As microcistinas constituem uma família de heptapeptídeos cíclicos com cerca de 70 variantes caracterizadas. São biossintetizadas em condições específicas por cianobactérias, principalmente em corpos d\'água eutrofizados. Apresentam organotropismo ao fígado e DL50 entre 50-500 µg.kg-1 peso (rato, i.p.). A exposição aguda pode impactar a saúde humana ao desarranjar o parênquima hepatocelular por hiperfosforilação do citoesqueleto e produzir intenso sangramento, podendo levar à morte por choque hipovulêmico um homem adulto e são promotoras tumorais, quando ocorre exposição crônica, por inibição de fosfatases 1 e 2A. Os congêneres das microcistinas apresentam toxicidades distintas e é importante caracterizá-los em corpos d\'água para se estimar o risco à saúde humana. Na literatura, não há convergência quanto à forma de extração das toxinas, preparo das amostras para análise e condições cromatográficas para o isolamento e quantificação. Neste trabalho, diversas análises foram conduzidas para se determinar as melhores formas de extração das toxinas, clean up da amostra e condições cromatográficas para amostras de campo ou cultura de cianobactérias. A extração hidro-alcoólica (MeOH:H2O, 3:1, v/v) parece ser a melhor forma de extração, seguida de partição líquido-líquido para amostras de campo (florações) e extração em fase sólida (cartuchos C18) para algas cultivadas em laboratório. Por meio de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detectores UV-VIS e pela análise do padrão de fragmentação das moléculas por espectrometria de massas (MS) com ionização por eletrospray em Tandem (ESI-MS/MS) determinou-se a presença das variantes de microcistinas MC-RR, MC-LR, MC-YR e MC-hRhR na amostra de água do Reservatório Billings e [Asp3]MC-LR na cepa Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. Este método parece ser adequado para a extração e caracterização de microcistinas presente em corpos d\'água e em cultura de laboratório e a variante MC-hRhR foi caracterizada pela primeira vez na literatura mundial. / It is well known that eutrophicated lakes and water reservoirs can be a serious concern to wildlife, domestic livestock and human health since cyanobacterial blooms are prone to occur. Some cyanobacteria (blue-green algae) species which form bloom may biosynthesize a family of hepatotoxic peptides named microcystins under certain circumstances, related specially to nitrogen: phosphorus ratio, temperature, pH and light intensity of the water body. There are at least 70 variants of microcystins with different toxicity, DL50 ranging from 50 to 500 µg.kg-1 (in mouse, i.p.). Acute exposure provoke hyperphosphorylation of the cytoskeleton, in liver cells, leading to cellular disruption with haemorrhage and the long term exposure can cause tumor promotion by inactivation of serine/threonine phosphatases 1 and 2A (PP1 and PP2A). Therefore, it is very important to determine and quantify microcystin variants present in water reservoirs. There are several methods available to evaluate qualitative and quantitatively microcystin and its variants in water reservoir and estimate human risks. Such methods comprise biological, biochemical and physico-chemical assays. In this work, we have isolated and analyzed hepatotoxins by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with photodiode array (PDA) detector and their structures were elucidated by Tandem - MS/MS with eletrospray ionization (ESI-MS/MS). MC-RR, MC-LR, MC-YR and MC-hRhR were determined in samples collected at Billings reservoir and [Asp3]MC-LR was found in the strain Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. The procedures developed herein can be a powerful tool for isolation and determination of microcistin and its derivatives founded in water reservoirs. Also, we have described for the first time a new variant of microcistin: MC-hRhR.

Foram desenvolvidos métodos de determinação de urina e trítio em urina. Para o urânio foi adaptada a técnica de análise por fluorimetria em meio sólido. O limite de sensibilidade foi de 5. 10-4µg U/0,1 ml e o erro foi de cerca de 10% para concentrações em torno de 0,05 µg U/0,1 ml. Foi padronizado para o trítio o método de análise por cintilação em meio líquido. O método determina quantidades de trítio até pelo menos 8,10-3µCi/ml e o erro foi de cerca de 4% para concentrações de trítio em torno de 0,34 µCi/l. Depois de adaptadas, as técnicas foram aplicadas a amostras de urinas de trabalhadores expostos a compostos de urânio ou trítio com a finalidade de verificar possível contaminação interna por estes radioisótopos. / Abstract not available.

