Universiẗat, Diss., 2004--Bonn. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

Plants have evolved many mechanisms to defend against herbivores and pathogens. In many cases, these mechanisms took other duties. One example of such a neofunction- alisation would be carnivory. Carnivory evolved from the defence against herbivores. Instead of repelling the predator with a bitter taste, the plant kills it and absorbs its nutrients. A second example can be found in the pollination process. Many of the genes involved here were originally part of defence mechanisms against pathogens. In this thesis, I study these two examples on a genomic and transcriptomic level. The first project, Genomics of carnivorous Droseraceae, aims at obtaining annotated genome sequences of three carnivorous plants. I assembled the genome of Aldrovanda vesiculosa, annotated those of A. vesiculosa, Drosera spatulata and Dionaea muscipula and com- pared their genomic contents. Because of the high repetitiveness of the D. muscipula genome, I also developed reper, an assembly free method for detection, classification and quantification of repeats. With that method, we were able to study the repeats without the need of incorporating them into a genome assembly. The second large project investigates the role of DEFL (defensin-like) genes in pollen tube guidance in tobacco flowers. We sequenced the transcriptome of the SR1 strain in different stages of the pollination process. I assembled and annotated the transcriptome and searched for differentially expressed genes. We also used a method based on Hidden- Markov-Models (HMM) to find DEFLs, which I then analysed regarding their expression during the different stages of fertilisation. In total, this thesis results in annotated genome assemblies of three carnivorous Droser- aceae, which are used as a foundation for various analyses investigating the roots of car- nivory, insights into the role of DEFLs on a transcriptomic level in tobacco pollination and a new method for repeat identification in complex genomes. / Im Laufe der Evolution haben Pflanzen viele Methoden entwickelt, um sich gegen Fress- feinde und Pathogene zu verteidgen. Viele dieser Methoden wurden im Laufe der Zeit umfunktioniert. Ein Beispiel hierfür ist die Karnivorie, welche aus der Verteidigung ge- gen Fressfeinde entstanden ist. Anstelle einen Angreifer durch bitteren Geschmack zu vertreiben, tötet die Pflanze das Tier und nimmt seine Nährstoffe auf. Ein weiteres Bei- spiel ist der Bestäubungs- und Befruchtungsprozess. Viele der Gene, die hier involviert sind, stammen ursprünglich aus Mechanismen zur Verteidigung gegen Pathogene. In dieser Arbeit untersuche ich diese beiden Beispiele auf genomischer und transkrip- tomischer Ebene. Die Zielsetzung des ersten Projekts, Genomik von karnivoren Dro- seraceaen, ist es, assemblierte und annotierte Genome von drei karnivoren Pflanzen zu generieren. Ich habe dazu das Genom von Aldrovanda vesiculosa assembliert und dieses, sowie die Genome von Drosera spatulata und Dionaea muscipula annotiert und mit- einander verglichen. Aufgrund des hohen Anteils repetitiver Elemente im D. muscipula Genom habe ich reper, eine Methode zum Detektieren, Klassifizieren und Quantifizieren von Repeats, entwickelt. Mit dieser Methode ist es nun möglich, repetitive Elemente zu untersuchen, ohne diese in einem Genomassembly integrieren zu müssen. Das zweite große Projekt untersucht die Rolle von DEFL (defensin-like) Genen im Pollenschlauchwachstum in Tabakblüten. Dazu haben wir das Transkriptom der SR1 Variante zu verschiedenen Zeitpunkten im Befruchtungsprozess sequenziert. Ich habe dieses Transkriptom assembliert und annotiert und darin nach differentiell exprimierten Genen gesucht. Zudem haben wir mit einer auf Hidden Markov Modellen (HMM) ba- sierten Methode nach DEFL Genen gesucht und ich habe die Expression dieser in den verschiedenen Stadien untersucht. Zusammenfassend beinhalten die Ergebnisse dieser Thesis annotierte Genomassemb- lies von drei karnivoren Droseraceaen, Erkenntnisse über die Rolle von DEFL Genen bei der Befruchtung auf einer transkriptomischen Ebene und eine neue Software zur Analyse von repetitiven Elementen in komplexen Genomen.

