo para determinar la reproducibilidad intralaboratorios del protocolo del ensayo y para asegurar la estabilidad de las condiciones experimentales de aplicación del ensayo Balb/3T3.Por consiguiente, después de la optimización del protocolo adoptado, el proyecto de tesis se desarrolló siguiendo una estrategia de cuatro etapas: a) determinación de la citotoxicidad a unas concentraciones de exposición fijadas (100 µM, 65 compuestos metálicos individuales). Esto permitió la selección de los compuestos metálicos que tendrían prioridad para las investigaciones subsiguientes; b) establecimiento de las relaciones dosis-efecto para 35 compuestos metálicos identificados como de primera prioridad en la etapa (a), para determinar los correspondientes valores de IC50 y un rango adecuado de concentraciones de exposición para ser utilizado en los pasos siguientes; c) determinación del potencial carcinogénico de los compuestos metálicos seleccionados a partir de la etapa (b); d) estudios sobre los mecanismos de transformación de las especies metálicas identificadas en la fase (c). En este contexto, una aproximación mecanística inicial fue la evaluación de la respuesta apoptótica inducida por los compuestos metálicos seleccionados en las células Balb/3T3. Este estudio sobre la apoptosis ha mostrado que se debería utilizar más de un ensayo para establecer inequívocamente la inducción de apoptosis por alguno de los compuestos metálicos en el sistema de ensayo escogido. Esto es debido a la complejidad del problema y a las dificultades para interpretar los datos experimentales. Por otra parte, los hallazgos sobre la respuesta apoptótica inducida por As(III), Cr(VI) y algunos compuestos de Pt sugieren la hipótesis de la existencia de una relación entre los procesos apoptótico, genotóxico y carcinogénico.Con respecto a los estudios mecanísticos y de metabolismo de los metales, los resultados obtenidos aplicando técnicas analíticas únicas y peculiares como el uso de radiotrazadores, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo, y resonancia magnética nuclear han hecho posible obtener interesantes datos metabólicos sobre la entrada y el reparto intracelular de los metales incorporados en las células. Éste es un aspecto generalmente olvidado en los estudios in vitro a pesar de ser un punto clave para la interpretación mecanística de la citotoxicidad y de la actividad transformante inducidas por los compuestos químicos.Además, se encontró un buen nivel de concordancia al comparar los resultados obtenidos de la aplicación del ensayo Balb/3T3 con los modelos in vitro seleccionados de roedores y humanos.En conclusión, la presente tesis representa una importante contribución para hacer que la línea celular Balb/3T3 sea un valioso modelo in vitro para investigar la correlación entre absorción, biotransformación, citotoxicidad y potencial carcinogénico de los compuestos metálicos. Se puede afirmar que el ensayo Balb/3T3 tiene el potencial para ser adecuado para un estudio futuro de validación. / In vitro morphological cell transformation tests encompass the multi-step process from neoplastic conversion to the established tumorigenic phenotype. In the present PhD thesis the in vitro Balb/3T3 assay, an immortalised mouse fibroblast cell line, was applied for assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of selected metal compounds of environmental, occupational and biomedical interest by adopting a specific multi-stage work strategy. This has involved a very accurate protocol optimisation in order to assess intralaboratory reproducibility of the test protocol and to assure stability of the experimental conditions in which the Balb/3T3 assay was applied.Therefore, after optimisation of the adopted protocol the present PhD project was carried out following a "four steps approach": a) determination of cytotoxicity at a fixed concentration exposure (100 µM, 65 individual metal compounds). This allowed the selection of metal compounds to which priority is given for subsequent investigations; b) setting of dose-effect relationships for 35 metal compounds identified as first priority in step (a), in order to establish the corresponding IC50 values and a suitable exposure range of concentrations to be used in the subsequent steps; c) determination of carcinogenic potential of selected metal compounds from step (b); d) mechanistic studies on transforming metal species as identified in step (c). In this context, an initial mechanistic approach was the evaluation of the apoptotic response induced by selected metal compounds on the Balb/3T3 cells. This study on apoptosis has shown that more than one assay should be used in order to establish unequivocally the induction of apoptosis by a metal compound on the selected test system. This is due to the complexity of the problem and the difficulties to interpret the experimental data. Moreover, the findings on the apoptotic response induced by As(III), Cr(VI) and some Pt-compounds suggest the hypothesis of an existing relationship among apoptotic, genotoxic and carcinogenic processes.With regard to mechanistic studies and metal metabolism, the results obtained applying unique and peculiar analytical techniques like the use of radiotracers, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance have made possible to get interesting metabolic data on uptake and intracellular repartition of metals incorporated into cells. This is an aspect generally neglected in in vitro studies although it is a key point for mechanistic interpretation of cytotoxicity and transforming activity induced by chemicals.In addition, a good level of concordance was achieved by comparing the results obtained from the application of the Balb/3T3 assay with selected in vitro rodent and human models.In conclusion, the present PhD project represents an important contribution to make the Balb/3T3 cell line as a valuable in vitro model to investigate correlation between uptake, biotransformation, cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds. It is to state that the Balb/3T3 assay has the potential to be suitable for a future validation study.