Development and validation of methods for analysis of several drugs or their metabolites are decribed in this thesis. The document is presented as a commentary to the original papers, which were published in peer reviewed journals. Discussion on the optimization of each method is presented and covers also method development and influence of preanalytical aspects. Additionally, examples of the application of the developed methods in clinical pharmacology and toxicology are shown. This dissertation consists of three parts: enantiomeric determination of tramadol and its metabolite, determination of some antihypertensive drugs, and qualitative analysis of benzodiazepines. Development of a method for chiral analysis of tramadol and its desmethylated metabolite O- desmethyltramadol (ODT) in human urine and plasma is described in the first part of the thesis. Tramadol is a centrally acting analgetic drug, which is used as racemate in clinical practise. Each enantiomer displays different binding properties for various receptors: (+)-tramadol preferentially inhibits serotonin reuptake while (-)-tramadol mainly inhibits noradrenalin reuptake. (+)-tramadol is considered 10-times more potent than (-)-tramadol. Major active metabolite (ODT), which is considered to be the main agent responsible for the...

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-16T21:37:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Soraia Santana de Moura - 2012.pdf: 3848911 bytes, checksum: 6c2c1f811c32328fc8cdb22d9edaf90a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-20T13:38:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Soraia Santana de Moura - 2012.pdf: 3848911 bytes, checksum: 6c2c1f811c32328fc8cdb22d9edaf90a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T13:38:54Z (GMT). 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The process of development of new drug requires numerous preclinical studies that generate information regarding safety profile in vivo determinants for making the decision to start clinical trials. Although it is a conventional practice, the use of animals in scientific research should happen consciously, always considering the ethical issues of animal experimentation. In this study, we investigated the basal cytotoxicity against 3T3 cells of seven pyrazole compounds (LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, and LQFM023 LQFM024) and classified then in GHS system. Whereas the compound LQFM021 proved to be the most effective in the tests performed in parallel pharmacodynamic study, we investigated whether acute oral toxicity, subacute and mutagenicity of this compound. The results showed that the compounds have low cytotoxicity profile in basal cell line (3T3). The estimated LD50 values for compounds LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, and LQFM023 LQFM024 were 548, 551, 568, 533, 457, 482, 565 mg / kg, respectively. The compounds LQFM020, LQFM023 LQFM024 were classified in category 5 GHS system and LQFM021 was classified in category 4. The subacute toxicological research for 28 days LQFM021 the compound showed that this compound did not affect the metabolic, hematological and biochemical animal parameters in any of the doses of exposure However, the histopathology indicated hepatotoxic and nephrotoxic potential of this compound and interference in the process of hematopoiesis, but did not indicate mutagenic potential. . Given the above, we conside / As doenças cardiovasculares estão entre as doenças de maior letalidade no Brasil e no mundo. Em contrapartida, vê-se um quadro redução das mortes atribuídas às enfermidades cardiovasculares devido, em grande parte, à produção de medicamentos capazes de controlar seus fatores de risco, porém, o vasto relato de efeitos colaterais e contraindicações persistem e interferem negativamente no quadro de morbimortalidade dessas doenças. Neste sentindo, é imprescindível buscar novos fármacos mais efetivos e seguros. O processo de desenvolvimento de um novo fármaco exige numerosos estudos pré-clínicos que geram informações quanto ao seu perfil de segurança in vivo, determinantes para a tomada de decisão de se iniciar os estudos clínicos. Embora seja uma prática convencional, o uso de animais em pesquisas científicas deve ocorrer de forma consciente, considerando sempre as questões éticas de experimentação animal. Neste trabalho, investigou-se a citotoxicidade basal frente as células 3T3 de sete compostos pirazolínicos (LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, LQFM023 e LQFM024) e suas classificações no sistema GHS. Considerando que o composto LQFM021 demonstrou ser o mais eficaz nos ensaios realizados em paralelo de farmacodinâmica, investigou-se toxicidade oral aguda, subaguda e mutagenicidade do composto. Os resultados mostraram que os compostos possuem perfil de baixa citotoxicidade em linhagem basal (3T3). Os valores de DL50 estimados para os compostos LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, LQFM023 e LQFM024 foram 548, 551, 568, 533, 457, 482, 565 mg/kg, respectivamente. Os compostos LQFM020, LQFM023 e LQFM024 foram classificadas na categoria 5 do sistema GHS e o composto LQFM021 foi classificado na categoria 4. A investigação toxicológica subaguda por 28 dias do composto LQFM021 mostrou que este composto não interferiu nos parâmetros metabólico, hematológico e bioquímico dos animais em nenhuma das doses de exposição. No entanto, o estudo histopatológico indicou potencial nefrotóxico e hepatotóxico deste composto e interferência sobre o processo de hematopoiese, entretanto, não apresentou potencial mutagênico. Diante do exposto, consideramos que o composto LQFM021 apresenta um baixo perfil de toxicidade e os estudos de continuidade devem ser encorajados.

