Foi pesquisada a habilidade de carunchos Sitophilus zeamais em veicular esporos de Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides e a conseqüente produção de micotoxinas. Grãos de milho foram mantidos em frascos conectados por uma mangueira formando um sistema fechado (lados A e B) e divididos em seis grupos: G1 (milho + caruncho - Lado A); G2 (Milho + A. flavus - Lado A); G3 (milho + A. flavus + caruncho - Lado A); G4 (milho + F. verticillioides - Lado A), G5 (milho + F. verticillioides + caruncho - Lado A) e G6 (milho + A. flavus + F. verticillioides + caruncho - Lado A). O lado B continha grãos estéreis. Após 10, 20 e 30 dias de incubação foram realizadas: pesagem, atividade de água, microbiota fúngica, determinação de micotoxinas, análise nutricional, microscopia eletrônica de varredura e PCR-RT em tempo real. Frente aos resultados obtidos constata-se a importância do Sitophillus zeamais como vetor de fungos e a importância de boas práticas de manipulação e armazenamento de grãos, visando reduzir os riscos de contaminação e deterioração. / The weevils Sitophilus zeamais ability was examined to propagate spores of Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides and the production of mycotoxins. Corn grains was conserved in flasks connected by a rubber to form a closed system (side A and B) and divided in six groups: G1 (corn + weevil - side A); G2 (corn + A. flavus - side A); G3 (corn + A. flavus + weevil - side A); G4 (corn + F. verticillioides - side A), G5 (corn + F. verticillioides + weevil - side A) e G6 (corn + A. flavus + F. verticillioides + weevil - side A). The side B contained sterile grains. After 10, 20 and 30 days of incubation were realized: weighing, activity water, mycoflora, determination of mycotoxins, nutritional analysis, scanning electron microscope and Real time PCR-RT. In front of the results was observed the importance of Sitophilus zeamais like a fungus vector and the importance of Good Manufacturing Practices and Stores of grains, to reduce the risks of contamination and deterioration.

O objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de aflatoxina e fumonisina no sistema de produção de frango de corte e o impacto destas micotoxinas nos índices produtivos em uma empresa integradora localizada no Estado de São Paulo. Adicionalmente, foram identificados os principais fatores para a produção de micotoxinas em rações e a ocorrência de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas em tecidos comestíveis de frango (músculo peitoral, fígado e moela). Foram realizadas as contagens de fungos e leveduras totais, de fungos dos gêneros Aspergillus ssp. e Fusarium ssp. e quantificação de aflatoxina e fumonisina nas principais matérias-primas da ração (milho e farelo de soja), na ração de abate e na cama de frango. O isolamento de fungos nas amostras de milho, farelo de soja e ração foi realizado em ágar DG18, enquanto que, para as amostras de cama de frango, utilizou-se o ágar PDA. Para a extração de aflatoxinas e fumonisinas, foram utilizadas colunas de imunoafinidade (Neogen®) e colunas SAX de troca iônica, respectivamente. A quantificação das aflatoxinas e fumonisinas foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O milho foi o alimento onde foi observada a maior frequência de Aspergillus ssp. e Fusarium ssp., e também maior positividade para aflatoxinas e fumonisinas, sendo que uma das amostras ultrapassou o limite de aflatoxinas recomendado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). As quantidades de aflatoxinas e fumonisinas encontradas na ração não influenciaram significativamente os índices produtivos. Não foram encontrados níveis detectáveis de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas nos tecidos analisados. Embora não tenham sido observadas lesões macroscópicas no fígado e bursa das aves, foram constatadas alterações histopatológicas nessas vísceras, as quais são compatíveis com lesões causadas pela ingestão de aflatoxinas e fumonisinas. / The objective of this study was to verify the occurrence of aflatoxin and fumonisin in poultry feed and their influence on poultry productivity at company located in São Paulo State. Supplementary, were identified the main factors that cause mycotoxin production in poultry feed and determine the occurrence of aflatoxins and fumonisins residues in edible parts of poultry (breast, liver and gizzard). The total mold and yeast counting of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. genus and quantification of aflatoxin and fumonisin were determined in the main feed ingredients (corn and soybean meal), in finishing diets and bedding. The fungi from corn, soybean meal and feed were isolated in DG18 agar, whereas, the fungi from bedding was used PDA agar. Aflatoxins and fumonisins, were extracted using an immunoaffinity column (Neogen®) and a SAX column, respectively. Aflatoxins and fumonisins were quantified by high performance liquid chromatografy (HPLC). The corn showed the highest frequency of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. and also the highest positivity for aflatoxins and fumonisins, there was one corn sample that exceeded the recommendations of the Brazilian Ministry of Agriculture. The levels of aflatoxins and fumonisins in the feed did not significantly influence productivity. There were not detectable levels of aflatoxins and fumonisins on analysed tissues. Although macroscopic lesions were not observed in liver and bursa, histopathological changes were observed in these organs, which are consistent with injuries caused by the aflatoxin and fumonisin consumption.