A análise de fluidos biológicos para detecção de usuários de Cannabis não é rotina em nossos serviços de toxicologia forense pela falta de um método aplicável às condições de trabalho desses laboratórios. Neste trabalho foi estudado um método que utiliza a cromatografia de camada delgada de alta eficiência (CCDAE) como técnica de identificação. Cinco mililitros de urina são submetidos à hidrólise alcalina e à extração Iíquido/líquido, com posterior aplicação do resíduo obtido na cromatoplaca. O limite de detecção em estudo realizado com adicionados foi de 5ng/ml. Urina de usuários de Cannabis quando submetidas a esta metodologia apresentaram resultado semelhante ao do padrão de THCCOOH, principal produto de biotransformação do THC. As amostras utilizadas como branco de referência não apresentaram mancha semelhante. Na análise das amostras de usuários por imunoensaio de fluorescência polarizada (\"cutoff\' 50ng/ml) obteve-se resultado negativo para usuários moderados e ocasionais. Com auxilio de curva-padrão observou-se que a concentração provável de canabinóides nessas amostras estaria entre 20-50ng/ml. No estudo comparativo dos resultados obtidos nas duas técnicas, foi verificada uma correspondência de 100% para as amostras de usuários com padrão de uso intenso. Nos usuários moderados e ocasionais não foi observada boa correspondência entre os resultados. / Abstract not available.

No / The rate at which toxicological data is generated is continually becoming more rapid and the volume of data generated is growing dramatically. This is due in part to advances in software solutions and cheminformatics approaches which increase the availability of open data from chemical, biological and toxicological and high throughput screening resources. However, the amplified pace and capacity of data generation achieved by these novel techniques presents challenges for organising and analysing data output. Big Data in Predictive Toxicology discusses these challenges as well as the opportunities of new techniques encountered in data science. It addresses the nature of toxicological big data, their storage, analysis and interpretation. It also details how these data can be applied in toxicity prediction, modelling and risk assessment.

Yes / The COSMOS Database (DB) was originally established to provide reliable data for cosmetics-related chemicals within the COSMOS Project funded as part of the SEURAT-1 Research Initiative. The database has subsequently been maintained and developed further into COSMOS Next Generation (NG), a combination of database and in silico tools, essential components of a knowledge base. COSMOS DB provided a cosmetics inventory as well as other regulatory inventories, accompanied by assessment results and in vitro and in vivo toxicity data. In addition to data content curation, much effort was dedicated to data governance - data authorisation, characterisation of quality, documentation of meta information, and control of data use. Through this effort, COSMOS DB was able to merge and fuse data of various types from different sources. Building on the previous effort, the COSMOS Minimum Inclusion (MINIS) criteria for a toxicity database were further expanded to quantify the reliability of studies. COSMOS NG features multiple fingerprints for analysing structure similarity, and new tools to calculate molecular properties and screen chemicals with endpoint-related public profilers, such as DNA and protein binders, liver alerts and genotoxic alerts. The publicly available COSMOS NG enables users to compile information and execute analyses such as category formation and read-across. This paper provides a step-by-step guided workflow for a simple read-across case, starting from a target structure and culminating in an estimation of a NOAEL confidence interval. Given its strong technical foundation, inclusion of quality-reviewed data, and provision of tools designed to facilitate communication between users, COSMOS NG is a first step towards building a toxicological knowledge hub leveraging many public data systems for chemical safety evaluation. We continue to monitor the feedback from the user community at support@mn-am.com.