Many arthropods such as mosquitoes, ticks, bugs, and flies are vectors for the transmission of pathogenic parasites, bacteria, and viruses. Among these, the unicellular parasite Trypanosoma brucei (T. brucei) causes human and animal African trypanosomiases and is transmitted to the vertebrate host by the tsetse fly. In the fly, the parasite goes through a complex developmental cycle in the alimentary tract and salivary glands ending with the cellular differentiation into the metacyclic life cycle stage. An infection in the mammalian host begins when the fly takes a bloodmeal, thereby depositing the metacyclic form into the dermal skin layer. Within the dermis, the cell cycle-arrested metacyclic forms are activated, re-enter the cell cycle, and differentiate into proliferative trypanosomes, prior to dissemination throughout the host. Although T. brucei has been studied for decades, very little is known about the early events in the skin prior to systemic dissemination. The precise timing and the mechanisms controlling differentiation of the parasite in the skin continue to be elusive, as does the characterization of the proliferative skin-residing trypanosomes. Understanding the first steps of an infection is crucial for developing novel strategies to prevent disease establishment and its progression. A major shortcoming in the study of human African trypanosomiasis is the lack of suitable infection models that authentically mimic disease progression. In addition, the production of infectious metacyclic parasites requires tsetse flies, which are challenging to keep. Thus, although animal models - typically murine - have produced many insights into the pathogenicity of trypanosomes in the mammalian host, they were usually infected by needle injection into the peritoneal cavity or tail vein, bypassing the skin as the first entry point. Furthermore, animal models are not always predictive for the infection outcome in human patients. In addition, the relatively small number of metacyclic parasites deposited by the tsetse flies makes them difficult to trace, isolate, and study in animal hosts. The focus of this thesis was to develop and validate a reconstructed human skin equivalent as an infection model to study the development of naturally-transmitted metacyclic parasites of T. brucei in mammalian skin. The first part of this work describes the development and characterization of a primary human skin equivalent with improved mechanical properties. To achieve this, a computer-assisted compression system was designed and established. This system allowed the improvement of the mechanical stability of twelve collagen-based dermal equivalents in parallel through plastic compression, as evaluated by rheology. The improved dermal equivalents provided the basis for the generation of the skin equivalents and reduced their contraction and weight loss during tissue formation, achieving a high degree of standardization and reproducibility. The skin equivalents were characterized using immunohistochemical and histological techniques and recapitulated key anatomical, cellular, and functional aspects of native human skin. Furthermore, their cellular heterogeneity was examined using single-cell RNA sequencing - an approach which led to the identification of a remarkable repertoire of extracellular matrix-associated genes expressed by different cell subpopulations in the artificial skin. In addition, experimental conditions were established to allow tsetse flies to naturally infect the skin equivalents with trypanosomes. In the second part of the project, the development of the trypanosomes in the artificial skin was investigated in detail. This included the establishment of methods to successfully isolate skin-dwelling trypanosomes to determine their protein synthesis rate, cell cycle and metabolic status, morphology, and transcriptome. Microscopy techniques to study trypanosome motility and migration in the skin were also optimized. Upon deposition in the artificial skin by feeding tsetse, the metacyclic parasites were rapidly activated and established a proliferative population within one day. This process was accompanied by: (I) reactivation of protein synthesis; (II) re-entry into the cell cycle; (III) change in morphology; (IV) increased motility. Furthermore, these observations were linked to potentially underlying developmental mechanisms by applying single-cell parasite RNA sequencing at five different timepoints post-infection. After the initial proliferative phase, the tsetse-transmitted trypanosomes appeared to enter a reversible quiescence program in the skin. These quiescent skin-residing trypanosomes were characterized by very slow replication, a strongly reduced metabolism, and a transcriptome markedly different from that of the deposited metacyclic forms and the early proliferative trypanosomes. By mimicking the migration from the skin to the bloodstream, the quiescent phenotype could be reversed and the parasites returned to an active proliferating state. Given that previous work has identified the skin as an anatomical reservoir for T. brucei during disease, it is reasonable to assume that the quiescence program is an authentic facet of the parasite's behavior in an infected host. In summary, this work demonstrates that primary human skin equivalents offer a new and promising way to study vector-borne parasites under close-to-natural conditions as an alternative to animal experimentation. By choosing the natural transmission route - the bite of an infected tsetse fly - the early events of trypanosome infection have been detailed with unprecedented resolution. In addition, the evidence here for a quiescent, skin-residing trypanosome population may explain the persistence of T. brucei in the skin of aparasitemic and asymptomatic individuals. This could play an important role in maintaining an infection over long time periods. / Zahlreiche Arthropoden wie Stechmücken, Zecken, Wanzen und Fliegen sind Überträger für krankheitserregende Parasiten, Bakterien und Viren. Hierzu gehört der einzellige Parasit Trypanosoma brucei (T. brucei), welcher durch Tsetsefliegen übertragen wird und die Afrikanische Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren verursacht. Der Entwicklungszyklus des Parasiten in der Fliege ist komplex und endet in der Speicheldrüse