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O mel é um suplemento alimentar que vem recebendo um incremento no consumo, decorrente das diversas propriedades benéficas à saúde. A microbiota do mel é constituída por leveduras, fungos filamentosos e bactérias. Este alimento tem um alto valor comercial e está sujeito à fraudes e adulterações, que podem favoreçer o aumento do número de colônias de micro-organismos, principalmente de fungos filamentosos, o que poderá acarretar na produção de micotoxinas. Alguns fungos são patogênicos, oportunistas e responsáveis por doenças nos seres humanos, através de alimentos contaminados pela presença de micotoxinas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar micologicamente amostras de méis produzidos em Roraima visando à segurança alimentar deste alimento. Foram realizadas análises de méis procedentes do apiário experimental da Universidade Federal de Roraima/UFRR, de apiários dos municípios roraimenses de Mucajaí e Cantá e de uma marca disponível no comércio de Boa Vista, coletados nos períodos chuvoso e seco, perfazendo um total de oito amostras. Os fungos filamentosos e leveduras foram isolados e as unidades formadoras de colônia (UFC) foram quantificadas para enquadramento na legislação do Mercosul. O método convencional de identificação foi baseado em características de macro e micromorfologia, e utilizou-se o método molecular na PCR de rDNA e amplificação da região ITS1-5.8S-ITS2 com os iniciadores universais ITS1 e ITS4 para confirmação. Das amostras analisadas, somente a coletada no apiário de Mucajaí no período chuvoso foi considerada imprópria, devido a quantidade de fungos filamentosos e/ou leveduras que excederam 100 UFC. Foram obtidas 63 UFC de fungos filamentosos das amostras de méis roraimenses, as quais foram agrupadas em 19 morfotipos pertencentes aos gêneros Penicillium, Paecilomyces, Humicola, Cladosporium e Monodictys. E as espécies Eurotium amstelodami, E. rubrum, Paecilomyces formosus, Penicillium citreonigrum, P. hispanicum, Syncephalastrum racemosum, Talaromyces mineoluteum e T. phialosporus. Todos os gêneros isolados são potencialmente toxigênicos, com exceção de Syncephalastrum. Os parâmetros micológicos observados nas amostras reforçam a necessidade do controle de qualidade dos méis na região, bem como da implantação de Boas Práticas de Fabricação. / Honey is a food supplement that has received an increase in consumption arising from the various beneficial health properties. The honey microflora comprises yeast, filamentous fungi and bacteria. This food has a high commercial value and is subject to fraud and adulteration that may favor the increase of the number of colonies of these microorganisms, principally filamentous fungi, which may result in producing mycotoxins. Some fungi are pathogenic, opportunistic and responsible for diseases in humans through food stricen by mycotoxins. This study aims at characterizing mycologically samples of honey produced in Roraima aimed at food security of this food. Honey analyzes were carried out coming from the experimental apiary of the Federal University of Roraima / UFRR, apiaries Mucajaí and Cantá and a trademark, collected in the periods rainy and dry, a total of eight samples. Filamentous fungi and yeasts were isolated and colony forming units (UFC) were quantified for the framework of Mercosul legislation. The conventional method of identification was based on macro and micro-morphology characteristics and molecular method, the PCR and amplification of rDNA ITS2-ITS1-5.8S with universal primers ITS1 and ITS4. Just the samples analyzed collected in the apiary of Mucajaí the rainy season, it was considered inappropriate because the amount of filamentous fungi and / or yeasts that exceeded 100 UFC. 63 UFC were obtained from filamentous fungi Roraima honey samples, which were grouped into 19 morphotypes belonging to the genera Penicillium; Paecilomyces, Syncephalastrum, Humicola, Cladosporium, Eurotium e Monodictys, and the species Eurotium amstelodami, E. rubrum, Paecilomyces formosus, Penicillium citreonigrum, P. hispanicum, Syncephalastrum racemosum, Talaromyces mineoluteum e T. phialosporus. All are potentially toxigenic isolated genres, except Syncephalastrum. The mycological parameters observed in the samples reinforces the need for quality control of honey in the region as well as the implementation of Good Manufacturing Practices.