published_or_final_version / Environmental Management / Master / Master of Science in Environmental Management

Apesar da ampla demonstração do potencial tóxico do benzeno ao sistema imune, os mecanismos envolvidos nos seus diferentes efeitos não estão totalmente esclarecidos. Desta forma, o presente trabalho avaliou a mobilização e função de leucócitos polimorfonucleares (PMN) na vigência de resposta inflamatória aguda em ratos expostos a metabólitos do benzeno. Ratos Wistar, machos foram tratados por período de tempo prolongado (50 mg/kg; i. p.; 1 uma vez ao dia, 13 ou 16 doses diárias com intervalos de 2 dias a cada 5 doses) com hidroquinona (HQ), fenol (FE) ou veículo. As respostas inflamatória inata ou adquirida foram induzidas 24 hs após a última dose dos tratamentos. Para avaliar a intensidade de intoxicação, um método analítico foi padronizado para a extração de HQ e FE da urina dos animais por microextração em fase sólida, para subseqüente análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Os dados da validação mostraram que a técnica analítica é adequada, e a análise das amostras demonstrou o aumento na concentração urinária de HQ, FE e catecol (CAT) em urina dos ratos expostos, confirmando assim a exposição ao FE ou a HQ. A avaliação da resposta inflamatória inata demonstrou que o tratamento com HQ acarretou aumento acentuado no influxo de PMN para a cavidade inflamada. A análise do leucograma mostrou que o tratamento com HQ promoveu neutrofilia, que pode ser decorrente da mobilização destas células da medula, uma vez que número menor de células segmentadas na última etapa de maturação foi encontrado nestes animais. No entanto, durante a vigência de resposta inflamatória, a neutrofilia esperada para este processo não foi detectada nestes animais. Espécies reativas de nitrogênio podem participar dos efeitos aqui detectados em animais tratados com HQ, já que valores aumentados de óxido nítrico (NO) foram mensurados no sangue após o tratamento e no exsudato inflamatório. Diferentemente da exposição à HQ, a administração de FE não alterou a migração de PMN para o foco de lesão na vigência de reposta inflamatória aguda inata. Apesar do tratamento com FE ter acarretado linfocitopenia, a produção das células brancas no compartimento medular e a leucocitose em resposta ao processo inflamatório foram equivalentes ao encontrado em animais controles. No que concerne à resposta inflamatória alérgica, ambos os tratamentos inibiram o influxo de leucócitos para o lavado bronco-alveolar (LBA) e para o tecido pulmonar. A investigação dos mecanismos envolvidos que a exposição à HQ interfere com a síntese de imunoglobulina E e, eventualmente, com a desgranulação de mastócitos. Por outro lado, a exposição ao PHE não alterou estes parâmetros. Em conjunto, os dados aqui apresentados sugerem que os tratamentos com HQ ou FE provocam efeitos distintos na gênese de respostas inflamatórias de diferentes origens quanto à migração leucocitária, e que os mecanismos envolvidos com a imunotoxicidade induzida pelo benzeno é altamente complexa. / Despite toxicity of benzene has been fully demonstrated, the mechanisms involved on its immunotoxicity are not fully comprehended. Then, the present work studied the mobilization and functions of polymorphonuclear cells (PMN) during acute inflammatory reactions in rats exposed to benzene metabolites. Male Wistar rats were treated with hydroquinone (HQ) or phenol (Phe) for prolonged period of time (50 mg/Kg; i.p.; once a day, 13 or 16 doses, 2 days intervals after each 5 doses). Innate or acquired inflammatory reactions were carried out 24 hours after the last dose of treatments. Animals treated with vehicle were employed as control. In order to determine the intensity of intoxications, an extraction method was developed in urine using a solid phase micro-extraction fiber. The subsequent analysis was performed on gas chromatography coupled to mass spectrometry. Data from validation showed the adequacy of methodology and demonstrated the presence of HQ, PHE and CAT in urine from exposed rats, corroborating the exposition to PHE or HQ. The evaluation of innate inflammatory reaction showed that HQ exposition promoted increment on the number of PMN cells to inflamed area. The leucogram demonstrated that treatment evoked neutrophilia, probably due to mobilizations of segmented cells in the last phase of maturation from bone marrow. However, during the