Pour enrichir les connaissances scientifiques sur les effets biologiques des radionucléides et risques des contaminations chroniques sur la descendance, une étude multigénérationnelle in vivo d’exposition a été réalisée à doses non toxiques d'uranium. Ce modèle, a permis de suivre les effets biologiques de l’uranium sur trois générations de rats (F0, F1 et F2) par des analyses cliniques et le suivi de marqueurs biologiques. Dans cette étude, des analyses métabolomiques, transcriptomiques et épigénomiques ont été réalisées à partir d’échantillons de sang, d’urine et de rein.Pour la première génération des rats contaminés (F0), des différences dépendant du sexe des animaux sont observables par l’analyse des niveaux d’expression géniques (ARNm et micro-ARN) dans les reins, des profils métabolomiques et biochimiques dans les reins, l’urine et le sang. Aucune modification épigénétique des profils de méthylation de l’ADN rénal n’est à noter. Pour les deux générations suivantes (F1 et F2), un effet multigénérationnel dépendant aussi du sexe des rats est observable au niveau des profils métabolomiques urinaires et rénaux ainsi qu’au niveau des profils épigénétiques de méthylation de l'ADN des reins. Une baisse de poids corporel et des reins a aussi été observée pour la troisième génération de rats chez les mâles (F2).En conclusion, les travaux de cette thèse montrent qu’une contamination chronique à faible dose d'uranium entraine des effets biologiques sur plusieurs générations de rats. Ils sont observables à différents niveaux moléculaires des systèmes de régulation cellulaires et dépendent du sexe des rats. Ces effets, étroitement liés à des systèmes biologiques intégrés, sont utiles à la compréhension des mécanismes biologiques des expositions à l'uranium et à l’évaluation des risques de nocivités à long termes. Dans le domaine de la radioprotection, ces résultats justifient la nécessité de considérer les dimorphismes sexuels des individus et les conséquences des expositions sur les générations à venir. / In order to deepen scientific knowledge regarding biological effects of radionuclides and associated risk to offspring, an in vivo multigenerational study of chronic exposure to a non-toxic dose of uranium was performed by monitoring three generation of rats (F0, F1 and F2). Clinical parameters and biological markers, including metabolomics, transcriptomics and epigenomics high throughput analysis were conducted in blood, urine and kidney samples.For the first generation of contaminated rats (F0) sex-differences to uranium effects were observed in kidney for gene expression (mRNA, miRNA) and in kidney, urine and blood for biochemical parameters and metabolomics profiles. No epigenetic modification of DNA methylation profiles was shown in kidney. For the next two generations (F1, F2), a multigenerational sex-specific effect is observed for both metabolomics and renal DNA methylation profiles of contaminated rats. Moreover, for the last generation of male rats (F2), a decrease of both total body and kidney weight was shown.In conclusion, low-dose chronic contamination of rats to uranium leads to multigenerational effects. Including sex-differences, they can be shown at different molecular levels of the cellular system. Depending of integrated system biology, data of this thesis are useful in the understanding of biological mechanisms of uranium effect and risk of delayed harmful effect. In the field of radiation protection, these results prove the requirement of considering sexual dimorphisms and consequences of such exposures to offspring.

Les rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa sont des glycolipides ayant des propriétés élicitrices des réactions de défense de la vigne et d'Arabidopsis thaliana dont le mode de perception est inconnu. En tant que composés amphiphiles, uneinteraction avec la membrane plasmique a été proposée. Au niveau fondamental, il est démontré ici par une approche de biophysique utilisant la RMN du solide et des simulations de dynamique moléculaire in silico, que le caractère amphiphile des RLs favorise leur insertion au sein de modèles lipidiques de membranes de plantes, qui ne sont pas déstabilisés par leur présence. De plus il a été observé, par la réalisation de puces à ADN sur A. thaliana, que la perception de ces composés induisait une reprogrammation transcriptionnelle précoce de grande ampleur. En vue de démontrer l'intérêt agronomique des RLs pour la protection d'une plante de grande culture, leur activité sur le colza (Brassica napus) a également été étudiée. Des marqueurs caractéristiques de la mise en place des réponses de défense ont été observés, ainsi qu'un effet de protection detissus foliaires contre le pathogène B. cinerea, ce qui renforce le potentiel des RLs comme agents de biocontrôle pour la protection des Brassicacées / Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids are glycolipids known to trigger defense responses in grapevine and Arabidopsis thaliana but their mode of perception by plants is still unknown. As amphiphilic compounds, rhamnolipids have been proposed to interactdirectly with plasma membrane lipids. Here we show, by a biophysical approach involving solid state NMR and in silico molecular dynamic simulations, that the insertion of rhamnolipids does not disturb the dynamic of plant plasma membrane models. Inorder to characterize early gene expression modifications triggered by rhamnolipids a micro-array study on A. thaliana was realized, revealing a large transcriptional change. The potential of rhamnolipids to protect the agronomical plant Brassica napus was also investigated. Rhamnolipid triggering of chemical and physical defenses associated with efficient protection against the opportunistic pathogenic fungus Botrytis cinerea, used as a model, was shown. Those results highlight a real potential of RLs as biocontrol agents for Brassicaceae protection

Il existe un certain nombre de situations au cours desquelles l'intégrité du génome cellulaire est mise en danger. Ceci se produit notamment lors de mouvements de gènes (translocation, éléments mobiles), lors d'infections virales parfois intégratives (AAV, HBV, HPV) ou lors d'infections rétrovirales. En effet, le cycle de réplication des rétrovirus nécessite une étape d'intégration du génome viral dans l'ADN génomique de la cellule infectée. Malgré les nombreuses études menées sur les infections par le VIH, les cancers viro-induits ou non et les thérapies géniques basées sur les rétrovirus, aucune donnée n'est actuellement disponible sur les modifications cellulaires induites par de telles perturbations chromosomiques. L'objectif du projet était d'identifier des mécanismes cellulaires induits par des atteintes à l'intégrité du génome, plus précisément par l'insertion de molécules d'ADN non cellulaire dans les chromosomes. L'intégration de matériel génétique additionnel a été induite par des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1. Les modifications cellulaires uniquement dues à l'intégration ont été isolées par comparaison de vecteurs intégratif et non intégratif. Des cellules primaires du derme humain ont été sélectionnées pour l'étude. Les temps post infection et les doses virales les plus adéquates ont été sélectionnés grâce à des expériences de cinétiques d'intégration couplées à une quantification des ADN viraux intégrés. L'analyse des modifications cellulaires induites par l'intégration de l'ADN étranger a portée sur l'ensemble du transcriptome et sur l'ensemble du protéome cellulaire. Dans le but d'effectuer une analyse transcriptomique, des puces à ADN, représentant le génome humain complet, ont été utilisées. Cette étude a démontré une forte répression transcriptionnelle induite par l'intégration. De plus, toutes les fonctions cellulaires sont perturbées par le processus. Finalement, une classification par interactions et fonctions biologiques a mis en évidence cinq processus cellulaires majoritairement affectés par l'intégration de l'ADN étranger, qui correspondent au cycle et à la mort cellulaire, au remodelage et à la réparation de la chromatine et à la réponse immunitaire ou au stress. Dans le but de compléter cette analyse transcriptomique, une étude protéomique a été réalisée. Les protéines cellulaires ont été séparées sur des gels bi-dimensionnels. Parmi les neuf protéines identifiées en spectrométrie de masse, certaines appartiennent au cytosquelette et d'autres aux mécanismes de réponse au stress. L'intégration d'un ADN étranger au sein du génome provoque donc bien des perturbations cellulaires. L'intégration de matériel génétique additionnel ne concernant pas seulement les rétrovirus, les données obtenues lors de cette étude pourront permettre (i) de développer des stratégies de défenses contre les rétrovirus ou contre les autres maladies caractérisées par des atteintes à l'intégrité du génome, (ii) d'évaluer les risques encourus par l'intégration d'un vecteur thérapeutique dans le génome cellulaire lors des thérapies géniques ou des expériences de transfert de gènes.