mit der Differenzierung in das metazyklische Lebensstadium. Diese metazyklischen Formen werden durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege in die dermale Hautschicht des Säugetierwirts injiziert. Die zellzyklusarretierten metazyklischen Formen werden in der Dermis aktiviert und der Widereintritt in den Zellzyklus sowie die Differenzierung zu proliferativen Trypanosomen eingeleitet. Anschließend breitet sich der Parasit systemisch im Säugetierwirt aus. Obwohl T. brucei bereits seit Jahrzehnten erforscht wird, ist nur sehr wenig über das frühe Infektionsgeschehen in der Haut bekannt. Der genaue Zeitpunkt und die Mechanismen, die der Differenzierung des Parasiten in der Haut zugrunde liegen, sind unbekannt. Ebenso wurden die proliferativen Trypanosomen in der Haut bisher nur unzureichend charakterisiert. Das Verständnis über die ersten Schritte einer Infektion ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von neuen Strategien, die die Krankheitsentstehung und deren Fortschreiten verhindern sollen. Ein großes Hindernis bei der Erforschung der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis ist der Mangel an geeigneten Infektionsmodellen, die den Krankheitsverlauf authentisch nachbilden. Außerdem werden für die Erzeugung der infektiösen metazyklischen Parasiten Tsetsefliegen benötigt, die aufwändig zu züchten sind. Tiermodelle haben es ermöglicht - hauptsächlich Mäuse -, viele Erkenntnisse über die Pathogenese von Trypanosomen im Säugetierwirt zu erlangen. Allerdings wurden diese überwiegend durch Nadelinjektion in den Bauchraum oder die Kaudalvene infiziert, wodurch die Haut als erste Eintrittspforte umgangen wurde. Darüber hinaus lassen Tiermodelle nicht immer Rückschlüsse auf den Infektionsverlauf beim Menschen zu. Zusätzlich erschwert die geringe Anzahl von metazyklischen Parasiten, die von Tsetsefliegen injiziert werden, die Isolation, Nachweis und Untersuchung im tierischen Wirt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein rekonstruiertes menschliches Hautäquivalent zu entwickeln und als Infektionsmodell zu validieren, um die Entwicklung von natürlich übertragenen metazyklischen Parasiten von T. brucei in der Säugetierhaut zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines primären menschlichen Hautäquivalents mit verbesserten mechanischen Eigenschaften. Zu diesem Zweck wurde ein computergesteuertes Kompressionssystem entworfen und hergestellt. Dieses System ermöglichte die gleichzeitige Verbesserung der mechanischen Stabilität von zwölf kollagenbasierten dermalen Äquivalenten durch plastische Kompression, die mittels Rheologie evaluiert wurden. Die verbesserten dermalen Äquivalente dienten als Fundament für die Erzeugung der Hautäquivalente und reduzierten deren Kontraktion und Gewichtsverlust während der Gewebebildung. Dadurch wurde ein hohes Maß an Standardisierung und Reproduzierbarkeit erreicht. Die Hautäquivalente wurden durch immunhistochemische und histologische Techniken charakterisiert und bildeten wichtige anatomische, zelluläre und funktionelle Aspekte der nativen menschlichen Haut nach. Des Weiteren wurde die zelluläre Heterogenität durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung untersucht. Mit dieser Technik wurde ein umfangreiches Spektrum an extrazellulären Matrix-assoziierten Genen identifiziert, die von verschiedenen Zellsubpopulationen in der künstlichen Haut exprimiert werden. Zusätzlich wurden experimentelle Bedingungen etabliert, damit Tsetsefliegen eingesetzt werden konnten, um die Hautäquivalente auf natürlichem Weg mit Trypanosomen zu infizieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Entwicklung der Trypanosomen in der künstlichen Haut im Detail untersucht. Dies umfasste die Etablierung von Methoden zur erfolgreichen Isolierung der Trypanosomen aus der Haut, um deren Proteinsyntheserate, Zellzyklus- und Stoffwechselstatus, sowie Morphologie und Transkriptom zu bestimmen. Zusätzlich wurden Mikroskopietechniken zur Untersuchung der Trypanosomenmotilität und migration in der Haut optimiert. Nach der Injektion in die künstliche Haut durch Tsetsefliegen wurden die metazyklischen Parasiten schnell aktiviert und etablierten innerhalb eines Tages eine proliferative Population. Dieser Entwicklungsprozess wurde begleitet von (I) einer Reaktivierung der Proteinsynthese, (II) einem Wiedereintritt in den Zellzyklus, (III) einer Veränderung der Morphologie und (IV) einer erhöhten Motilität. Des Weiteren wurden diese Beobachtungen mit potentiell zugrundeliegenden entwicklungsbiologischen Mechanismen in Verbindung gebracht, indem eine Einzelzell RNA-Sequenzierung der Trypanosomen zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt wurde. Nach der ersten proliferativen Phase traten die Tsetse-übertragenen Trypanosomen in der Haut in ein reversibles Ruhestadium ein. Diese ruhenden Trypanosomen waren durch eine sehr langsame Zellteilung, einen stark reduzierten Stoffwechsel und ein Transkriptom gekennzeichnet, dass sich deutlich von dem der injizierten metazyklischen Formen und der ersten proliferativen Trypanosomen unterschied. Durch Nachahmung der Migration von der Haut in den Blutkreislauf konnte dieser Phänotyp reaktiviert werden und die Parasiten kehrten in einen aktiven, proliferierenden Zustand zurück. Unter Berücksichtigung, dass vorangegangene Forschungsarbeiten die Haut als anatomisches Reservoir für T. brucei während des Krankheitsverlaufs identifiziert haben, ist anzunehmen, dass das Ruheprogramm eine authentische Facette im Verhalten des Parasiten in einem infizierten Wirt darstellt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, das primäre menschliche Hautäquivalente eine neue und vielversprechende Möglichkeit bieten, vektorübertragene Parasiten unter naturnahen Bedingungen als Alternative zu Tierversuchen zu untersuchen. Durch die Verwendung des natürlichen Infektionsweges - dem Biss einer infizierten Tsetsefliege -, konnten die frühen Prozesse einer Trypanosomen-Infektion mit noch nie dagewesener Detailtiefe nachvollzogen werden. Des Weiteren könnte der hier erbrachte Nachweis einer ruhenden, hautresidenten Trypanosomen-Population die Persistenz von T. brucei in der Haut von aparasitämischen und asymptomatischen Personen erklären. Dies könnte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer Infektion über lange Zeiträume spielen.

Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab. / In the same way that informatical knowledge has made its way into almost all areas of research in the Life Sciences, the focus of bioinformatical research has shifted towards topics originating more in the fields of mathematics and theoretical computer science. Bioinformatics today is more than the computer-driven processing of huge amounts of biological data, but it has a special focus on the emphmodelling of complex biological systems. Of special importance hereby are theories from stochastics and statistics, from the field of machine learning and theoretical computer science. In the following dissertation, I describe the systematic modelling of biological systems from an informatical-mathematical point of view in a case studies approach, applying methods from the aforementioned areas of research and on different levels of biological abstraction. Beginning with the sequence information itself, followed by the transcriptome, metabolome and the interaction of both and finally population effects I show how current biological questions can be tackled with mathematical models and combined with a variety of different experimental datasets. A special focus lies hereby on the procedure of modelling and the concept and notion of a model as such in the framework of bioinformatical research. In more detail, the projects contained the development of a new approach for embedding and visualizing Multiple Sequence and Structure Alignments, which was illustrated using a hemagglutinin alignment from different H5N1 variants as an example. Furthermore we investigated the A. thaliana transcriptome by means of a kernelized non-parametric meta-analysis, thus being able to annotate several new genes as pathogen-defense related. Another major part of this work was the modelling of the metabolic network of L. monocytogenes under activation of the transcription factor prfA, establishing predictions which were later verified by experimental 13C isotopologue studies. Following this project we investigated the relationship between the regulation of metabolism by changes in the cellular genexpression patterns and the flux distributions of the metabolic steady-state network. Modelling of a complex organismal property, the cell size development of the planktonic diatom Pseudo-nitzschia delicatissima concludes this work.

For the first time the transcriptional reprogramming of distinct root cortex cells during the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis was investigated by combining Laser Capture Mirodissection and Affymetrix GeneChip® Medicago genome array hybridization. The establishment of cryosections facilitated the isolation of high quality RNA in sufficient amounts from three different cortical cell types. The transcript profiles of arbuscule-containing cells (arb cells), non-arbuscule-containing cells (nac cells) of Rhizophagus irregularis inoculated Medicago truncatula roots and cortex cells of non-inoculated roots (cor) were successfully explored. The data gave new insights in the symbiosis-related cellular reorganization processes and indicated that already nac cells seem to be prepared for the upcoming fungal colonization. The mycorrhizal- and phosphate-dependent transcription of a GRAS TF family member (MtGras8) was detected in arb cells and mycorrhizal roots. MtGRAS shares a high sequence similarity to a GRAS TF suggested to be involved in the fungal colonization processes (MtRAM1). The function of MtGras8 was unraveled upon RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing. An AM symbiosis-dependent expression of a RNAi construct (MtPt4pro::gras8-RNAi) revealed a successful gene silencing of MtGras8 leading to a reduced arbuscule abundance and a higher proportion of deformed arbuscules in root with reduced transcript levels. Accordingly, MtGras8 might control the arbuscule development and life-time. The targeting of MtGras8 by the phosphate-dependent regulated miRNA5204* was discovered previously (Devers et al., 2011). Since miRNA5204* is known to be affected by phosphate, the posttranscriptional regulation might represent a link between phosphate signaling and arbuscule development. In this work, the posttranscriptional regulation was confirmed by mis-expression of miRNA5204* in M. truncatula roots. The miRNA-mediated gene silencing affects the MtGras8 transcript abundance only in the first two weeks of the AM symbiosis and the mis-expression lines seem to mimic the phenotype of MtGras8-RNAi lines. Additionally, MtGRAS8 seems to form heterodimers with NSP2 and RAM1, which are known to be key regulators of the fungal colonization process (Hirsch et al., 2009; Gobbato et al., 2012). These data indicate that MtGras8 and miRNA5204* are linked to the sym pathway and regulate the arbuscule development in phosphate-dependent manner. / Die Leguminose Medicago truncatula (gehört zur Gattung des Schneckenklees) ist in der Lage sowohl eine Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien (Rhizobien), als auch mit Mykorrhiza-Pilzen einzugehen. Der Mykorrhiza-Pilz Rhizophagus irregularis dringt in die Wurzelrindenzellen ein und bildet Strukturen aus, die als Arbuskeln bezeichnet werden. Diese ermöglichen den Transfer von Nährstoffen, wie Phosphat in die Wurzelzellen. Die Pflanze liefert hingegen bis zu 20 % ihrer Photosyntheseprodukte an den Pilz. Da die Lebenszeit der Arbuskeln nur wenige Tage beträgt, können Wurzelrindenzellen mehrere Arbuskeln nacheinander beherbergen. Somit können neben arbuskelhaltigen, auch nicht-arbuskelhaltige Zellen in kolonisierten Wurzeln auftreten. Die nicht-arbuskelhaltigen Zellen beeinträchtigen die Sensitivität von Genregulationsanalysen, wenn die Genregulation während der Mykorrhiza-Symbiose anhand von ganzen kolonisierten Wurzeln untersucht wird. In dieser Arbeit konnte eine Zelltyp-spezifische Analyse der Genregulation von arbuskelhaltigen und nicht-arbuskelhaltigen Zellen durchgeführt, und eine Erhöhung der Sensitivität erreicht werden. Mittels Laser Capture Microdissection wurden Zellen aus Gefrierschnitten von Wurzeln isoliert. Aus den so gewonnen Zellen konnte RNA von ausreichender Qualität und Quantität extrahiert werden, um das Transkriptom der beiden Zelltypen mittels Mikroarrayhybridisierung zu untersuchen. Transkriptionsfaktoren (TFs) spielen wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in der Umprogrammierung von Wurzelzellen während der Mykorrhiza-Symbiose. Daher wurde die Genregulation von TF-Genen in den zwei Zelltypen gezielt untersucht. Anhand von quantitativer RT-PCR und Promoter-Reporter-Fusionen wurde die differentielle Expression von mehreren TF-Transkripten in den verschiedenen Zelltypen bestätigt. Die Charakterisierung eines potentiellen GRAS TF (MtGRAS8) konnte eine stark Symbiose- und Phosphat-abhängige Induktion von Transkripten bestätigt werden. Mutanten mit verringerter MtGras8 Transkriptmenge wiesen eine verringerte Arbuskelzahl und deformierte Arbuskeln auf. MtGras8 scheint daher an der Arbuskelentwicklung beteiligt zu sein. Vorherige Experimente zeigten, dass MtGras8 Transkripte, von der Phosphat-regulierten MikroRNA5204* geschnitten werden (Devers et al., 2011). Dies konnte durch Überexpression der MikroRNA5204* in vivo bestätigt werden. Weiterhin konnten Protein-Protein-Interaktionen von MtGras8 mit bekannten GRAS TFs (NSP1, NSP2, RAM1) nachgewiesen und daraus eine Verbindung zu bekannten Symbiose-induzierten Signalkaskaden geschlossen werden. In dieser Arbeit wurde erstmals die Umprogrammierung von nicht-arbuskelhaltigen Zellen untersucht und neue Regulationselemente für die Kontrolle der Arbuskelentwicklung, wie MtGRAS8 und MikroRNA5204*, charakterisiert.