inflammatory process, the characteristic neutrophilia was not detected. Nitrogen reactive species may participate of the intoxication, since elevated values of nitric oxide (NO) were found in blood after intoxication and in inflammatory exudates. Differentially from HQ exposition, administrations of PHE did not alter the migration of PMN into inflammatory focus. Despite the treatment promoted reductions on number of lymphocytes, the production of white cells on bone marrow and the neutrophilia during and inflammatory process were equivalent to those found in control animals. Regarding acquired inflammation, both treatments significantly inhibited the influx of leukocytes to bronchoalveolar fluid. This pattern of response did not reflect the accumulation of PMN cells on pulmonary tissue, since the myeloperoxidase activity was not higher when compared to control rats. The investigations of the mechanisms involved in the inhibited leukocyte recruitment, showed that HQ treatment probably impairs the immunoglobulin E synthesis and mast cell degranulation. On the other hand, FE exposition did not present these effects. Together, data herein suggest that HQ or PHE treatments promete singular effects on PMN recruitment during inflammatory reactions elicited by different agents, and the complexity of mechanisms responsible for the immunotoxicity induced by benzene.

As intoxicações letais, via de regra, estão comumente relacionadas com a área médico-legal; alguns agentes tóxicos ocupam lugar de destaque como os principais responsáveis pela ocorrência desses óbitos. Em medicina legal, tanto humana quanto animal, o grande desafio enfrentado é a elucidação da causa mortis e do tempo da ocorrência da morte quando os cadáveres são encontrados, indicando possível exposição aos agentes tóxicos, os quais são adicionados intencionalmente, na maior parte das vezes, com a finalidade de causar danos irreversíveis à vítima. No último relatório do Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX), no ano de 2012, foram relatadas no Brasil 102.854 intoxicações envolvendo seres humanos e animais, sendo que desse total 1.199 (1,17%) intoxicações foram relatadas em animais. Dentre os principais agentes responsáveis por intoxicação, tanto em seres humanos, como em animais, estão os praguicidas e, em particular, os nticolinesterásicos, sendo importante causa de óbitos intencionais e não intencionais em animais. Métodos de análises toxicológicas envolvendo intoxicações em seres humanos são amplamente estudados e divulgados, o que é menos usual na medicina veterinária legal. Portanto, a existência de laboratórios que atendam as legislações relacionadas as análises toxicológicas forenses, bem como a pesquisa das características da forma de apresentação e do potencial toxicológico dos anticolinesterásicos e o desenvolvimento e validação de técnicas analíticas mais sofisticadas se fazem necessária e contribuirão para os avanços nesse aspecto forense da toxicologia veterinária. Assim, o presente trabalho foi distribuído em quatro capítulos distintos. No primeiro capítulo discute-se o recebimento de amostras e um modelo de formulário de Requisição de Análise Toxicológica num laboratório veterinário de análises toxicológicas que recebe amostras biológicas de interesse forense. O segundo capítulo apresenta a possibilidade de utilização de uma técnica enzimática com a finalidade de avaliar o potencial de inibição dos praguicidas anticolinesterásicos; o método se mostrou eficiente para avaliar a inibição da atividade da acetilcolinesterase (AChE) causada pelo aldicarbe e pelo seu metabólito, o aldicarbe-sulfona. O terceiro capítulo trata-se do teste de dissolução in vitro da forma acabada do grânulo comercial do praguicida aldicarbe (Temik 150®), a fim de avaliar a cinética de liberação do princípio ativo tóxico, bem como a cinética de formação dos seus principais metabólitos ativos, considerando que cães e gatos encontrados mortos com suspeita de intoxicação exógena apresentam chumbinho no conteúdo estomacal. O perfil de dissolução dos grânulos do Temik 150® em meio ácido foi capaz mostrar a presença in vitro dos metabólitos aldicarbe-sulfóxido e o aldicarbe-sulfona, o que não ocorre quando apenas o princípio ativo passou pelo mesmo perfil de dissolução, mostrando que essa forma disponível no comércio contribui para a toxicidade deste praguicida. O quarto capítulo apresenta o desenvolvimento de um método para determinação