O aumento da demanda, a falta de fiscalização sanitária efetiva e de especificações adequadas para verificar a qualidade de drogas vegetais são fatores que contribuem para o acesso a produtos sem garantia da qualidade e segurança. Embora sejam consideradas seguras por sua origem natural, as drogas vegetais apresentam elevadas cargas microbianas e podem oferecer riscos potenciais aos usuários, tanto pela presença de microrganismos potencialmente patogênicos, quanto pela contaminação com toxinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a contaminação microbiana presente em 91 amostras de drogas vegetais, o potencial toxigênico de fungos isolados e a presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina nestas amostras. Os resultados obtidos demonstraram que 73,6% das amostras apresentaram populações microbianas superiores a 2X103 UFC de bactérias aeróbias/g e 2X102 UFC de bolores e leveduras/g e que 81,3% apresentaram ao menos um dos microrganismos considerados indicadores de risco. Com relação à contaminação fúngica, observou-se o predomínio dos gêneros Aspergillus e Penicillium, sendo que a análise micotoxicológica revelou que 21,49% apresentaram capacidade para produção de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina. Apesar de fungos toxigênicos terem sido detectados em 35 amostras de drogas vegetais, a análise micotoxicológica, realizada conforme Farmacopéia Americana, não revelou a presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina em nenhuma das amostras de drogas vegetais, indicando que os microrganismos podem não terem sido submetidos a condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica. / The increase in the demand, the lack of effective sanitary fiscalization and adjusted specifications to verify the quality of crude herbal drugs are factors that contribute for accessing products without guarantee of the quality and safety. Although they are considered safe by their natural origin, herbal drugs present high microbial loads and can offer potential risks to the users, as much for the presence of potencially pathogenic microorganisms, how much for the contamination with toxins. The goal of this study was evaluated the microbial contamination present in 91 samples of crude herbal drugs, the toxigenic potencial of fungal isolates and the presence of aflatoxins, ochratoxin A and citrinin in these samples. The obtained results demonstrated 73.6% of the samples presented microbial populations higher than 2X103 CFU of aerobic bacteria/g and 2X102 CFU of yeast and molds/g and 81.3% presented at least one of the microorganisms considered as risk indicators. With regard to the fungal contamination, the Aspergillus and Penicillium genera were predominant and the mycotoxicological analysis revealed that 21.49% of these isolates presented ability for aflatoxins, ochratoxin A and citrinin production. Although toxigenic fungi have been detected in 35 samples of herbal drugs, the mycotoxicological analysis, carried through as The United States Pharmacopeia, showed no detection of aflatoxins, ochratoxin A or citrinin in any samples of herbal drugs, indicating that these fungi can not have been submitted a favorable conditions to the expression of their toxigenic ability.