Einführung: Eine entscheidende Ursache für das Aufkommen der den modernen Menschen charakterisierenden kognitiven Funktionen ist in der beachtlichen Vergrößerung des menschlichen Neocortex innerhalb der letzten 5-7 Millionen Jahre zu finden. Die Identifizierung der dieser Entwicklung zu Grunde liegenden genomischen Veränderungen ist letztlich nicht nur bedeutsam für die Beantwortung der Frage, welche evolutionären Anpassungen den Menschen kennzeichnen, sondern auch für ein besseres Verständnis einer möglicherweise besonderen Anfälligkeit gegenüber neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Kürzlich konnten 15 menschenspezifische Gene, deren Expression sich vorzugsweise in neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) des menschlichen fetalen Neokortexes nachweisen lässt, identifiziert werden (Florio et al., 2018). Drei davon (FAM72B, C und D) sind vor 3,4 – 1 Millionen Jahren im menschlichen Genom durch Genduplikationen entstanden und gehören zur Family of sequence similarity 72 (FAM72). Zielsetzung und Ansätze: Konkret wurde betrachtet, ob FAM72D durch die spezifischen Substitutionen von Aminosäuren eine sich von der Funktion des anzestralen Gens FAM72A unterscheidende Rolle in der neokortikalen Entwicklung einnimmt. Untersucht wurden deshalb die Effekte von FAM72A und D auf die Proliferationskapazität und Genexpression von NPCs nach der ektopen Expression von FAM72A oder D während der embryonalen Entwicklung des Neocortex der Maus. Methoden: Die in utero Elektroporation (IUE) embryonaler Mäusegehirne erfolgte zur Expression eines rot oder grün fluoreszierenden Proteins (RFP oder GFP) entweder gemeinsam mit einem leeren DNA pCAGGS Vektor als Kontrollbedingung oder aber einem pCAGGS-FAM72A oder pCAGGS-FAM72D Plasmid. Die in der zweiten Ergebnissektion (Results II) präsentierten IUE wurden dabei im dorsolateralen Neokortex zum Höhepunkt der Neurogenese am 14. Entwicklungstag (E 14.5) durchgeführt, im Unterschied zu den Experimenten in der dritten Sektion (Results III), die im medialen Neokortex am 18. Entwicklungstag (E 18.5) während der Spätphase der embryonalen Neurogenese realisiert wurden. Die Proliferation der NPCs wurde durch Immunfluoreszenzanalysen zweier Marker (Ki67 und phosphoryliertes Histon 3) bestimmt. Zudem wurde die Häufigkeit wichtiger Subtypen von NPCs ebenfalls durch Immunfluoreszenzanalysen eines Markers für basale intermediäre Vorläuferzellen (bIPs → Tbr2) sowie für basale und apikale radiale Gliazellen (aRGs, bRGs → Sox2) ermittelt. Die Gliogenese wurde durch Olig2 Immunfluoreszenz quantifiziert. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die Fähigkeit der NPCs, den Zellzyklus nach der IUE von FAM72D erneut einzuleiten, zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde schwangeren Mäusen 24 h nach der IUE das Thymidin-Analogon 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) intraperitoneal injiziert. Damit wurden alle Zellen markiert, die sich zu diesem Zeitpunkt in der S-Phase des Zellzyklus befanden und damit den Zellzyklus nach der IUE fortsetzten. Nach weiteren 24 h (48 h post-IUE) erfolgte die Auswertung: alle Ki67- und EdU-doppelt positiven Zellen wurden als solche betrachtet, die den Zellzyklus nach IUE fortführten (EdU+) und nach weiteren 24 h noch immer proliferierten (Ki67+). Zur Durchführung der Transkriptomanalyse wurden Mäuse am 13. Entwicklungstag mit pCAGGS-GFP und entweder dem leeren DNA-Vektor (pCAGGS, Kontrolle) oder einem die Expression von FAM72A (pCAGGS-FAM72A) oder FAM72D (pCAGGS-FAM72D) ermöglichenden Vektor elektroporiert. Anschließend wurden die elektroporierten dorsolateralen neokortikalen Bereiche am 14. Entwicklungstag mikroskopisch seziert und in einzelne Zellen dissoziiert. Die Isolation der elektroporierten (GFP+) Zellen erfolgte aus den Einzelzellsuspensionen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Anschluss wurden die isolierten Zellen für die RNA-Sequenzierung vorbereitet. Die primäre Datenanalyse der Ergebnisse der RNA-Sequenzierung wurde entsprechend etablierter Protokolle durchgeführt (Florio et al., 2015). Ergebnisse: Die Analyse der Immunfluoreszenzquanitfizierungen (Results II und III) ergab keine signifikanten Veränderungen der proliferativen Parameter oder der Häufigkeit der NPCs in der ventrikulären Zone (VZ) oder subventrikulären