de praguicidas anticolinesterásicos, bem como os seus produtos biotransformados em diversas matrizes biológicas, baseada em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por arranjo de diodos (DAD). Foi, então, desenvolvido e validado um método de extração e identificação de praguicidas anticolinesterásicos em matrizes biológicas, cujas figuras de mérito atendem a RDC 27 de 2012 da ANVISA (Brasil, 2012). O método permitiu a extração e identificação de aldicarbe e seus metabólitos (aldicarbe-sulfóxido e aldicarbe-sulfona), carbofurano e seu metabólito (3-OH carbofurano), forato e seu metabólito (forato-sulfóxido) e aldicarbe. Esse método foi aplicado em amostras reais encaminhadas ao Laboratório de Diagnóstico Toxicológico (LADTOX) e se mostrou eficiente para identificação de aldicarbe / Lethal poisonings, as a rule, are commonly related to the forensic area; some toxic agents are commonly found as the main agent responsible for these deaths. In forensic medicine, both human and animal, the major challenge faced is the elucidation of cause of death and the time elapsed when the bodies are found, indicating possible exposure to toxic agents, which are intentionally added, most of the times in order to cause irreversible damage to the victim. In the latest report of the Toxic-Pharmacologic National Information System (SINITOX) in the year 2012, 102 854 poisonings involving humans and animals were reported in Brazil, and of this total 1,199 (1.17%) poisonings have been reported in animals. Among the main agents responsible for toxicity, both in humans and in animals, pesticides are common and, in particular, cholinesterase inhibitors, which is important because of intentional and unintentional deaths in animals. Methods of toxicological analyzes involving poisoning in humans are widely studied and published, but less so in legal veterinary medicine. Therefore, the existence of laboratories that meet the legislation related to forensic toxicological analysis and research of the characteristics of the presentation and toxicological potential of cholinesterase inhibitors and the development and validation of more sophisticated analytical techniques are necessary and can contribute to advances in the forensic aspect of veterinary toxicology. Thus, this work was distributed into four distinct chapters. The first chapter discusses the receipt of samples and a Request Form template for Toxicological analysis in a Toxicological analysis veterinary laboratory that receives biological samples of forensic interest. The second section presents the possibility of using an enzymatic technique in order to assess the potential inhibition of cholinesterase inhibitors pesticides; the method was efficient to evaluate the inhibition of the activity of acetylcholinesterase (AChE) caused by aldicarb and its metabolite, aldicarb sulfone. The third chapter it is the in vitro dissolution test of the finished form of commercial bead pesticide aldicarb (Temik 150®) in order to assess the kinetics of release of toxic active ingredient, as well as the formation kinetics of its main metabolites assets, whereas dogs and cats found dead with suspected exogenous intoxication present \"pellets\" in the stomach contents. The dissolution profile of the Temik 150® beads in acid was able to show the presence of in vitro metabolites aldicarb sulfoxide and aldicarb sulfone, which does not occur when only the active ingredient went through the same dissolution profile, showing that this market-available form contributes to the toxicity of this pesticide. The fourth chapter presents the development of a method for determining cholinesterase inhibitors pesticides, as well as their biotransformation products in various biological matrices, based on high-performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detection (DAD).Then, a method of extraction and identification of anticholinesterase pesticides in biological matrices was developed and validated, meeting current standards RDC 27, 2012 ANVISA (Brazil, 2012). The method allowed the extraction and identification of aldicarb and its metabolites (aldicarb sulfoxide and aldicarb sulfone), carbofuran and its metabolite (3-OH carbofuran), phorate and its metabolite (phorate sulfoxide) and aldicarb. This method was applied to real samples sent to the Toxicology Laboratory Diagnostics (LADTOX) and was efficient in aldicarb identification