As anfetaminas compreendem uma série de compostos com estrutura química semelhante à feniletilamina e que apresentam atividade estimulante do sistema nervoso central. Além de substâncias anorexígenas como o femproporex e a dietilpropiona, também estão incluídas nessa classe drogas ilícitas como a metanfetamina (ice, speed) e a metilenodioximetanfetamina (MDMA, ecstasy). Essas substâncias apresentam grande potencial de abuso, podendo ser utilizadas por diversos grupos sociais como motoristas profissionais (onde são conhecidas por \"rebite\"), estudantes, jovens (utilizando ecstasy em festas denominadas \"raves\") e pessoas que abusam de moderadores de apetite para o controle de peso. Interessantemente, há também a possibilidade de alguns indivíduos utilizarem anfetaminas em associação com benzodiazepínicos. Embora a comercialização dos derivados anfetamínicos tenha sido proibida no Brasil desde 2011, é de conhecimento que algumas pessoas ainda utilizam anorexígenos e recorram ao uso concomitante com benzodiazepínicos como forma de controlar a insônia provocada pelas anfetaminas. Outra situação de uso das duas substâncias ao mesmo tempo seria a de motoristas profissionais, usuários de \"rebite\", que também tentariam controlar os ciclos de sono utilizando benzodiazepínicos. Em vista dessa situação, seria interessante o monitoramento do uso desses grupos de fármacos através de análises toxicológicas. As análises toxicológicas convencionais (realizadas sobremaneira em sangue e urina) geralmente fornecem uma pequena janela de detecção, o que faz com que o uso intermitente possa não ser detectado. Quando se deseja informação de uso em longo prazo ou ainda sobre os padrões de uso de determinada droga, a matriz mais eficiente para realização das análises é o cabelo. No presente projeto, métodos analíticos foram desenvolvidos visando a detecção de fármacos da classe das anfetaminas (anfetamina, metanfetamina, MDMA, MDA e femproporex) e benzodiazepínicos (diazepam, nordiazepam, clordiazepóxido, oxazepam, clonazepam e temazepam) em amostras de cabelo. A microextração em fase líquida (LPME) e a extração em fase sólida (SPE) foram utilizadas como técnicas de preparação de amostras. Os analitos de interesse foram identificados por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Após o desenvolvimento, otimização e validação, os métodos foram aplicados em amostras reais de voluntários suspeitos de utilizar alguma das substâncias em estudo, provenientes de um centro para tratamento de dependência química. Os resultados obtidos com a aplicação dos métodos mostraram sua eficácia para o fim que se destinam. / Amphetamines are a class of compounds with chemical structures similar to phenylethylamines that present stimulant activity in the central nervous system. Anorectic drugs such as fenproporex and diethylpropion and some illicit drugs as methamphetamine (ice, speed) and metilenodioximetamphetamine (MDMA, ecstasy) are also included in this class. These substances have a high abuse potential, and they can be used by various social groups, for example, professional drivers (who call them \"rebites\"), young students (using ecstasy in \"rave\" parties) and people who abuses anorectics to weight control. Interestingly, there is also a possibility of some people using anorectics and benzodiazepines in association. Although the commercialization of amphetamine derivatives has been recently banned in Brazil (2011), it is known that some people still use anorectic drugs and benzodiazepines to control insomnia induced by amphetamines. Another case of concomitant use would be professional drivers, who use \"rebites\", which also try to control their sleep cycles using benzodiazepines. Because of this situation, it would be interesting to monitoring the use of these drugs by toxicological analysis. The conventional toxicological analyses (performed in most cases in blood and urine) generally provide small window detection. In this case, intermittent drug use may not be detected. When long term information about drug use is needed, the most efficient matrix to carry out the analysis is hair. In this project, analytical methods were developed for the determination of amphetamines (amphetamine, methamphetamine, MDMA, MDA and fenproporex) and benzodiazepines (diazepam, nordiazepam, chlordiazepoxide, oxazepam, clonazepam and temazepam) in hair samples. Liquid-phase microextraction (LPME) and solid phase extraction (SPE) were used as sample preparation techniques in these methods. Analites were identified by gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS). After the development, optimization and validation, the methods were applied in hair samples collected from patients of a drug rehabilitation clinic. The results obtained with the application of the developed methods showed their efficacy for the intended purpose.