Zone (SVZ) des sich entwickelnden Mausneokortex nach der ektopen Expression von FAM72A oder FAM72D im Vergleich zur Kontrollbedingung. Die Transkriptomanalyse (Results IV) zeigte jedoch 88 signifikant hoch- und 52 herunterregulierte Gene in Folge der FAM72A sowie 91 signifikant hoch- und 67 herunterregulierte Gene nach der FAM72D Expression im Vergleich zur Kontrolle. Es wurde festgestellt, dass nur zwei dieser differentiell exprimierten Gene in Folge der ektopen Expression sowohl von FAM72A als auch FAM72D hochreguliert wurden und ein Expressionslevel > 1 fpkm aufwiesen: Syde1 und Shisa5. Darüber hinaus wurden sechs Gene mit > 1 fpkm identifiziert, die spezifisch nach der Expression von FAM72D hochreguliert waren: Tapbp, Mtfp1, Slitrk5, Parp9, Cnp, Rbm43. Darüber hinaus zeigte die Genontologie-Analyse (Gen Ontology) eine signifikante Anreicherung von Angiogenese-assoziierten Genen (z. B. Vegfc) im Datensatz der artifiziell FAM72A exprimierenden Zellen. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass unter den im Vergleich zur Kontrolle differentiell exprimierten Genen mehr Gene mit typischer Expression in NPCs in Folge von FAM72D als FAM72A Expression hochreguliert und mehr NPC typische Gene nach FAM72A Expression herunterreguliert wurden. Im Falle der Gene, deren Expression eher in Neuronen zu finden ist, zeigte sich ein entgegengesetztes Bild (Results IV). Diese Befunde lassen den vorsichtigen Schluss zu, dass FAM72D stärker als FAM72A die Aufrechterhaltung von NPC-Eigenschaften positiv beeinflussen kann. Schlussfolgerungen: In einer früheren Studie erhöhte der Knockdown von Fam72a in NPCs erwachsener Mäuse die Neurogenese (Benayoun et al., 2014). Dies legt in Verbindung mit den vorliegenden Ergebnissen nahe, dass FAM72A und FAM72D nicht hinreichend, möglicherweise jedoch notwendig sind, um die Aufrechterhaltung des Vorläuferzellcharakters von NPCs zu fördern (Results II, III). Aus diesem Grund sollte das in dieser Studie verfolgte Gain of Function Design durch einen Loss of Function Ansatz ergänzt werden. Als Modellsystem bieten sich hierfür insbesondere Hirnorganoide aus Stammzellen des Schimpansen oder Menschen an. Da alle der kürzlich identifizierten menschenspezifischen Gene in den gleichen NPCs exprimiert werden, sollte auch die potenzielle synergistische Wirkung auf die NPC-Proliferation der FAM72 und der zwölf anderen humanspezifischen Gene wie etwa ARHGAP11B analysiert werden. Neben anderen möglichen Mechanismen, die auf Grundlage der Genexpressionsanalyse im Diskussionsteil dieser Arbeit (Results IV und Discussion) erörtert wurden, könnte die Hochregulierung von Slitrk5 in Folge der ektopen Expression des humanspezifischen FAM72D besonders relevant sein. Es ist bekannt, dass Slitrk5 am Recycling des TrKB-Rezeptors beteiligt ist (Song et al., 2015), der wiederum grundlegende Aspekte der Gehirnentwicklung beeinflusst. Ebenfalls konnte bereits gezeigt werden, dass FAM72A die Funktion des TrKB Rezeptors hemmt (Nehar et al., 2009). Somit ist denkbar, dass FAM72D im menschlichen Neokortex die Wiederherstellung der TrKB-Rezeptorfunktion indirekt über Slitrk5 verbessert und dadurch wesentliche Parameter wie das Überleben von Vorläuferzellen und die Neurogenese beim Menschen verlängern oder verstärken könnte. Diese Studie stellt damit die erste funktionelle Charakterisierung der evolutionär hochinteressanten, die FAM72 Gene beinhaltende Region des menschlichen Genoms während der Entwicklung in utero dar. Daraus ergeben sich zahlreiche Ansatzpunkte für zukünftige Untersuchungen, die in ihrer Gesamtheit ein umfassendes Verständnis der Evolution des menschlichen Gehirns ermöglichen werden.:1 INTRODUCTION 11 1.1 WHAT MADE US HUMAN? 11 1.2 THE NEOCORTEX 12 1.2.1 Origin and structure 12 1.2.2 Neurogenesis in the developing neocortex 14 1.2.3 How to increase the neuronal output 18 1.3 EVOLUTION AND GENE DUPLICATION 19 1.3.1 Gene duplication and evolutionary novelty 19 1.3.2 Mechanisms of replication 21 1.3.3 Fates of duplicated genes 22 1.3.4 Which genes tend to duplicate? 24 1.3.5 Human adaptation and gene duplication 24 1.4 HUMAN-SPECIFIC SIGNATURES OF NEOCORTICAL EXPANSION 25 1.5 IDENTIFICATION OF HUMAN-SPECIFIC GENES EXPRESSED IN THE DEVELOPING NEOCORTEX.. 