Os praguicidas podem ser responsáveis por intoxicações exógenas intencionais ou não intencionais, tanto em seres humanos como em animais, em virtude de sua ampla toxicidade e fácil obtenção do produto, nem sempre por vias legais. O carbofurano é um praguicida carbamato amplamente utilizado no Brasil, como inseticida e nematicida, para o controle de pragas agrícolas; é comercializado na forma de grânulos, vulgarmente conhecido como “chumbinho”. Esse praguicida em animais superiores inibe a enzima acetilcolinesterase, promovendo efeitos tóxicos que podem levar a óbito. Considerando que o carbofurano poderia estar implicado com quadros intoxicações exógenas de animais, no presente estudo se propôs desenvolver e validar um método analítico para detectar e/ou quantificar esse praguicida e seu metabólito, 3-hiroxicarbofurano, em matrizes biológicas de diferentes espécies animais por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), a fim de utilizá-lo no Laboratório de Diagnóstico Toxicológico (LADTOX) do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP). Para desenvolver esse método foram utilizadas amostras biológicas proveniente de fragmentos de, no mínimo, seis animais diferentes, de espécies distintas (cão, gato, porco, boi, rato, camundongo e ave), isentas de suspeita de intoxicação. Realizou-se a fortificação dessas amostras biológicas, previamente homogeneizadas, com soluções contendo o praguicida e seu metabolito, 3-hidroxicarbofurano, em 6 níveis de fortificação que variaram de 6,25 a 100 µg/mL. Avaliaram-se os seguintes parâmetros para validação do método: seletividade, efeito matriz, precisão, exatidão, curva de calibração e efeito residual, limite de detecção (LD) e limite inferior de quantificação (LIQ). Para estabelecer a seletividade do método, verificou-se as respostas de picos interferentes próximo ao tempo de retenção dos analitos, as quais foram inferiores a 20% da resposta do analito nas amostras do LIQ. Quanto ao efeito matriz, não houve interferência relevante entre as matrizes analisadas. Em relação a precisão e exatidão do método, foi possível observar que o coeficiente de variação (CV) e o erro padrão relativo (EPR) não excederam ao limite máximo de 15%. Considerando a curva de calibração, o coeficiente de correlação (r2) apresentou valores iguais ou superiores que 0,99 nas diferentes matrizes para o carbofurano, enquanto para o 3-hidroxicarbofurano duas matrizes (fígado e conteúdo estomacal) apresentaram o valor de 0,98 e as demais superior a 0,99. A extração líquido-líquido forneceu valores de recuperação entre 74,29 a 100,1% para o carbofurano e entre 64,72 a 100,61% para o 3-hidroxicarbofurano, sendo o LIQ de 6,25 µg/mL. Conclui-se que o método se mostrou adequado para identificar e quantificar o carbofurano e seu metabólito em amostras biológicas, apresentando sensibilidade e seletividade adequadas, e os parâmetros de validação encontram-se de acordo com os limites sugeridos para validação de métodos bioanaliticos, sendo, assim, implantado no LADTOX / Pesticides are responsible for intentional or unintentional exogenous poisoning, in both humans and animals, because of their broad toxicity and prompt availability, not always legally. Carbofuran is a carbamate pesticide widely used in Brazil as an insecticide and nematicide for the control of agricultural pests. It is marketed in the form of beads, commonly known as "pellet". This pesticide inhibits acetylcholinesterase enzyme on higher animals, promoting toxic effects, which can lead to death. Considering that carbofuran could be implicated in cases of exogenous poisoning of animals, in the present study we aimed to develop and validate an analytical method for detecting and/or quantifying this pesticide and its metabolite, 3-hiroxicarbofuran, in biological matrices of different animal species by high performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) in order to use it in the Toxicology Diagnostics Laboratory (LADTOX) of the Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science (FMVZ), University of São Paulo (USP). To develop this method biological samples obtained from fragments of at least six different animals of different species (dog, cat, pig, ox, rat, mouse and bird), free from suspicion of poisoning. Biological samples were fortified with previously homogenized solutions containing the pesticide and its metabolite, 3-hidroxicarbofurano, in 6 fortification levels ranging from 6.25 to 100 µg/mL