Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online as viewed 8/06/2009 through Digital Dissertations.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

O Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) ou Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) é de grande importância para a Saúde Pública, quanto às doenças veiculadas por alimentos. O objetivo deste trabalho foi verificar a aplicabilidade do uso desse sistema na indústria de moagem de trigo, no processamento de farinha de trigo integral, produto com demanda crescente no mercado. Trinta produções de farinha foram coletadas numa indústria cuja capacidade de moagem é de 15ton./h na cidade de São Paulo. A população amostrada foi de 30 sub-amostras de trigo argentino (A) (12,8% de umidade média), 17 sub-amostras de trigo brasileiro (B) (13,1% de umidade média), 30 sub-amostras de trigo preparado para moagem (M) (15,6% de umidade média) e 30 sub-amostras de farinha de trigo integral (FTI), coletadas num período de 5 meses (de outubro de 97 à março de 98). A metodologia utilizada para pesquisa de sujidades leves foi a adotada pelos Métodos Oficiais da AOAC (1995). Houve modificações no método e um estudo foi realizado para conhecer sua performance. No isolamento de fungos foi utilizada a metodologia empregada pela AOAC/FDA Bacteriological Analytical manual (1992). Para identificação de fungos em relação ao gênero foi utilizado o método preconizado GELLI et al.(1990), SAMSON et al (1995), PITT and HOCKING (1997). Na análise de sujidades leves nos trigos foi evidenciada a contaminação por ácaros (A=90%, B=53%, M=77% e FTI=53%); no trigo argentino houve uma predominância para a família Tarsonemidae, enquanto que na respectiva farinha foi a família Acaridae. Alguns ácaros dessa última família estão implicados em reações alérgicas e estão sendo tratados como emergentes na segurança alimentar. Os insetos thisanópteros, os mais freqüentes nos trigos, foram eliminados na farinha de trigo integral. O percentual médio de contaminação fúngica dos grãos foi de A=99%, B=95% e M=94%. O principal gênero encontrado foi Aspergillus spp (A= 79,0%, B= 39,3% e M= 64,2%). O menos freqüente Fusarium spp (A= 2,9%, B= 2,7% e M=1,5%). Na farinha de trigo integral o principal gênero encontrado foi o Penicillium spp e o Fusarium não foi isolado. O desoxinivalenol foi encontrado em uma amostra de farinha de trigo integral a uma concentração de 231 ng/g. O sistema APPCC se aplica aos moinhos e os auxilia a controlar suas produções do ponto de vista da segurança alimentar. / Food safety is a major concern facing the food industry today. Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) provides a structured approach to the assurance of safety of products. The aim of this study was to verify the use of HACCP system in a milling industry, precisely in the whole wheat flour production. At first step two hazards were analyzed: deoxynivalenol and allergenic mites in whole wheat flour Thirty (30) lots of flour were collected in an industry which capacity was 15 ton./h in São Paulo city. Those lots had 30 sub-samples of argentine (A) wheat (12,8% average moisture content), 17 sub-samples of brazilian (B) wheat (13,1% m.c.), 30 sub-samples of wheat for milling (M) (15,6% m.c), and 30 sub-samples of whole wheat flour (FTI) that were analyzed in a five months period (from 97/october to 98/march). Light filth was isolated from grains and flour, according to Official Methods of AOAC International. Methodology of extraction of light filth from whole wheat flour was studied to know the repeatability according to AOAC methods. Fungi isolation was performed according to AOAC/FDA Bacteriological Analytical Manual (1992) methodology; genera were identified according GELLI et al.(1990), SAMSON et al (1995), and PITI and HOCKING (1997). Detection and quantification of deoxynivalenol (DON) were done by thin layer chromatography (TLC) according to SABINO et al. (1989).The most significant light filth contamination in wheat were mites (A= 90%, B= 53%, M= 77% e FTI= 57%), argentine wheat had as a predominant mite the family Tarsonemidae and flour had Acaridae. The average fungal contamination in grains was 99%, 95% e 94% in argentine, brazilian and wheat for milling respectively. The predominant genera was Aspergillus spp ( A= 79,0, B=39,3% e M= 64,2 %), and Fusarium was the least frequent in wheat (A>/b>=2,7%, B= 2,8% e M=1,5%). Only one lot of whole wheat flour was contaminated by DON at level 231 ng/g. This study showed that HACCP system is appropriated for control hazards in milling industry. However, DON should be controlled before wheat get into industry, and this control need to be registered. Mites are new emergentes to cause allergy by ingestion and have to be controlled by GMP procedures.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

O Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) ou Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) é de grande importância para a Saúde Pública, quanto às doenças veiculadas por alimentos. O objetivo deste trabalho foi verificar a aplicabilidade do uso desse sistema na indústria de moagem de trigo, no processamento de farinha de trigo integral, produto com demanda crescente no mercado. Trinta produções de farinha foram coletadas numa indústria cuja capacidade de moagem é de 15ton./h na cidade de São Paulo. A população amostrada foi de 30 sub-amostras de trigo argentino (A) (12,8% de umidade média), 17 sub-amostras de trigo brasileiro (B) (13,1% de umidade média), 30 sub-amostras de trigo preparado para moagem (M) (15,6% de umidade média) e 30 sub-amostras de farinha de trigo integral (FTI), coletadas num período de 5 meses (de outubro de 97 à março de 98). A metodologia utilizada para pesquisa de sujidades leves foi a adotada pelos Métodos Oficiais da AOAC (1995). Houve modificações no método e um estudo foi realizado para conhecer sua performance. No isolamento de fungos foi utilizada a metodologia empregada pela AOAC/FDA Bacteriological Analytical manual (1992). Para identificação de fungos em relação ao gênero foi utilizado o método preconizado GELLI et al.(1990), SAMSON et al (1995), PITT and HOCKING (1997). Na análise de sujidades leves nos trigos foi evidenciada a contaminação por ácaros (A=90%, B=53%, M=77% e FTI=53%); no trigo argentino houve uma predominância para a família Tarsonemidae, enquanto que na respectiva farinha foi a família Acaridae. Alguns ácaros dessa última família estão implicados em reações alérgicas e estão sendo tratados como emergentes na segurança alimentar. Os insetos thisanópteros, os mais freqüentes nos trigos, foram eliminados na farinha de trigo integral. O percentual médio de contaminação fúngica dos grãos foi de A=99%, B=95% e M=94%. O principal gênero encontrado foi Aspergillus spp (A= 79,0%, B= 39,3% e M= 64,2%). O menos freqüente Fusarium spp (A= 2,9%, B= 2,7% e M=1,5%). Na farinha de trigo integral o principal gênero encontrado foi o Penicillium spp e o Fusarium não foi isolado. O desoxinivalenol foi encontrado em uma amostra de farinha de trigo integral a uma concentração de 231 ng/g. O sistema APPCC se aplica aos moinhos e os auxilia a controlar suas produções do ponto de vista da segurança alimentar. / Food safety is a major concern facing the food industry today. Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) provides a structured approach to the assurance of safety of products. The aim of this study was to verify the use of HACCP system in a milling industry, precisely in the whole wheat flour production. At first step two hazards were analyzed: deoxynivalenol and allergenic mites in whole wheat flour Thirty (30) lots of flour were collected in an industry which capacity was 15 ton./h in São Paulo city. Those lots had 30 sub-samples of argentine (A) wheat (12,8% average moisture content), 17 sub-samples of brazilian (B) wheat (13,1% m.c.), 30 sub-samples of wheat for milling (M) (15,6% m.c), and 30 sub-samples of whole wheat flour (FTI) that were analyzed in a five months period (from 97/october to 98/march). Light filth was isolated from grains and flour, according to Official Methods of AOAC International. Methodology of extraction of light filth from whole wheat flour was studied to know the repeatability according to AOAC methods. Fungi isolation was performed according to AOAC/FDA Bacteriological Analytical Manual (1992) methodology; genera were identified according GELLI et al.(1990), SAMSON et al (1995), and PITI and HOCKING (1997). Detection and quantification of deoxynivalenol (DON) were done by thin layer chromatography (TLC) according to SABINO et al. (1989).The most significant light filth contamination in wheat were mites (A= 90%, B= 53%, M= 77% e FTI= 57%), argentine wheat had as a predominant mite the family Tarsonemidae and flour had Acaridae. The average fungal contamination in grains was 99%, 95% e 94% in argentine, brazilian and wheat for milling respectively. The predominant genera was Aspergillus spp ( A= 79,0, B=39,3% e M= 64,2 %), and Fusarium was the least frequent in wheat (A>/b>=2,7%, B= 2,8% e M=1,5%). Only one lot of whole wheat flour was contaminated by DON at level 231 ng/g. This study showed that HACCP system is appropriated for control hazards in milling industry. However, DON should be controlled before wheat get into industry, and this control need to be registered. Mites are new emergentes to cause allergy by ingestion and have to be controlled by GMP procedures.