Foram desenvolvidos métodos de determinação de urina e trítio em urina. Para o urânio foi adaptada a técnica de análise por fluorimetria em meio sólido. O limite de sensibilidade foi de 5. 10-4µg U/0,1 ml e o erro foi de cerca de 10% para concentrações em torno de 0,05 µg U/0,1 ml. Foi padronizado para o trítio o método de análise por cintilação em meio líquido. O método determina quantidades de trítio até pelo menos 8,10-3µCi/ml e o erro foi de cerca de 4% para concentrações de trítio em torno de 0,34 µCi/l. Depois de adaptadas, as técnicas foram aplicadas a amostras de urinas de trabalhadores expostos a compostos de urânio ou trítio com a finalidade de verificar possível contaminação interna por estes radioisótopos. / Abstract not available.

A cotinina, principal produto de biotransformação da nicotina, é considerada um excelente marcador biológico de exposição tanto para fumantes ativos quanto passivos. A cotinina apresenta maior estabilidade química que a nicotina e possui uma meia vida de eliminação de cerca de 40 horas. Assim, um método analítico sensível, preciso e exato foi desenvolvido, para sua determinação, empregando-se a cromatografia em fase gasosa com coluna capilar (HP-Ultra2, 25m x 0.20mm x 0.33µm) e detetor de nitrogênio e fósforo (CGIDNP). A nicotina e a cotinina foram extraídas sob condições alcalinas com diclorometano, de amostras de urina às quais foi adicionado o padrão interno (clorprenalina). Após evaporação do extrato sob fluxo de nitrogênio, o resíduo foi retomado utilizando-se 50 µL de metanol onde 1 µL foi injetado no CG/DNP. O método mostrou-se linear na faixa de 10 a 200 ng/mL com coeficiente de correlação (r) igual a 0,0965 e 0,9966 para a cotinina e nicotina, respectivamente. Os limites de detecção e quantificação foram 5 ng/mL e 10 ng/mL, tanto para a cotinina quanto para a nicotina. A nicotina e a cotinina mantiveram-se estável por 15 e 21 dias a 20°C. A avaliação das amostras de urina de algumas crianças evidenciaram o contato com pais ou parentes fumantes, apresentando resultados de cotinina entre 13,70 a 272,60 ng/mL. O método validado neste trabalho mostrou-se apropriado para a avaliação da presença de cotinina em amostras de urina de fumantes passivos, apresentando as vantagens de fácil execução, curto tempo de análise e baixo custo. / Cotinine, the principal product of biotransformation of nicotine, is considered an excellent biological marker to measure the exposure to cigarette smoke for both the active and passive smokers. Cotinine presents a higher chemical stability than the nicotine and it possesses a half-life of elimination of approximate 40 hours. Therefore, a sensible analytical method, very precise and accurate, was developed using a process of gas chromatography with a nitrogen phosphorous detector (GC/NPD). Nicotine and the cotinine were extracted, under alkaline conditions with dichloromethane, from urine samples which had the internal standard clorprenaline added to them. After evaporation of the extract under nitrogen flux, the residue was retaken using 50 µL of methanol, where 1 µL was injected in the GC/NPD. The method proved to be linear in the range of 10 to 200 ng/mL with a coefficient of correlation (r) equal to 0,0965 and 0,9966 to cotinine and nicotine, respectively. The limits of detection and quantification were 5ng/mL and 10ng/mL for both cotinine and nicotine. Nicotine and cotinine maintained themselves stable for 15 and 21 days at -20 C°. The evaluation of same urine samples taken fron children passively exposured to tobacco throgh there parentes or relatives evidenced cotinine levels fron 13,70 to 272,60 ng/mL. The validated method in this work proved to be appropriate for the evaluation of the cotinine presence in the urine samples taken from.