We evaluated the following parameters for method validation: selectivity, matrix effects, precision, accuracy, calibration curve and residual effect, limit of detection (LOD) and lower limit of quantitation (LLQ). To establish selectivity of the method, we verified the responses of interfering peaks near the retention times of analytes, which were less than 20% of the analyte response in LLQ samples. As to matrix effects, there was no significant interference between the matrices analyzed. Regarding the precision and accuracy of the method, it was observed that the coefficient of variation (CV) and the relative standard error (RSE) did not exceed the ceiling of 15%. In regard to the calibration curve, the correlation coefficient (r2) presented values that equal or exceed 0.99 in different arrays to carbofuran, while for the 3-hidroxicarbofuran two arrays - liver and stomach contents - had a value of 0.98 while the remaining matrices 0,99. The liquid-liquid extraction recovery values varied between 74.29 to 100.1% for carbofuran and between 64.72 to 100.61% for 3-hidroxicarbofuran, and LOQ of 6.25 µg/ml. We concluded that the method was adequate to identify and quantify carbofuran and its metabolite in biological samples, with adequate sensitivity and selectivity, and the validation parameters are in accordance to the suggested limits for validation of bioanalytical methods, and, thus implanted in LADTOX

A cotinina, principal produto de biotransformação da nicotina, é considerada um excelente marcador biológico de exposição tanto para fumantes ativos quanto passivos. A cotinina apresenta maior estabilidade química que a nicotina e possui uma meia vida de eliminação de cerca de 40 horas. Assim, um método analítico sensível, preciso e exato foi desenvolvido, para sua determinação, empregando-se a cromatografia em fase gasosa com coluna capilar (HP-Ultra2, 25m x 0.20mm x 0.33µm) e detetor de nitrogênio e fósforo (CGIDNP). A nicotina e a cotinina foram extraídas sob condições alcalinas com diclorometano, de amostras de urina às quais foi adicionado o padrão interno (clorprenalina). Após evaporação do extrato sob fluxo de nitrogênio, o resíduo foi retomado utilizando-se 50 µL de metanol onde 1 µL foi injetado no CG/DNP. O método mostrou-se linear na faixa de 10 a 200 ng/mL com coeficiente de correlação (r) igual a 0,0965 e 0,9966 para a cotinina e nicotina, respectivamente. Os limites de detecção e quantificação foram 5 ng/mL e 10 ng/mL, tanto para a cotinina quanto para a nicotina. A nicotina e a cotinina mantiveram-se estável por 15 e 21 dias a 20°C. A avaliação das amostras de urina de algumas crianças evidenciaram o contato com pais ou parentes fumantes, apresentando resultados de cotinina entre 13,70 a 272,60 ng/mL. O método validado neste trabalho mostrou-se apropriado para a avaliação da presença de cotinina em amostras de urina de fumantes passivos, apresentando as vantagens de fácil execução, curto tempo de análise e baixo custo. / Cotinine, the principal product of biotransformation of nicotine, is considered an excellent biological marker to measure the exposure to cigarette smoke for both the active and passive smokers. Cotinine presents a higher chemical stability than the nicotine and it possesses a half-life of elimination of approximate 40 hours. Therefore, a sensible analytical method, very precise and accurate, was developed using a process of gas chromatography with a nitrogen phosphorous detector (GC/NPD). Nicotine and the cotinine were extracted, under alkaline conditions with dichloromethane, from urine samples which had the internal standard clorprenaline added to them. After evaporation of the extract under nitrogen flux, the residue was retaken using 50 µL of methanol, where 1 µL was injected in the GC/NPD. The method proved to be linear in the range of 10 to 200 ng/mL with a coefficient of correlation (r) equal to 0,0965 and 0,9966 to cotinine and nicotine, respectively. The limits of detection and quantification were 5ng/mL and 10ng/mL for both cotinine and nicotine. Nicotine and cotinine maintained themselves stable for 15 and 21 days at -20 C°. The evaluation of same urine samples taken fron children passively exposured to tobacco throgh there parentes or relatives evidenced cotinine levels fron 13,70 to 272,60 ng/mL. The validated method in this work proved to be appropriate for the evaluation of the cotinine presence in the urine samples taken from.