A exposição humana a microrganismos patogênicos e suas toxinas em alimentos constitui um grave problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antimicrobianos convencionais promove o aumento da resistência dos microrganismos às principais moléculas existentes no mercado. Além disso, as limitações do uso de substâncias químicas em matérias primas alimentares têm estimulado pesquisas para o desenvolvimento de metodologias eco-amigáveis para evitar a multiplicação de fungos e/ou eliminar suas toxinas. O Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias patogênicas que apresenta taxas elevadas de resistência aos antimicrobianos, e por este motivo tem sido objeto de estudo de pesquisas que tentam identificar novos compostos bioativos para o combate de infecções. O Aspergillus parasiticus é um dos principais fungos produtores de aflatoxinas, substâncias carcinogênicas que contaminam diversos tipos de cereais antes e após o processamento. Estudos recentes demonstraram que extratos de plantas possuem atividade antimicrobiana e antifúngica, além de potencial para degradação de micotoxinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos brutos e liofilizados de folhas de maracujá, araçá, alecrim e orégano sobre células planctônicas de S. aureus e A. parasiticus, bem como verificar a capacidade dos referidos extratos em degradar in vitro a aflatoxina B1 (AFB1), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Os efeitos antibacterianos e antifúngicos dos extratos foram avaliados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida / fungicida mínima (CBM/CFM). Os ensaios de degradação da micotoxinas foram realizados em diferentes tempos de incubação (12-48 h) a 37º C, utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação das concentrações das micotoxinas. O maracujá não demonstrou atividade antimicrobiana tanto para S. aureus quanto para A. parasiticus. Dos quatro extratos estudados, o araçá demonstrou o maior efeito antibacteriano, cujos valores de CIM para extratos bruto e liofilizado foram 0.39 mg/mL e 0.45 mg/mL, respectivamente. Os menores valores de CIM para A. parasiticus foram obtidos com o orégano liofilizado (8.33 mg/mL) e o araçá bruto (3.215 mg/mL). Contudo, não foi possível identificar valores de CFM para o fungo analisado. Não houve efeito de degradação de OTA e ZEA por nenhum dos extratos avaliados. Todos os extratos reduziram a concentração de AFB1 após 48 h de incubação. A maior porcentagem (60.3%) de redução de AFB1 foi obtida com o extrato de alecrim após 48 h de incubação. A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos das plantas avaliadas indica um potencial para sua aplicação no combate a bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Este é o primeiro estudo realizado com extratos dessas quatro espécies de plantas que evidenciou a capacidade de redução in vitro de AFB1. / Human exposure to pathogenic microorganisms and their toxins in food is a serious public health problem. The indiscriminate use of conventional antimicrobials increases the resistance of microorganisms to the main molecules available in the market. In addition, limitations on the use of chemical substances in food raw materials have stimulated researches for the development of eco-friendly methodologies to avoid the multiplication of fungi and/or eliminate their toxins. Staphylococcus aureus is one of the major pathogenic bacteria with high rates of antimicrobial resistance, and for this reason it has been the subject of research studies aiming to identify new bioactive compounds to combat infections. Aspergillus parasiticus is one of the main aflatoxin-producing fungi, which are carcinogenic substances that contaminate many types of cereals before and after processing. Recent studies have demonstrated that plant extracts have antimicrobial and antifungal activity, as well as potential for degradation of mycotoxins. In this context, the objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial effects of crude and lyophilized extracts of leaves from sweet passion fruit, araçá, rosemary and oregano on planktonic cells of S. aureus and A. parasiticus. The in vitro degradation of aflatoxin B1 (AFB1), ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEN) by the crude extracts was also investigated. The antimicrobial and antifungal effects were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal / fungicidal concentration (MBC / MFC). Mycotoxin detoxification assays were conducted at different incubation times (12-48h) at 37 °C. The concentrations of mycotoxins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Sweet passion fruit had no antimicrobial activity on S. aureus or A. parasiticus. Out of the four extracts evaluated, araçá showed the highest antimicrobial effect with MIC of 0.39 mg/mL and 0.45 mg/mL for crude and lyophilized extracts, respectively. The lowest MIC values for A. parasiticus were obtained with lyophilized oregano (8.33 mg/mL) and crude araçá (3.215 mg/mL). However, no MFC values were obtained for the analyzed fungi. Although OTA e ZEN were not degraded by any extract evaluated, all extracts reduced the concentration of AFB1 after 48 h of incubation. The highest percentage of AFB1 reduction (60.3%) was obtained with rosemary extract after 48h of incubation. The antimicrobial activity demonstrated by extracts of the evaluated plants indicates a potential for application against pathogenic bacteria and toxigenic fungi. This is the first study carried out with extracts of these four plants species that demonstrated the in vitro ability for AFB1 reduction.