Dentre os perigos relacionados com a produção de café verde, a ocratoxina A (OTA) é considerada significativa nesse produto. Com o objetivo de estudar a origem da OTA no processamento de café verde e avaliar os possíveis fatores de risco (região, etapas do processamento, fungos, insetos e ácaros) que poderiam contribuir na presença de OTA, foram amostradas três fazendas nos seguintes municípios: Bom Jardim (RJ), Espírito Santo do Pinhal (SP) e Cornélio Procópio (PR), onde havia a produção de café verde pela via seca e úmida. Foram coletadas 109 amostras de grãos de café, em diversas etapas do processamento, no período de maio a agosto de 2002. As amostras foram colhidas de acordo com fluxograma estabelecido e as etapas estudadas foram: cereja (campo), via seca, via úmida, armazém e café de varrição. Dessas amostras, 10 apresentaram OTA, que variou na sua quantificação de 3 a 101 ng.g-1. A maior prevalência de OTA foi a do café de varrição 57%, a via úmida apresentou uma prevalência de 10,3% e a via seca 7%. Na etapa cereja o fungo potencialmente toxigênico mais encontrado foi Penicillium spp, e quanto aos insetos, as larvas de Diptera e os Homoptera; na via úmida foram encontradas linhagens do Aspergillus seção Nigri e Circundatti e Penicillium spp, a infestação predominante foi a broca do café e os ácaros da família Acaridae; na etapa via seca registrou-se o isolamento de fungos do gênero Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri , a broca do café foi a infestação predominante junto com os ácaros da família Acaridae, na etapa de armazém foram isolados Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri, o inseto predominante foi a broca do café e os ácaros da família Acaridae; no café de varrição foram isolados Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri e a broca do café estava presente junto com insetos da Ordem Diptera. Os resultados de cada etapa foram comparados por Análise de Variância em um nível de significância de 95%. Na análise de fatores de risco o café de varrição foi o mais significativo (p< 0,001). / The ochratoxin A (OTA) is considered to be among the most significant coffee contaminants with related hazards. With the purpose to study the origin of the OTA in the processing of green coffee and to evaluate the possible risk factors (region, step of processing, fungi, insects and mites) that could contribute in the OTA presence, had been selected three regions (states) of Brazil: Bom Jardim/RJ, Espírito Santo do Pinhal/SP and Cornélio Procópio/PR. A total of 109 samples of coffee beans were collected in conformity with flow chart established at different stages of ripening and processing: cherry (field), dry method, wet method, and warehouse and varrição coffee, from May to August of 2002. Of these samples 10 had presented OTA, which varied in its quantification from 3 to 101 ng.g-1. The biggest prevalence of OTA was the varrição coffee 57%, the wet method presented a prevalence of 10,3% and dry way 7%. In the stage cherry fungi potentially toxigenic was more found Penicillium spp, the insects had been the larvae of Diptera and the Homoptera; in the wet way it was found Aspergillus section Nigri and Circundatti and Penicillium spp, the predominant infestation was the coffee berry borer and the mite of the Acaridae family; in the stage wet methods spp was registered the isolation the Penicillium spp and Aspergillus section Nigri, the predominant infestation was the coffee berry borer together with the mites of the Acaridae family; in the stage of warehouse had been isolated Penicillium spp and Aspergillus section Nigri, and the predominant insect was the coffee berry borer and mites of the family Acaridae; in the varrição coffee had been isolated Penicillium spp and Aspergillus section Nigri the coffee berry borer was the most present insects together of Diptera. The results of each step had been with compared by Analysis of Variance. In the analysis of risk factors the varrição coffee\" was the factor most strongly related to the risk of the presence of OTA (p<0,001 ).