Il existe un certain nombre de situations au cours desquelles l'intégrité du génome cellulaire est mise en danger. Ceci se produit notamment lors de mouvements de gènes (translocation, éléments mobiles), lors d'infections virales parfois intégratives (AAV, HBV, HPV) ou lors d'infections rétrovirales. En effet, le cycle de réplication des rétrovirus nécessite une étape d'intégration du génome viral dans l'ADN génomique de la cellule infectée. Malgré les nombreuses études menées sur les infections par le VIH, les cancers viro-induits ou non et les thérapies géniques basées sur les rétrovirus, aucune donnée n'est actuellement disponible sur les modifications cellulaires induites par de telles perturbations chromosomiques. L'objectif du projet était d'identifier des mécanismes cellulaires induits par des atteintes à l'intégrité du génome, plus précisément par l'insertion de molécules d'ADN non cellulaire dans les chromosomes. L'intégration de matériel génétique additionnel a été induite par des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1. Les modifications cellulaires uniquement dues à l'intégration ont été isolées par comparaison de vecteurs intégratif et non intégratif. Des cellules primaires du derme humain ont été sélectionnées pour l'étude. Les temps post infection et les doses virales les plus adéquates ont été sélectionnés grâce à des expériences de cinétiques d'intégration couplées à une quantification des ADN viraux intégrés. L'analyse des modifications cellulaires induites par l'intégration de l'ADN étranger a portée sur l'ensemble du transcriptome et sur l'ensemble du protéome cellulaire. Dans le but d'effectuer une analyse transcriptomique, des puces à ADN, représentant le génome humain complet, ont été utilisées. Cette étude a démontré une forte répression transcriptionnelle induite par l'intégration. De plus, toutes les fonctions cellulaires sont perturbées par le processus. Finalement, une classification par interactions et fonctions biologiques a mis en évidence cinq processus cellulaires majoritairement affectés par l'intégration de l'ADN étranger, qui correspondent au cycle et à la mort cellulaire, au remodelage et à la réparation de la chromatine et à la réponse immunitaire ou au stress. Dans le but de compléter cette analyse transcriptomique, une étude protéomique a été réalisée. Les protéines cellulaires ont été séparées sur des gels bi-dimensionnels. Parmi les neuf protéines identifiées en spectrométrie de masse, certaines appartiennent au cytosquelette et d'autres aux mécanismes de réponse au stress. L'intégration d'un ADN étranger au sein du génome provoque donc bien des perturbations cellulaires. L'intégration de matériel génétique additionnel ne concernant pas seulement les rétrovirus, les données obtenues lors de cette étude pourront permettre (i) de développer des stratégies de défenses contre les rétrovirus ou contre les autres maladies caractérisées par des atteintes à l'intégrité du génome, (ii) d'évaluer les risques encourus par l'intégration d'un vecteur thérapeutique dans le génome cellulaire lors des thérapies géniques ou des expériences de transfert de gènes

Schizosaccharomyces pombe devient de plus en plus un système modèle pour étudier la régulation de l'expression des gènes et des protéines dans les processus impliqués dans le développement de cancers et de maladies génétiques. Ces travaux peuvent servir à étudier les propriétés putatives de la protéine humaine HID1 à empêcher des tumeurs de se former. J'ai utilisé la technique RNAseq pour révéler les changements d'expression des gènes sur les cellules de S. pombe dont sont absentes trois gènes orthologues du gène humain HID1: hid1+, hid2+ et hid3+. Des mutants ont été créés par remplacement de gènes et testés pour découvrir leurs propriétés de croissance. La croissance du mutant hid2Δ semblait meilleure tandis que celle de hid3Δ semblait plus lente que les contrôles. La morphologie cellulaire de chaque mutant était normale. La microscopie à transmission électronique a révélé que l'appareil de Golgi était fortement modifié dans hid3Δ. RNAseq a montré que plus de 500 gènes étaient exprimés différentiellement dans hid3Δ. Les changements d'expression indiquaient des cellules sous tension. Par ailleurs, un jeu défini de facteurs de transcription et un groupe de gènes encodant des protéines situées et sécrétées ont été introduits, ce qui suggère que la perturbation de la fonction protéique au niveau de la membrane plasmique a un effet feedback sur la régulation de l'expression des gènes. J'émets l'hypothèse que la croissance lente de hid3Δ s'explique par un état cellulaire de quiescence partielle. Aussi, S. pombe ont été séquencées et révèlent l'expression de petits ARN non codants spécifiques, dont des introns complets et d'autres ARN non codants non annotés. / Schizosaccharomyces pombe has become increasingly a model system to study the regulation of gene expression, stress signaling and metabolic and protein changes for processes implicated in the development of cancer and genetic diseases. This work was started to determine if S. pombe could be used to study the putative anti-tumor forming properties of the human HID1 protein. I employed the NGS technology RNAseq to reveal gene expression changes to the cells of S. pombe lacking three orthologues of the human HID1 gene, hid1+, hid2+ and hid3+. Mutants lacking these genes were created by gene replacement and tested for growth properties. The mutant hid2Δ appeared to grow better and hid3Δ grew more slowly than WT controls. The cell morphology of each mutant was normal and lengths and widths were unchanged. Transmission electron microscopy revealed that the Golgi apparatus was greatly modified in hid3Δ but not in other genotypes. RNAseq showed that under standard growth conditions more than 500 genes were differentially expressed in hid3Δ. Expression changes were indicative of cells under stress. Also, a defined set of transcription factors and a group of genes encoding proteins located in the plasma membrane and secreted were induced, suggesting that disruption of protein function at the plasma membrane feeds back to regulate gene expression. I hypothesize that slow growth of hid3Δ is due to a partial quiescent cell state. To start investigating mechanisms regulating gene expression, small RNA libraries of the size of S. pombe introns were sequenced and revealed the expression of specific small non-coding RNAs, including full introns and other un-annotated non-coding RNAs.