A exposição humana a microrganismos patogênicos e suas toxinas em alimentos constitui um grave problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antimicrobianos convencionais promove o aumento da resistência dos microrganismos às principais moléculas existentes no mercado. Além disso, as limitações do uso de substâncias químicas em matérias primas alimentares têm estimulado pesquisas para o desenvolvimento de metodologias eco-amigáveis para evitar a multiplicação de fungos e/ou eliminar suas toxinas. O Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias patogênicas que apresenta taxas elevadas de resistência aos antimicrobianos, e por este motivo tem sido objeto de estudo de pesquisas que tentam identificar novos compostos bioativos para o combate de infecções. O Aspergillus parasiticus é um dos principais fungos produtores de aflatoxinas, substâncias carcinogênicas que contaminam diversos tipos de cereais antes e após o processamento. Estudos recentes demonstraram que extratos de plantas possuem atividade antimicrobiana e antifúngica, além de potencial para degradação de micotoxinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos brutos e liofilizados de folhas de maracujá, araçá, alecrim e orégano sobre células planctônicas de S. aureus e A. parasiticus, bem como verificar a capacidade dos referidos extratos em degradar in vitro a aflatoxina B1 (AFB1), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Os efeitos antibacterianos e antifúngicos dos extratos foram avaliados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida / fungicida mínima (CBM/CFM). Os ensaios de degradação da micotoxinas foram realizados em diferentes tempos de incubação (12-48 h) a 37º C, utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação das concentrações das micotoxinas. O maracujá não demonstrou atividade antimicrobiana tanto para S. aureus quanto para A. parasiticus. Dos quatro extratos estudados, o araçá demonstrou o maior efeito antibacteriano, cujos valores de CIM para extratos bruto e liofilizado foram 0.39 mg/mL e 0.45 mg/mL, respectivamente. Os menores valores de CIM para A. parasiticus foram obtidos com o orégano liofilizado (8.33 mg/mL) e o araçá bruto (3.215 mg/mL). Contudo, não foi possível identificar valores de CFM para o fungo analisado. Não houve efeito de degradação de OTA e ZEA por nenhum dos extratos avaliados. Todos os extratos reduziram a concentração de AFB1 após 48 h de incubação. A maior porcentagem (60.3%) de redução de AFB1 foi obtida com o extrato de alecrim após 48 h de incubação. A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos das plantas avaliadas indica um potencial para sua aplicação no combate a bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Este é o primeiro estudo realizado com extratos dessas quatro espécies de plantas que evidenciou a capacidade de redução in vitro de AFB1. / Human exposure to pathogenic microorganisms and their toxins in food is a serious public health problem. The indiscriminate use of conventional antimicrobials increases the resistance of microorganisms to the main molecules available in the market. In addition, limitations on the use of chemical substances in food raw materials have stimulated researches for the development of eco-friendly methodologies to avoid the multiplication of fungi and/or eliminate their toxins. Staphylococcus aureus is one of the major pathogenic bacteria with high rates of antimicrobial resistance, and for this reason it has been the subject of research studies aiming to identify new bioactive compounds to combat infections. Aspergillus parasiticus is one of the main aflatoxin-producing fungi, which are carcinogenic substances that contaminate many types of cereals before and after processing. Recent studies have demonstrated that plant extracts have antimicrobial and antifungal activity, as well as potential for degradation of mycotoxins. In this context, the objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial effects of crude and lyophilized extracts of leaves from sweet passion fruit, araçá, rosemary and oregano on planktonic cells of S. aureus and A. parasiticus. The in vitro degradation of aflatoxin B1 (AFB1), ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEN) by the crude extracts was also investigated. The antimicrobial and antifungal effects were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal / fungicidal concentration (MBC / MFC). Mycotoxin detoxification assays were conducted at different incubation times (12-48h) at 37 °C. The concentrations of mycotoxins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Sweet passion fruit had no antimicrobial activity on S. aureus or A. parasiticus. Out of the four extracts evaluated, araçá showed the highest antimicrobial effect with MIC of 0.39 mg/mL and 0.45 mg/mL for crude and lyophilized extracts, respectively. The lowest MIC values for A. parasiticus were obtained with lyophilized oregano (8.33 mg/mL) and crude araçá (3.215 mg/mL). However, no MFC values were obtained for the analyzed fungi. Although OTA e ZEN were not degraded by any extract evaluated, all extracts reduced the concentration of AFB1 after 48 h of incubation. The highest percentage of AFB1 reduction (60.3%) was obtained with rosemary extract after 48h of incubation. The antimicrobial activity demonstrated by extracts of the evaluated plants indicates a potential for application against pathogenic bacteria and toxigenic fungi. This is the first study carried out with extracts of these four plants species that demonstrated the in vitro ability for AFB1 reduction.