Determinou-se a análise dos teores de benzeno em 74 amostras de solventes orgânicos industriais e produtos formulados como thinners e produtos gráficos, em amostras coletadas orientadamente em oito estados do país, com a finalidade de obter dados sobre a exposição ocupacional de trabalhadores. A análise conjunta dos resultados analíticos, das condições de trabalho encontradas e do mercado desses produtos, forneceu o subsídio técnico inicial para uma reflexão mais ampla de como atuar, via Química Analítica, em Saúde Ocupacional, garantindo critérios de confiabilidade analítica e eficácia para o objeto acercado. Do ponto de vista metodológico, a observação de confiabilidade analítica garante situar o trabalho. no domínio químico-analítico e a eficácia alcança a natureza interdisciplinar em relação ao objeto em Saúde Ocupacional. A seleção desses parâmetros e a observância constante de sua relação com o objeto investigado foi orientando os estudos e ações interdisciplinares e interinstitucionais descritas nos capítulos dois e três deste trabalho, que permitiram explicitar um quadro de elevada complexidade, referente à exposição ocupacional ao benzeno no país. Esse \"Sistema Global Complexo\" como o denominamos, é definido pelo modo de produção, distribuição e uso do benzeno e está representado em diagrama próprio. Procura-se mostrar que as respostas às demandas químico-analíticas surgidas no interior desse sistema, exigem a \"internalização\" dos instrumentos específicos, para garantia simultânea de confiabilidade e eficácia. Foi preciso diferenciar e explicitar os principais sub-sistemas para evidenciar as relações e interdependências estruturais na utilização do benzeno, a fim de eliminar demandas inadequadas e acercar variáveis e interferências a serem consideradas no domínio analítico. Segue-se detalhando no âmbito da Química o sub-sistema \"Indústrias Misturadoras de Solventes\". Mostram-se as ações e os estudos químico-analíticos desenvolvidos para fiscalização dos teores de benzeno em solventes e produtos formulados, regulamentados por portaria interministerial própria. Descreve-se o planejamento estatístico para coleta de amostras e a metodologia de análise dos teores de benzeno testada em caráter interlaboratorial. Sugere-se a extensão dessa abordagem metodológica para estudo da exposição ocupacional a outros produtos químicos que venham definir quadros complexos. / The presence of benzene has been assessed in 74 samples of industrial organic solvents and products formulated as thinners and graphic products, properly collected in 8 states of Brazil, with the purpose of acquiring data on occupational exposure by workers. The analysis of the analytical results together with the labor conditions found and the market for these products, has provided the starting technical subsidies whose goal was a broader discussion on how to deal with Occupational Health, via Analytical Chemistry, in order to assure the criteria of analytical reliability and efficacy for the object approached. From the point of view of methodology, the maintenance of analytical reliability criteria permits to place this work within the domain of Analytical Chemistry, and thus the efficacy as a parameter reaches the interdisciplinary nature relative to the object which is target of Occupational Health. The selection of these instruments and the permanent observation of its relation towards the object researched has orientated the interdisciplinary and interinstitucional studies and actions described in chapters 2 and 3 of this work. They allow us to evolve a frame of high complexity, regarding the occupational exposure to benzene in Brazil. This \"Global Complex System\", as we call it, is defined by the way benzene is produced, distributed and used, which has been illustrated by means of a diagram. The point we try to make, is that the answers to the demands faced by the analytical chemistry within this system, requires the \"internalization\" of specific instruments in order to ensure both reliability and efficacy. It was necessary to perform the differentiation and make explicit the main subsystems so that the structural relations and interdependence in the benzene use would become evident. Thus, inadequate demands would be put away and variables and interferences could be approached and analytically considered. An effort is then made in order to detail, within the chemistry field, the subsystem called \"Solvent Mixing Industry\". Chemical analytical actions and studies are described as they have been developed to check the presence of benzene in solvents and formulated products. Such inspection is ruled by specific governmental by-laws. The statistical planning is then described, regarding the collection of samples and the methodology of analysis which was tested on an interlaboratorial level. It is suggested that this methodological approach could be extended to studies on occupational exposure to other chemical products which may give rise to other complex frameworks.