Cette thèse en bioinformatique a été réalisée entre 2010 et 2015 dans le groupe du Pr. Vincent Detours à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire. Nous avons analysé des données génomiques et transcriptomiques provenant de carcinomes papillaires de la thyroïde (CPTs) et leurs tissus non-cancéreux adjacents. La première partie étudiait les différences transcriptomiques entre CPTs post-Tchernobyl et CPTs sporadiques, et leur tissus non-cancéreux adjacents. Dans notre cohorte, les cas sporadiques étaient en moyenne et significativement un an plus jeunes. Après un ajustement des données transcriptionnelles pour l'âge, près de 400 gènes étaient plus exprimés dans les tissus adjacents des patients exposés aux radiations. Cependant, nous n’avons pu détecter aucune surreprésentation de groupe de gènes participant à des fonctions biologiques connues. Il était possible de distinguer les cas sporadiques des cas post-Tchernobyl sur base des transcriptomes de leurs tissus adjacents, avec une précision de ~70%. Cette surexpression de gènes dans les tissus non-cancéreux adjacents pourrait être liée à une radiosensibilité accrue dans le groupe des patients exposés aux radiations de Tchernobyl. Dans la deuxième étude, nous avons intégré des données provenant des patients de la première partie, incluant les nombres de copies d'ADN des CPTs, le génotype de plus de 400.000 SNPs dans le sang et les données transcriptionnelles des CPTs et leurs tissus non-cancéreux adjacents. En reproduisant les résultats d'une étude précédente, nous avons retrouvé la région 7q11.23 dupliquée exclusivement dans un tiers des patients exposés aux radiations. Dans une étude indépendante, un autre groupe a montré que la duplication de cette région était plus fréquente dans une population de lignées cellulaires radiosensibles que dans la population humaine normale. Cependant, en analysant les transcriptomes des patients présentant cette duplication, nous n'avons pas détecté de différence d’expression des gènes codés dans cette région génomique. En outre, aucun génotype de SNP n'était significativement lié à l'exposition aux radiations. En conclusion, les résultats confirment qu'un tiers des CPTs post-Tchernobyl ont des traces d'un dégât radio-sensibilsant dans leur ADN. Dans une troisième étude, nous avons étudié les différences transcriptionnelles entre CPTs et leurs métastases ganglionnaires (MGs) associées, ainsi qu'entre des CPTs développant des MGs (N+) et des CPTs ne développant pas de MGs (N0). Des études précédentes comparant les MGs et leurs tumeurs associées impliquant d’autres organes ont montré une surexpression de gènes dans les MGs, liés aux cellules immunitaires. Ce signal provient du tissu contaminant environnant les MGs. Pour se défaire de ce signal contaminant, d’autres études ont microdisséqué au laser les parties tumorales des MGs. Cependant, la microdissection retire aussi le stroma associé à la tumeur, alors que celui-ci est justement impliqué dans la progression tumorale. Grâce à une méthode originale, nous avons corrigé nos données d’expression des MGs pour leur contenu en contaminant ganglionnaire non-cancéreux. Après cette correction, l’expression de gènes liés au stroma était plus élevée dans les MGs que dans leurs CPTs. Les différences d’expression entre N0 et N+ n’étaient pas reproductibles entre 4 jeux de données indépendants de CPTs. Ceci démontre l’absence d’un signal transcriptionnelle lié au statut nodal dans ces données. Cependant, en utilisant des données publiques comprenant des centaines de tumeurs, il est possible de prédire le statut nodal (N0 ou N+) des CPTs ainsi que des cancers du sein et du colon à partir de leurs transcriptomes. Des études précédentes montraient des taux de prédiction presque parfaits (>90%) du statut nodal à partir des données transcriptomiques. Nous avons décelés dans ces études le même biais technique de sélection des gènes, qui peut expliquer ces taux artificiellement élevés. Dans notre étude, ce biais n’était pas présent et la précision de nos prédictions était limitée (<70%), questionnant l’intérêt clinique de telles prédictions. La présence d’un signal permettant de prédire le statut nodal et l’irreproductibilité de ce signal dans des jeux de données indépendants peuvent s'expliquer par l’association entre le statut nodal et des caractéristiques d'agressivité des tumeurs, qui pourraient, elles, avoir une influence reproductible sur les transcriptomes. Dans notre dernière étude, nous avons analysé les différences entre CPTs, liées à la présence de BRAFV600E, une mutation commune à 60% des CPTs. En utilisant un jeu de données public, nous avons montré que les CPTs présentant la mutation étaient plus dédifférenciés, et plus infiltrés en stroma, probablement en lymphocytes et fibroblastes; et que ces CPTs présentaient plus de fibrose et proliféraient sans doute plus. Tout ceci