La contamination des aliments par les mycotoxines est une source très importante de gaspillage de nourriture. Depuis des années, la stratégie classique pour lutter contre ces contaminants est l’utilisation de pesticides. Cependant, il a été montré que ces produits pouvaient avoir des effets nocifs sur la biodiversité et la santé humaine et animale. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies, plus écologiques, pour lutter contre les mycotoxines. L’utilisation de produits naturels pourrait représenter une alternative intéressante et plus respectueuse de l’environnement. En effet, certains produits naturels sont capables d’inhiber la production de mycotoxines. Cependant, le mécanisme d’action mis en jeu est souvent mal compris. Un des objectifs principaux de ce travail a consisté à identifier des produits naturels capables d’inhiber la production de mycotoxines et d’élucider leur mécanisme d’action moléculaire. Pour ce faire, un outil moléculaire a été conçu pour comprendre les mécanismes permettant à des produits naturels d’inhiber la production d’Aflatoxine B1 (AFB1) chez Aspergillus flavus. L’étude de cette mycotoxine est importante puisque c’est un cancérigène puissant chez l’homme et les animaux. Un outil moléculaire permettant l’analyse simultanée de l’expression de 60 des principaux gènes impliqués dans la synthèse de l’aflatoxine B1 par q-*-PCR a été développé. Il permet d’étudier l’ensemble des gènes du cluster d’AFB1 mais également 33 autres gènes codant pour des facteurs de régulation liés à l’environnement dans lequel se trouve la moisissure. Par cette approche, le mécanisme d'action moléculaire de l’eugénol et la pipérine, ainsi que celui de 3 extraits naturels de plantes a été identifié et l'impact de ces composés sur les gènes impliqués dans la production d'AFB1 a été élucidé. L'un des principaux résultats de cette étude a été de montrer que les différents produits naturels modulent systématiquement plusieurs gènes au cours de l'inhibition de la production d’AFB1. Notre étude montre que les produits naturels représentent une alternative possible pour limiter la contamination des aliments par l’AFB1. L'élucidation du mécanisme d'action des produits naturels ouvre de nouvelles perspectives sur les méthodes à employer pour inhiber la production de la toxine. / Mycotoxin’s contamination represents an important source of food spoilage that has to be taken in consideration. For years pesticides, have been used as a common strategy to combat mycotoxin contamination. However, such products were also demonstrated to be harmful to humans and animals’ health. Therefore, it is necessary to find new strategies in order to avoid mycotoxin contamination and the use of natural products could be a promising alternative. Indeed, these compounds may be eco-friendly and several of them are demonstrated aseffective agents against toxin production. Nevertheless, their precise mechanism of action is poorly documented. One of the principal aim of this work consisted in the identification of natural sources capable to inhibit mycotoxin production and in the elucidation of their molecular mechanism of action. For that, we developed a molecular tool aiming the analysis of the impact of natural extracts on the expression of several genes related to Aflatoxin B1 synthesis in Aspergillus flavus. The study of this mycotoxin is an important issue since it is one of the most dangerous compounds inducing cancer in humans and animals. Taking advantage of the well-studied genome of Aspergillus flavus and considering that AFB1 production involves a great number of genetic elements, a q-PCR approach including 60 of the principal genes involved in toxin biosynthesis was developed. This tool simultaneously studies the entire AFB1 gene cluster but also 33 regulatory factors coding for external stimuli to which fungus is exposed. Using this molecular approach, the study of already known but also, new sources of anti-aflatoxigenic compounds was performed. The molecular mechanism of action of 2 isolated molecules and 3 whole plant extracts were determined and the impact of these compounds on the genes involved in AFB1 production was analysed. One of the innovative findings consisted in the demonstration that natural products systematically modulate several genes within AFB1’s inhibition. Taken together, our approach demonstrated that the use of natural products against mycotoxin production can represent an alternative strategy to inhibit food contamination. The elucidation of the mechanism of action of natural products allowed a better understanding of the fungal machinery through which toxin can be inhibited.