25 1.6 FAMILY WITH SEQUENCE SIMILARITY 72 (FAM72) 26 1.6.1 Evolutionary origin 26 1.6.2 Subcellular localization 27 1.6.3 Cell cycle regulation 28 1.6.4 NPC maintenance 28 2 AIMS & APPROACHES 30 3 RESULTS I 31 3.1 FROM GENES TO PROTEINS: 1 FAMILY – 4 PARALOGUES 31 3.2 FAM72 MRNA EXPRESSION LEVELS IN THE DEVELOPING MOUSE AND HUMAN NEOCORTEX 32 3.3 COMPUTATIONAL ANALYSES 34 3.3.1 Proportion of cysteines 34 3.3.2 Transmembrane domain 34 3.4 AMPLIFICATION, SUBCLONING AND MUTAGENESIS 36 3.4.1 Amplification from human cDNA 36 3.4.2 Verification of the pCAGGs vectors 36 4 RESULTS II 38 4.1 ECTOPIC EXPRESSION OF FAM72A AND FAM72D IN THE MOUSE DORSOLATERAL NEOCORTEX AT MID-NEUROGENESIS 38 4.2 NPC PROLIFERATION 39 4.2.1 Assessment of NPC proliferation using Ki67 immunofluorescence 39 4.2.2 Cell cycle reentry 41 4.2.3 Assessment of mitosis using PH3 immunofluorescence 43 4.2.4 Conclusion 45 4.3 NPC ABUNDANCE 46 4.3.1 Assessment of NPC abundance using Tbr2 and Sox2 immunofluorescence 46 4.3.2 Conclusion 49 5 RESULTS III 50 5.1 ECTOPIC EXPRESSION OF FAM72A and FAM72D IN THE MOUSE MEDIAL CORTEX AT LATE-NEUROGENESIS 50 5.2 NPC PROLIFERATION 51 5.2.1 Assessment of the NPC proliferation using Ki67 immunofluorescence 51 5.3 NPC ABUNDANCE 52 5.3.1 Assessment of NPC abundance using Tbr2 and Sox2 immunofluorescence 52 5.4 GLIOGENESIS 53 5.4.1 Assessment of gliogenesis using Olig2 immunofluorescence 53 5.5 CONCLUSION 54 6 RESULTS IV 55 6.1 DIFFERENCES IN GENE EXPRESSION UPON ANCESTRAL FAM72A AND HUMAN-SPECIFIC FAM72D EXPRESSION AT MID-NEUROGENESIS 55 6.1.1 Rationale and experimental setup 55 6.2 DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES UPON ECTOPIC FAM72A AND FAM72D EXPRESSION IN THE DEVELOPING MOUSE DORSOLATERAL NEOCORTEX 56 6.3 UPREGULATED GENES UPON THE ECTOPIC FAM72A OR FAM72D EXPRESSION 57 6.3.1 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A and FAM72D expression 57 6.3.2 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A or D expression – cut off: fpkm >1 58 6.3.3 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A and D expression – cut off: fpkm >1 59 6.4 UPREGULATED GENES SPECIFICALLY UPON THE ECTOPIC FAM72D EXPRESSION – CUT OFF: FPKM >1 60 6.4.1 Tapbp (TAP binding protein, Tapasin) 60 6.4.2 Mtfp1 (mitochondrial fission protein 1, Mtp18) 61 6.4.3 Slitrk5 (Slit and Ntrk-like protein 5) 61 6.4.4 Parp9 (Poly(ADP-ribose) polymerase 9) 63 6.4.5 Cnp (2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase) 63 6.4.6 Rbm43 (RNA binding motif protein 43) 65 6.5 DOWNREGULATED GENES UPON THE ECTOPIC FAM72A OR FAM72D EXPRESSION 66 6.5.1 Downregulated genes upon the ectopic FAM72A or D expression – cut off: fpkm >1 66 6.5.2 Downregulated genes upon ectopic FAM72A expression – cut off: fpkm >1 66 6.5.3 Downregulated genes upon ectopic FAM72D expression – cut off: fpkm >1 67 6.6 GENES PREVIOUSLY SHOWN TO BE DIFFERENTIALLY EXPRESSED UPON FORCED FAM72A EXPRESSION 69 6.6.1 Cell cycle regulators 69 6.6.2 Tumor suppressor genes 69 6.6.3 PROTEINS PREVIOUSLY OBSERVED TO INTERACT WITH FAM72A 70 6.7 EFFECT OF ECTOPIC FAM72A AND FAM72D EXPRESSION ON GENES IMPLICATED IN NEURAL LINEAGE FATE DECISION 70 6.7.1 Upregulated and NPC-enriched genes 71 6.7.2 Downregulated and NPC-enriched genes 73 6.7.3 Upregulated and neuron-enriched genes 74 6.7.4 Downregulated and neuron-enriched genes 75 6.8 GO ENRICHMENT ANALYSIS 75 6.9 CONCLUSION 75 7 DISCUSSION 78 7.1 WHAT MAKES US HUMAN? 78 7.2 IN UTERO ELECTROPORATION OF A HUMAN-SPECIFIC GENE IN THE DEVELOPING MOUSE NEOCORTEX 81 7.2.1 Opportunities and limitations of the approach 81 7.3 THE FAMILY OF SEQUENCE SIMILARITY 72 AND HUMAN UNIQUENESS 83 7.3.1 Cell cycle regulation and NPC maintenance 83 7.3.2 Cell death 84 7.3.3 Neurogenic period 85 7.3.4 TrkB signaling 85 7.3.5 Mitochondria 86 7.3.6 Angiogenesis 88 7.3.7 An evolutionary immunological adaptation in the brain? 