suggère que les CPTs mutés pour BRAF constituent un groupe de CPTs plus agressif. Des caractéristiques d’agressivité pourraient être détectées au front invasif, c’est-à-dire la périphérie de la tumeur définissant son contact avec le stroma, notamment la présence de regroupement de cellules isolées du reste de la tumeur. Dans les CPTs, ces îlots cellulaires isolés sont observés sur des lames histologiques 2D et pourraient être expliqués soit par un détachement cellulaire, signe d’agressivité lié au processus métastatique, soit une conformation complexe compatible avec une tumeur connexe en 3D. Dans un CPT, nous avons analysé la conformation 3D du front invasif d'un CPT muté. Nous avons reconstruit son volume 3D grâce à une méthode originale. Les groupes de cellules cancéreuses qui semblaient isolées sur les images 2D d’histopathologie, étaient en fait connectés en 3D. L’hypothèse de la présence de détachement cellulaire suite à la transition épithélio-mésenchymateuse n’est donc pas requise pour expliquer la présence de ces îlots cellulaires en 2D. La forme 3D du front invasif impliquait une surface de contact entre tumeur et stroma bien plus importante qu'impliquée par la forme ellipsoïde habituellement décrite. Les fibroblastes participaient autant à la création de la masse tumorale que les cellules cancéreuses, puisque ces deux groupes de cellules proliféraient à la même vitesse. A l'avenir, le séquençage du matériel génétique de cellules individuelles facilitera notre interprétation des signaux génomiques et transcriptomiques, qui jusqu’alors provenaient de tissu complet, i.e. un mélange de populations de cellules tumorales, stromales et de contaminant. Une signature de radiation pourrait être extraite des profils mutationnels de cellules individuelles exposées aux radiations et à l’H2O2 in vitro et comparée à la signature des CTPs post-Tchernobyl. Les cellules tumorales et stromales individuelles des MGs pourraient être comparées aux cellules tumorales et stromales invividuelles des CPTs. De même les cellules individuelles mutées pour BRAFV600E pourraient être comparées aux cellules non mutées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mammites sont des inflammations de la mamelle provoquées principalement par des bactéries. Elles représentent un problème majeur en élevage laitier. Elles sont caractérisées par de fortes augmentations de la concentration des cellules somatiques (CCS) dans le lait. Le score des CCS (SCS) est fortement corrélé à la présence d'infections mammaires, ainsi il est utilisé en sélection pour améliorer la résistance aux mammites. Pour comprendre les mécanismes mis en place lors d'une sélection sur les SCS, deux lignées divergentes de brebis ont été produites à partir de géniteurs ayant des valeurs extrêmes de cet index. Le principal objectif de ce travail est d'identifier et de comprendre les mécanismes qui confèrent une plus grande résistance ou sensibilité aux mammites provoquées par des staphylocoques. Nos travaux ont porté principalement sur des analyses transcriptomiques de trois types cellulaires majeurs, après contact avec des staphylocoques : les cellules inflammatoires du lait recueillies après infection, principalement composées de neutrophiles, les cellules dendritiques, comme cellules présentatrices d'antigènes et les cellules épithéliales mammaires, première barrière de défense contre l'infection. Nous avons montré que la migration des cellules immunitaires et les processus inflammatoires se traduisent par des activations de voies différentes chez les brebis des deux lignées divergentes. Nous avons aussi identifié des gènes fonctionnels candidats pour expliquer la différence de sensibilité aux mammites. En parallèle, nous avons étudié l'association entre le polymorphisme de l'ADN et la présence d'abcès mammaires liés aux mammites dans un dispositif cas-contrôle visant à détecter des gènes à effet majeur. Les études ont permis de mettre en évidence une zone chromosomique d'intérêt située sur le chromosome OAR5. Les deux approches de génétique moléculaire (analyses du transcriptome et du polymorphisme du génome) ont permis d'identifier des gènes fonctionnels et positionnels candidats pour comprendre les mécanismes associés à la résistance aux mammites / Mastitis is udder inflammation. It is one of the major health issues in dairy cattle and sheep as they produce economic losses for the dairy industry. Mastitis is characterized by an increase in milk inflammatory somatic cells. The somatic cell score (SCS) is well correlated to clinical and subclinical mastitis. To enhance insights into the genetic mechanisms involved in such a selection on SCS, two divergent lines of sheep were generated based on extreme breeding values for SCS. The main objective of this work was to identify and improve the understanding of mechanisms that are responsible for a better resistance to