As microcistinas constituem uma família de heptapeptídeos cíclicos com cerca de 70 variantes caracterizadas. São biossintetizadas em condições específicas por cianobactérias, principalmente em corpos d\'água eutrofizados. Apresentam organotropismo ao fígado e DL50 entre 50-500 µg.kg-1 peso (rato, i.p.). A exposição aguda pode impactar a saúde humana ao desarranjar o parênquima hepatocelular por hiperfosforilação do citoesqueleto e produzir intenso sangramento, podendo levar à morte por choque hipovulêmico um homem adulto e são promotoras tumorais, quando ocorre exposição crônica, por inibição de fosfatases 1 e 2A. Os congêneres das microcistinas apresentam toxicidades distintas e é importante caracterizá-los em corpos d\'água para se estimar o risco à saúde humana. Na literatura, não há convergência quanto à forma de extração das toxinas, preparo das amostras para análise e condições cromatográficas para o isolamento e quantificação. Neste trabalho, diversas análises foram conduzidas para se determinar as melhores formas de extração das toxinas, clean up da amostra e condições cromatográficas para amostras de campo ou cultura de cianobactérias. A extração hidro-alcoólica (MeOH:H2O, 3:1, v/v) parece ser a melhor forma de extração, seguida de partição líquido-líquido para amostras de campo (florações) e extração em fase sólida (cartuchos C18) para algas cultivadas em laboratório. Por meio de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detectores UV-VIS e pela análise do padrão de fragmentação das moléculas por espectrometria de massas (MS) com ionização por eletrospray em Tandem (ESI-MS/MS) determinou-se a presença das variantes de microcistinas MC-RR, MC-LR, MC-YR e MC-hRhR na amostra de água do Reservatório Billings e [Asp3]MC-LR na cepa Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. Este método parece ser adequado para a extração e caracterização de microcistinas presente em corpos d\'água e em cultura de laboratório e a variante MC-hRhR foi caracterizada pela primeira vez na literatura mundial. / It is well known that eutrophicated lakes and water reservoirs can be a serious concern to wildlife, domestic livestock and human health since cyanobacterial blooms are prone to occur. Some cyanobacteria (blue-green algae) species which form bloom may biosynthesize a family of hepatotoxic peptides named microcystins under certain circumstances, related specially to nitrogen: phosphorus ratio, temperature, pH and light intensity of the water body. There are at least 70 variants of microcystins with different toxicity, DL50 ranging from 50 to 500 µg.kg-1 (in mouse, i.p.). Acute exposure provoke hyperphosphorylation of the cytoskeleton, in liver cells, leading to cellular disruption with haemorrhage and the long term exposure can cause tumor promotion by inactivation of serine/threonine phosphatases 1 and 2A (PP1 and PP2A). Therefore, it is very important to determine and quantify microcystin variants present in water reservoirs. There are several methods available to evaluate qualitative and quantitatively microcystin and its variants in water reservoir and estimate human risks. Such methods comprise biological, biochemical and physico-chemical assays. In this work, we have isolated and analyzed hepatotoxins by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with photodiode array (PDA) detector and their structures were elucidated by Tandem - MS/MS with eletrospray ionization (ESI-MS/MS). MC-RR, MC-LR, MC-YR and MC-hRhR were determined in samples collected at Billings reservoir and [Asp3]MC-LR was found in the strain Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. The procedures developed herein can be a powerful tool for isolation and determination of microcistin and its derivatives founded in water reservoirs. Also, we have described for the first time a new variant of microcistin: MC-hRhR.