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A necessidade de aumentar a segurança alimentar norteia a busca por substâncias naturais como alternativa ao uso de fungicidas químicos. Compostos fenólicos têm demonstrado propriedades antifúngicas e antimicotoxigênicas e a incorporação dessas substâncias em sistemas carreadores, tais como lipossomos, pode preservar ou mesmo potencializar este efeito. Em função disso, o objetivo do trabalho foi estudar a atividade antifúngica de compostos fenólicos extraídos de Spirulina sp. LEB-18 na forma livre e encapsulada visando aplicá-los para diminuir o impacto da contaminação micotoxicológica em grãos por espécies filogenéticas do complexo Fusarium graminearum (Fg). Primeiramente, algumas rotas metabólicas foram avaliadas através da determinação de compostos estruturais (glicosamina e ergosterol) e da atividade de enzimas do metabolismo primário de 12 isolados de Fg em presença do extrato fenólico. A concentração necessária para inibir 50% o crescimento micelial (IC50) foi obtida em valores correspondentes entre 3 a 8% (v/v) de extrato fenólico e a glicosamina foi o indicativo de inibição que melhor representou o efeito inibidor sobre o crescimento fúngico. Padrões de ácidos fenólicos foram testados e comparados ao extrato fenólico de Spirulina, sendo observado que o ácido gálico foi o que apresentou maior efeito inibidor, porém inferior ao extrato fenólico de Spirulina. A incorporação do extrato fenólico em lipossomos alterou a dinâmica das regiões polares e apolares da fosfatidilcolina da membrana lipídica, influenciando a região fosfato do lipídio e aumentando a fluidez dos metilenos presentes na cauda apolar da membrana. Este efeito está relacionado com a inibição superior a 90% no crescimento de isolados do complexo Fg em presença de lipossomos contendo 8% de extrato fenólico (v/v). A produção de glicosamina foi reduzida de 11,5 mg g-1 para 6,1 mg g-1 no meio com lipossomo puro e extrato fenólico incorporado ao lipossomo, respectivamente, e aumentou em 15 vezes e 6 vezes a inibição da produção das micotoxinas NIV e 15AcDON. Ficou demonstrado que a técnica de encapsulamento garantiu a manutenção das propriedades de compostos bioativos, com atividade antifúngica e antimicotoxigênica superior ao extrato fenólico livre. / Fusarium is a fungal strain commonly found in grains and foods from cereals and a recognized mycotoxin producer. The need to increase food safety leads the search for biologically active natural substances as an alternative to the sinthetic fungicides. Phenolic compounds have demonstrated antifungal and antimicotoxigenic properties and the incorporation of these substances in carrier systems such as liposomes, may can preserve or even enhance this effect. As a result, this work aimed to study the antifungal activity of phenolic compounds extracted from Spirulina sp. LEB-18 in free and encapsulated form in order be applied in the reduction of the impact of micotoxin contamination in grains by Fusarium graminearum (Fg). First, the possibility affected metabolic pathways potentially affected were evaluated by determining structural compounds (glucosamine and ergosterol) and the enzymatic activity corresponding to primary metabolism of Fg 12 isolates in the presence of phenolic extract. The half inhibition concentration of fungal growth (IC50) was obtained in phenolic extracts concentrations between 3-8% (v/v) and glucosamine was the inhibition indicative which best represented the inhibitory effect on fungal growth. Phenolic acids standards were tested comparatively to Spirulina phenolic extract, and among them, being gallic acid showed the greatest inhibitory effect. However, this effect was lower than the Spirulina phenolic extract. The phenolic extract incorporation in lipossomes change the dynamics of the lipid membrandes of phosphatidylcholine polar and nonpolar regions, influencing the lipid phosphate region and increasing the fluidity