Staphylococcus mastitis. Our study was based on transcriptomic analysis of three cell types after Staphylococcus contact: milk inflammatory cells, mainly composed of neutrophils, dendritic cells and mammary epithelial cells. We showed that immune cell migration and inflammatory processes were activated by different pathways in the two divergent lines. We also identified functional candidate genes that may partly explain the differences of mastitis susceptibility. In parallel, we analysed the association of DNA polymorphism with the presence of mammary abscesses caused by mastitis. The study highlighted a chromosomal region on OAR5 that is associated to the presence of mammary abscesses. Both approaches of molecular genetics as transcriptomics and genomics analyses enabled identification of candidate functional and positional genes for the better understanding of the mechanisms associated to mastitis resistance

La reprogrammation, qui est la réversion d’un noyau d’un état somatique vers un état moins différencié, constitue un enjeu majeur pour la thérapie cellulaire. Cependant, les mécanismes initiaux qui président à la reprogrammation restent mal connus. Le transfert nucléaire (clonage) met à profit les propriétés de reprogrammation uniques du cytoplasme ovocytaire, et constitue une approche expérimentale intéressante pour analyser ces processus. Le but de cette thèse est d’étudier la différence de capacité de cellules fibroblastiques à être reprogrammées efficacement, en tirant partie d’une situation-modèle d'efficacité différentielle de reprogrammation après clonage chez le bovin. Ce modèle est constitué de deux lots de fibroblastes donneurs de noyaux, qui forment des embryons clonés dont la différence d’efficacité de développement à terme varie d’un facteur 8. L’analyse des cellules donneuses a montré une augmentation des anomalies de ploïdie dans les cellules à faible potentiel, et la similitude transcriptomique entre les cellules donneuses, alors que la comparaison des transcriptomes des embryonsclonés a montré des différences de reprogrammation de l’expression génique dès le stade suivant l’activation du génome embryonnaire. Des différences de méthylation de l’ADN entre cellules donneuses ont été observées dans les promoteurs de gènes candidats différentiellement reprogrammés, ainsi que dans une analyse plus globale par RRBS. Nous avons enfin étudié la distribution des cellules filles des deux premiers blastomères au stade blastocyste, la distribution « orthogonale » et l’aptitude au développement à terme des embryons de souris clonés étant liées (Liu et al., 2012). Nous avons montré l’existence de trois distributions dans les embryons fécondés mais n’avons pas observé de différence de proportions de celles-ci entre embryons bovins clonés. En conclusion, dans notre modèle, la distribution des cellules filles des deux premiers blastomères au stade blastocyste ne semble pas associée à l’efficacité de reprogrammation dans les embryons bovins clonés, contrairement aux différences épigénétiques entre cellules donneuses. / Reprogramming, which is the return of a nucleus from a somatic state to a less differentiated state, is a major issue for cell therapy. However, the initial mechanisms governing the reprogramming remain poorly understood. Nuclear transfer (cloning) takes advantage of the unique reprogramming properties of the oocyte cytoplasm, and therefore is an interesting experimental approach to analyze these processes. The aim of this thesis is to study the difference in fibroblasts’ ability to be reprogrammed by taking advantage of a model-situation of differential reprogramming efficiency after cloning in cattle. This model consists of two batches of donor fibroblasts, which form cloned embryos having an 8 fold difference in development to term efficiency. Analysis of donor cells has shown increase ploidy abnormalities in cells of low potential, and transcriptomic similarity between the donor cells, whereas comparison ofcloned embryos transcriptomes showed gene expression reprogramming differences just after embryonic genome activation. Differences in DNA methylation between donor cells were observed in the promoters of candidate genes differentially reprogrammed and in a more comprehensive analysis by RRBS. Finally we studied the distribution of the first two blastomeres’ daughter cells at the blastocyst stage, as an "orthogonal" distribution and development to term of mice cloned embryos are linked (Liu et al., 2012). We have shown the existence of three distributions in the fertilized embryos but haven’t seen any difference of proportions between bovine cloned embryos. In conclusion, in our model, the distribution of the first two blastomeres’ daughter cells at the blastocyst stage does not seem related to the reprogramming efficiency in bovine cloned embryos, unlike epigenetic differences between donor cells.