Development and validation of methods for analysis of several drugs or their metabolites are decribed in this thesis. The document is presented as a commentary to the original papers, which were published in peer reviewed journals. Discussion on the optimization of each method is presented and covers also method development and influence of preanalytical aspects. Additionally, examples of the application of the developed methods in clinical pharmacology and toxicology are shown. This dissertation consists of three parts: enantiomeric determination of tramadol and its metabolite, determination of some antihypertensive drugs, and qualitative analysis of benzodiazepines. Development of a method for chiral analysis of tramadol and its desmethylated metabolite O- desmethyltramadol (ODT) in human urine and plasma is described in the first part of the thesis. Tramadol is a centrally acting analgetic drug, which is used as racemate in clinical practise. Each enantiomer displays different binding properties for various receptors: (+)-tramadol preferentially inhibits serotonin reuptake while (-)-tramadol mainly inhibits noradrenalin reuptake. (+)-tramadol is considered 10-times more potent than (-)-tramadol. Major active metabolite (ODT), which is considered to be the main agent responsible for the...

O benzeno é um solvente comprovadamente cancerígeno e, para substâncias com tal característica, não há limites de exposição considerados seguros. Em vista disso, as discussões internacionais e nacionais visam a diminuir, cada vez mais, os níveis de exposição ocupacional permitidos. O ácido trans, trans-mucônico (ttAM) , um produto de biotransformação do benzeno, tem sido preconizado como um bioindicador sensível da exposição ao solvente. Este trabalho foi desenvolvido com o propósito de validar método capaz de detectar o ttAM em urina de indivíduos expostos ao benzeno, bem com estabelecer o melhor período de coleta das amostras. A técnica escolhida foi a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com coluna de fase-reversa, Lichrosorb RP 18, e detector de ultra-violeta. O método mostrou-se linear entre 0,2 a 5,0 mg/L (r2 = 0,9943). Os limites de detecção e de quantificação obtidos foram, respectivamente, 0,1 e 0,2 mg/L. A porcentagem de recuperação absoluta média foi de 77,1% e de inexatidão de 27,9%. Os coeficientes de variação médios foram, para a precisão intra-ensaio 7,7 % e, para a interensaio 10,6%. O analito permaneceu estável na matriz por um período de 6 semanas para a concentração de 0,2 mg/L e de 15 semanas, para a 2,0 mg/L, se armazenada em freezer (-20°C) e por até dez dias sob refrigeração (4°C) para os adicionados de 0,2, 2,0 e 5,0 mg/L. Com estes resultados, a validação foi considerada satisfatória. O valor médio obtido nas amostras de trabalhadores ocupacionalmente expostos no final da jornada de trabalho foi de 0,81 mg/g creatinina (mediana=0,62 mg/g creatinina). Estes resultados foram superiores e estatisticamente diferentes (p=0,025) daqueles encontrados em amostras do início da jornada e do dia seguinte, mostrando ser o final da jornada o período que melhor reflete a exposição do dia de trabalho. / Benzene is a carcinogenic chemical used in many plants. The national and international discussions aim to low more and more the permitted occupational exposure limit to benzene, although in fact, there is no safe limit to carcinogens. The trans, trans-muconic acid (ttMA), a benzene metabolite, has been recommended as a sensitive bioindicator in the biological monitoring of workers exposed to this solvent. This work was developed in order to validate a method for ttMA analysis in samples of benzene-exposed workers as well as to establish the best sample collecting time. The chosen technique was the high pressure liquid chromatography with reverse-phase column, Lichrosorb RP 18, and UV detection. A linear relationship (r2 =0.9943) was observed in the range from 0.2 to 5.0 mg/L. The detection and quantification limits were respectively 0.1 and 0.2 mg/L. The average recovery was 77.1 % and the inaccuracy (bias) was 27.9 %. Precision, evaluated by variation coefficient, were 7.7 % (intraassay) and 10.6 % (inter-assay). The ttMA remained stable in the matrix during a period of six weeks for the 0.2 mg/L samples and fifteen weeks for the 2.0 mg/L samples, in both cases when stored at - 20°C. In 0.2, 2.0 and 5.0 spiked samples no significant differences were found when conserved at 4°C for ten days. In the occupationally exposed workers, ttMA values were significantly higher in post-shift samples (p = 0.025) than in pre-shift or in those collected in the following day. These results reveal that the end of the shift is the best period to take urine samples for benzene biomonitoring.