of methylenes present in apolar hydrophobic acyl chains. This effect is related to the Fg growth inhibition of the complex isolates, wich was greater than 90% in the presence of liposomes containing 8% phenol extract (v/v). The production of glucosamine was reduced from 11.5 mg. g-1 to 6.1 mg. g-1 in the medium with pure liposome and phenolic extract incorporated into the liposome, respectively and increased by 15 and 6 times the inhibition of the mycotoxins NIV and 15AcDON. This showed that encapsulation technique ensured the maintenance of bioactive compounds with antifungal activity and antimicotoxigenic properties above the free phenolic extract.

O aumento da demanda, a falta de fiscalização sanitária efetiva e de especificações adequadas para verificar a qualidade de drogas vegetais são fatores que contribuem para o acesso a produtos sem garantia da qualidade e segurança. Embora sejam consideradas seguras por sua origem natural, as drogas vegetais apresentam elevadas cargas microbianas e podem oferecer riscos potenciais aos usuários, tanto pela presença de microrganismos potencialmente patogênicos, quanto pela contaminação com toxinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a contaminação microbiana presente em 91 amostras de drogas vegetais, o potencial toxigênico de fungos isolados e a presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina nestas amostras. Os resultados obtidos demonstraram que 73,6% das amostras apresentaram populações microbianas superiores a 2X103 UFC de bactérias aeróbias/g e 2X102 UFC de bolores e leveduras/g e que 81,3% apresentaram ao menos um dos microrganismos considerados indicadores de risco. Com relação à contaminação fúngica, observou-se o predomínio dos gêneros Aspergillus e Penicillium, sendo que a análise micotoxicológica revelou que 21,49% apresentaram capacidade para produção de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina. Apesar de fungos toxigênicos terem sido detectados em 35 amostras de drogas vegetais, a análise micotoxicológica, realizada conforme Farmacopéia Americana, não revelou a presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina em nenhuma das amostras de drogas vegetais, indicando que os microrganismos podem não terem sido submetidos a condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica. / The increase in the demand, the lack of effective sanitary fiscalization and adjusted specifications to verify the quality of crude herbal drugs are factors that contribute for accessing products without guarantee of the quality and safety. Although they are considered safe by their natural origin, herbal drugs present high microbial loads and can offer potential risks to the users, as much for the presence of potencially pathogenic microorganisms, how much for the contamination with toxins. The goal of this study was evaluated the microbial contamination present in 91 samples of crude herbal drugs, the toxigenic potencial of fungal isolates and the presence of aflatoxins, ochratoxin A and citrinin in these samples. The obtained results demonstrated 73.6% of the samples presented microbial populations higher than 2X103 CFU of aerobic bacteria/g and 2X102 CFU of yeast and molds/g and 81.3% presented at least one of the microorganisms considered as risk indicators. With regard to the fungal contamination, the Aspergillus and Penicillium genera were predominant and the mycotoxicological analysis revealed that 21.49% of these isolates presented ability for aflatoxins, ochratoxin A and citrinin production. Although toxigenic fungi have been detected in 35 samples of herbal drugs, the mycotoxicological analysis, carried through as The United States Pharmacopeia, showed no detection of aflatoxins, ochratoxin A or citrinin in any samples of herbal drugs, indicating that these fungi can not have been submitted a favorable conditions to the expression of their toxigenic ability.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.