Des études épidémiologiques ont rapporté une association inverse entre la consommation de produits laitiers et le risque de diabète de type 2 (DT2). Cependant, les études d'intervention sur les produits laitiers rapportent des résultats contradictoires sur la sensibilité à l'insuline. Ainsi, on ne sait pas si la consommation de produits laitiers exerce des effets bénéfiques sur l'homéostasie du glucose et les mécanismes d'action potentiels. Les effets des produits laitiers sur l'homéostasie du glucose pourraient être révélés par l'intégration des omiques. Le terme omique est utilisé pour désigner les investigations utilisant des technologies analytiques, telles que la transcriptomique (ARNm et microARN (miARN)), la métabolomique (acides gras à chaîne courte (AGCC), les acides biliaires, et F₂-isoprostanes (F₂-IsoPs)) et le microbiome intestinal. Pourtant, on ne sait pas si la consommation de produits laitiers pourrait modifier le transcriptome, le métabolome et le microbiote intestinal et si ceux-ci pourraient prédire l'homéostasie du glucose chez les personnes à risque de DT2. Les objectifs sont 1- de déterminer l'effet des produits laitiers sur le profil omique, y compris le profilage de l'ARNm et les microARN, les métabolites et le microbiome; et 2- de clarifier les mécanismes d'action des produits laitiers sur les facteurs de risque de DT2. Dans cet essai randomisé en chassé-croisé, 27 participants hyperinsulinémiques ont été randomisés pour consommer des produits laitiers élevès (HD) (HD ≥ 4 portions/j) et des produits laitiers adéquats (AD) (AD ≤ 2 portions/jour) pendant 6 semaines. Les mesures cliniques et anthropométriques ainsi que des questionnaires de fréquence alimentaire ont été réalisés avant et après chaque intervention. Premièrement, l'ARNm et les miARN ont été mesurés en utilisant des micropuces et la validation par qPCR. Deuxièmement, les taux plasmatiques d'AGCCs, sels biliaires, et des F₂-IsoPs ont été mesurés par des techniques de spectrométrie de masse. Troisièmement, l'abondance du bactèries intestinalles a été analysée à l'aide de méthodes de séquençage du gène ARNr 16S. Le test t apparié a été utilisé pour indiquer des différences significatives dans les paramètres cliniques et omiques entre AD et HD. Les analyses de corrélation ont été effectuées pour identifier l'association entre les paramètres glycémiques et les omiques. De plus, un modèle mixte de régression linéaire a été utilisée pour examiner les différences dans les mesures répétées des niveaux plasmatiques de F₂-IsoP entre AD et HD. L'intégration des omiques a été réalisée à l'aide d'une analyse par apprentissage automatique. L'analyse des puces à ARNm a indiqué que 236 gènes étaient différentiellement exprimés avant et après l'apport en HD. De plus, 297 miARN ont été différentiellement exprimés entre AD et de HD. Une analyse plus approfondie des gènes et des miARN exprimés de manière différentielle a révélé que les voies métaboliques associées au DT2 étaient modifiées après la prise de HD par rapport à avant la prise de HD, y compris la signalisation des récepteurs olfactifs, GPCR, PI3K-AKT2, la signalisation Ras et les voies MAPK. De plus, le niveau de F₂-IsoPs (5-F₂ₜ-IsoP et 8-F₂ₜ-IsoP) a été favorablement réduit. F₂-IsoPs était aussi positivement corrélé avec la glycémie à jeun. Un niveau inférieur de F₂-IsoP a été observé chez les femmes par rapport aux hommes après la prise de HD par rapport à AD. Les résultats ont également montré une augmentation de l'abondance des bactéries Firmicutes et de l'acide butyrique fécal qui jouent un rôle dans la réduction de la résistance à l'insuline. Finalement, l'analyse de l'apprentissage automatique a identifié trois déterminants omiques potentiels interdépendants (miR-93-5p, 8-F₂ₜ-IsoP et l'acide biliaire lithocholique) après la consommation de HD, ce qui a entraîné une réduction de la résistance à l'insuline. Dans l'ensemble, cette étude a démontré que la prise de HD peut modifier de manière bénéfique le profil des OMIC et la résistance à l'insuline chez les participants atteints d'hyperinsulinémie. / Epidemiological studies have reported an inverse association between the consumption of dairy products and the risk of type 2 diabetes (T2D). However, dairy intervention studies report conflicting results on insulin sensitivity. Thus, it is unknown whether dairy product consumption exerts its beneficial effects on glucose homeostasis and their potential mechanisms of action. The effects of dairy products on glucose homeostasis could be mediated by changes in omics profiles. The term omics is used to refer to investigations using global analytical technologies, such as transcriptomics (mRNA and microRNA (miRNA)), metabolomics (short-chain fatty acids (SCFAs), biliary acids, and F₂-isoprostanes (F₂-IsoPs)), and gut microbiome. Yet, it is unclear whether dairy product consumption could alter the transcriptome, metabolome, and gut microbiota and whether these could predict glucose homeostasis in individuals at risk for T2D. The objectives are 1- to determine the effect of dairy products on the OMICS profile, including mRNA and miRNA profiling, metabolites and microbiome; and 2- to clarify the mechanisms of action of dairy products on the risk factors of T2D. In this randomized crossover trial, 27 subjects with hyperinsulinemia were randomized to consume high-dairy (HD) products (HD ≥ 4 servings/d) and adequate dairy (AD) products (AD ≤ 2 servings/day) for 6 weeks. Clinical and anthropometric measurements as well as food frequency questionnaires were carried out before and after each intervention. First, the mRNA and miRNA profiling were performed using microarrays and qPCR validation. Second, plasma levels of SCFAs and F₂-IsoPs were measured by mass spectrometry techniques. Third, the abundance of gut microbiota was analyzed using 16S rRNA gene sequencing. The paired t-test was used to indicate differences in clinical and omics parameters between AD and HD. The correlation analyses were performed to identify the association between glycemic parameters and omics. Further, mix-model regression was used to examine the differences in repeated measurements of plasma levels of F₂-IsoP between AD and HD. The integration of omics was performed using machine learning methods. Microarray analysis indicated that 236 genes were expressed differently before and after HD intake. Furthermore, 297 miRNAs were expressed differently between AD and HD. Further, analysis of differentially expressed genes and miRNAs revealed that T2D-associated metabolic pathways were altered after HD intake compared to before HD intake, including olfactory receptor signaling, GPCR, PI3K-AKT2, Ras signaling, and MAPK pathways. In addition, the level of F₂-IsoPs (5-F₂ₜ-IsoP and 8-F₂ₜ-IsoP) was favorably reduced. F₂-IsoPs was also positively correlated with fasting blood glucose. In addition, a lower level of F₂-IsoP was observed in females compared to males after intake of HD compared to AD. Results also showed an increase in the abundance of Firmicutes bacteria and fecal butyric acid which have a role in reducing the insulin resistance. Finally, machine learning analysis identified three interrelated potential omics determinants (miR-93-5p, 8-F₂ₜ-IsoP, and lithocholic bile acid) after HD consumption that resulted in reduced insulin resistance. Overall, this study demonstrated that consuming HD can beneficially alter the OMICs profile to improve insulin resistance in participants with hyperinsulinemia.