Dentre os perigos relacionados com a produção de café verde, a ocratoxina A (OTA) é considerada significativa nesse produto. Com o objetivo de estudar a origem da OTA no processamento de café verde e avaliar os possíveis fatores de risco (região, etapas do processamento, fungos, insetos e ácaros) que poderiam contribuir na presença de OTA, foram amostradas três fazendas nos seguintes municípios: Bom Jardim (RJ), Espírito Santo do Pinhal (SP) e Cornélio Procópio (PR), onde havia a produção de café verde pela via seca e úmida. Foram coletadas 109 amostras de grãos de café, em diversas etapas do processamento, no período de maio a agosto de 2002. As amostras foram colhidas de acordo com fluxograma estabelecido e as etapas estudadas foram: cereja (campo), via seca, via úmida, armazém e café de varrição. Dessas amostras, 10 apresentaram OTA, que variou na sua quantificação de 3 a 101 ng.g-1. A maior prevalência de OTA foi a do café de varrição 57%, a via úmida apresentou uma prevalência de 10,3% e a via seca 7%. Na etapa cereja o fungo potencialmente toxigênico mais encontrado foi Penicillium spp, e quanto aos insetos, as larvas de Diptera e os Homoptera; na via úmida foram encontradas linhagens do Aspergillus seção Nigri e Circundatti e Penicillium spp, a infestação predominante foi a broca do café e os ácaros da família Acaridae; na etapa via seca registrou-se o isolamento de fungos do gênero Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri , a broca do café foi a infestação predominante junto com os ácaros da família Acaridae, na etapa de armazém foram isolados Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri, o inseto predominante foi a broca do café e os ácaros da família Acaridae; no café de varrição foram isolados Penicillium spp e Aspergillus seção Nigri e a broca do café estava presente junto com insetos da Ordem Diptera. Os resultados de cada etapa foram comparados por Análise de Variância em um nível de significância de 95%. Na análise de fatores de risco o café de varrição foi o mais significativo (p< 0,001). / The ochratoxin A (OTA) is considered to be among the most significant coffee contaminants with related hazards. With the purpose to study the origin of the OTA in the processing of green coffee and to evaluate the possible risk factors (region, step of processing, fungi, insects and mites) that could contribute in the OTA presence, had been selected three regions (states) of Brazil: Bom Jardim/RJ, Espírito Santo do Pinhal/SP and Cornélio Procópio/PR. A total of 109 samples of coffee beans were collected in conformity with flow chart established at different stages of ripening and processing: cherry (field), dry method, wet method, and warehouse and varrição coffee, from May to August of 2002. Of these samples 10 had presented OTA, which varied in its quantification from 3 to 101 ng.g-1. The biggest prevalence of OTA was the varrição coffee 57%, the wet method presented a prevalence of 10,3% and dry way 7%. In the stage cherry fungi potentially toxigenic was more found Penicillium spp, the insects had been the larvae of Diptera and the Homoptera; in the wet way it was found Aspergillus section Nigri and Circundatti and Penicillium spp, the predominant infestation was the coffee berry borer and the mite of the Acaridae family; in the stage wet methods spp was registered the isolation the Penicillium spp and Aspergillus section Nigri, the predominant infestation was the coffee berry borer together with the mites of the Acaridae family; in the stage of warehouse had been isolated Penicillium spp and Aspergillus section Nigri, and the predominant insect was the coffee berry borer and mites of the family Acaridae; in the varrição coffee had been isolated Penicillium spp and Aspergillus section Nigri the coffee berry borer was the most present insects together of Diptera. The results of each step had been with compared by Analysis of Variance. In the analysis of risk factors the varrição coffee\" was the factor most strongly related to the risk of the presence of OTA (p<0,001 ).

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonizes the intestine and produces the phage-encoded Shiga toxin (Stx) which is absorbed systemically and can lead to hemolytic uremic syndrome (HUS) characterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia, and renal failure. EHEC, and two related pathogens, Enteropathogenic E. coli (EPEC), and the murine pathogen, Citrobacter rodentium, are attaching and effacing (AE) pathogens that intimately adhere to enterocytes and form actin “pedestals” beneath bound bacteria. The actin pedestal, because it is a unique characteristic of AE pathogens, has been the subject of intense study for over 20 years. Investigations into the mechanism of pedestal formation have revealed that to generate AE lesions, EHEC injects the type III effector, Tir, into mammalian cells, which functions as a receptor for the bacterial adhesin intimin. Tir-intimin binding then triggers a signaling cascade leading to pedestal formation. In spite of these mechanistic insights, the role of intimin and pedestal formation in EHEC disease remains unclear, in part because of the paucity of murine models for EHEC infection. We found that the pathogenic significance of EHEC Stx, Tir, and intimin, as well as the actin assembly triggered by the interaction of the latter two factors, could be productively assessed during murine infection by recombinant C. rodentium expressing EHEC virulence factors. Here we show that EHEC intimin was able to promote colonization of C. rodentium in conventional mice. Additionally, previous in vitro data indicates that intimin may have also function in a Tir-independent manner, and we revealed this function using streptomycin pre-treated mice. Lastly, using a toxigenic C. rodentium strain, we assessed the function of pedestal formation mediated by Tir-intimin interaction and found that Tir-mediated actin polymerization promoted mucosal colonization and a systemic Stx-mediated disease that shares several key features with human HUS.