En début de lactation, la vache subit un stress important occasionné par l’impossibilité de combler l’ensemble de ses besoins énergétiques par sa consommation exogène. Cette période spécifique se caractérise par une balance énergétique négative, entraîne une utilisation excessive des réserves corporelles de l’animal et représente un défi métabolique important. Ironiquement, depuis maintenant plus de 40 ans, le système incite les producteurs laitiers à effectuer l’insémination au jour 60 post-partum, c’est-à-dire au moment où la vache rencontre un déficit métabolique. Ce déficit au moment de la conception aurait un impact chez la progéniture, notamment au niveau épigénétique. Ce projet consiste à documenter l’effet de la balance énergétique négative sur la qualité de l’embryon et, en l’occurrence, à proposer des pistes afin d’améliorer la fertilité des bovins laitiers. La mesure du bêta-hydroxybutyrate (BHB) a été effectuée à partir d’échantillons sanguins entre 45 et 60 jours post-partum sur dix-huit vaches de race Holstein. Selon la mesure obtenue, la vache fut classée comme étant faible ou élevée en BHB, afin d’avoir au moins six vaches par groupe. Après un processus de stimulation ovarien, chaque vache fut inséminée et les embryons, récoltés. Pour chaque vache, deux embryons ont été transférés dans deux primipares, afin de déterminer subséquemment la persistance des marqueurs dans le matériel biologique. Grâce à la plate-forme EmbryoGENE, il fut possible de déterminer l’expression génique ainsi que l’état de méthylation de l’ADN des embryons récoltés. Les résultats obtenus soutiennent l’existence d’une altération du métabolisme énergétique au niveau embryonnaire, notamment par la modification de la voie de signalisation de mTOR ainsi que celle des sirtuines. Cette altération semble se traduire par une dysfonction mitochondriale et une inhibition de la transcription, entraînant un freinage au niveau cellulaire, probablement dû à la programmation de l’embryon à utiliser ses réserves lipidiques lors de conditions importantes de stress. / In early lactation, the cow undergoes an important stress generated by the impossibility of filling its entire energetic needs by exogenous consumption. This is characterized by a negative energy balance, excessive use of animal body reserves and represents an important metabolic challenge. Ironically, for more than 40 years now, the system has been encouraging dairy farmers to inseminate on day 60 postpartum, when the cow has a metabolic deficit. This deficit at the time of conception could impact the offspring, especially at the epigenetic level. This project is meant to document the effect of the negative energy balance on the quality of the embryo and to identify ways to improve the fertility of dairy cows. The beta hydroxybutyrate (BHB) measure was done from blood samples between day 45 and 60 postpartum on eighteen Holstein cows. According to the measure obtained, each cow was classified as low or high in BHB, so as to have at least six cows per group. After an ovarian stimulation process, each cow was inseminated and the embryos were harvested. For each cow, two embryos were transferred in two primiparous cows in order to subsequently determine the persistence of the markers in the biological material. With the EmbryoGENE platform, it was possible to determine the gene expression as well as the methylation status of DNA embryos. The results obtained support the existence of an alteration of the energetic metabolism at the embryonic level, especially by the modification of the signaling pathway of mTOR as well as those of the sirtuins. This alteration appears to result in mitochondrial dysfunction and inhibition of transcription, leading to a reduced activity at a cellular level, probably due to programming of the embryo to use its lipid reserves during severe stress conditions.