89 7.3.8 FAM72 and SRGAP2 90 7.3.9 FAM72, Neanderthals, and lncRNAs 91 7.4 FUTURE DIRECTIONS 92 7.4.1 Loss of function 92 7.4.2 Gain of function 92 8 SUMMARY / ZUSAMMENFASSUNG 95 8.1 SUMMARY 95 8.2 ZUSAMMENFASSUNG 98 9 MATERIALS AND METHODS 101 9.1 CHART OF ALL EXPERIMENTS 101 9.2 COMPUTATIONAL ANALYSIS 101 9.2.1 Reference sequences and multiple sequence alignments 101 9.2.2 Transmembrane domain prediction 102 9.3 AMPLIFICATION, SUBCLONING, MUTAGENESIS 102 9.3.1 Amplification from human brain cDNA 102 9.3.2 Subcloning 103 9.2.3 Mutagenesis 103 9.4 PLASMID VERIFICATION 104 9.4.1 Transfection of Cos7 cells 104 9.4.2 Immunoblots 104 9.4.3 In situ hybridization (ISH) 105 9.5 MICE 105 9.6 IN UTERO ELECTROPORATION 105 9.7 FIXATION AND CRYOSECTIONS 106 9.8 IMMUNOFLUORESCENCE AND ANTIBODIES 106 9.9 EDU DETECTION 107 9.10 IMAGE ACQUISITION 108 9.11 STATISTICS 108 9.12 MICRODISSECTION AND SINGLE CELL SUSPENSION 108 9.13 FACS 109 9.14 RNA SEQUENCING 109 9.15 TRANSCRIPTOME ANALYSIS 110 10 REFERENCES 111 11 APPENDIX 145 11.1 CONFERENCE PRESENTATION 145 V. ACKNOWLEDGMENTS 146 / Introduction: The higher cognitive functions that characterize modern humans can be attributed to the cerebral neocortex and its remarkable expansion in size during the last 5 – 7 million years of human evolution. The identification of the underlying genomic changes will be not only of importance to better understand the unique complexity of the human brain, but also its susceptibility to neurological and psychiatric diseases. Recently, 15 human-specific genes preferentially expressed in neural progenitor cells (NPCs) of the human fetal neocortex were identified (Florio et al., 2018). Three of them, FAM72B, C and D belong to the Family of sequence similarity 72 (FAM72) and occurred in the human genome by gene duplication 3.4 – 1 mya. Aims & Approaches: Specifically, it was asked whether FAM72D plays a diverse role compared to the ancestral FAM72A (Results II, III, IV) due to the specific sets of amino acid substitutions it acquired (Results I). Effects of FAM72A and FAM72D on the proliferative capacity and gene expressions of embryonic mouse NPCs were analyzed upon ectopic expression either of FAM72A or FAM72D during embryonic mouse neocortical development. Methods: In utero electroporation (IUE) of embryonic mouse brains was performed to drive the expression of a red or green fluorescent protein (RFP or GFP) either plus empty DNA vector (pCAGGS; control), pCAGGS-FAM72A or pCAGGS-FAM72D plasmids in the dorsolateral neocortex at mid-neurogenesis (embryonic day 13.5, E13.5; Results II) or in the medial neocortex at late-neurogenesis (E15.5; Results III). NPC proliferation was evaluated by immunofluorescence of Ki67 (immunohistochemistry, IHC), a cell proliferation marker, and phosphorylated Histone H3 (PH3), a marker of cell mitosis. Moreover, the abundance of NPCs using immunofluorescence of basal intermediate progenitor (Tbr2) and apical and basal radial glia (Sox2) markers, and the gliogenesis by Olig2 immunofluorescence was analyzed. Additional experiments were carried out to study the capacity of NPCs to reenter the cell cycle upon IUE of FAM72D. To this end, pregnant mice were intraperitoneally injected with the thymidine analog 5-Ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) 24 h post-IUE, to label all cells undergoing S-phase of the cell cycle (i.e., all cells that reentered the cell cycle after IUE) in the developing mouse brains. Embryonic brains were collected 24 h after EdU injection and co-stained with Ki67. Ki67 and EdU double positive cells were considered as cells that reentered the cell cycle. To execute the transcriptome analysis E13.5 mice were electroporated with pCAGGS-GFP either plus an empty DNA vector (pCAGGS, control), a vector driving expression of FAM72A (pCAGGS-FAM72A) or FAM72D (pCAGGS-FAM72D). Subsequently, the electroporated dorsolateral neocortical areas were microdissected at E14.5 and dissociated into single cells. The electroporated (GFP+) cells were isolated from the single cell suspensions by the fluorescence-activated cell sorting (FACS). The isolated cells were processed for RNA sequencing. Data analysis was performed as previously reported (Florio et al., 2015). Results: By immunohistochemistry, no significant changes in any of the proliferative parameters or in the abundance of progenitors in the ventricular zone (VZ) and subventricular zone (SVZ) of the developing mouse neocortex upon ectopic expression of FAM72D compared to FAM72A and control samples were detected (Results II, III). However, the transcriptome analysis (Results IV) showed 88 significantly up- and 52 down-regulated genes upon FAM72A and 91 significantly up- and 67 downregulated genes upon FAM72D expression compared to the control. Only two of these differentially expressed genes were found to be upregulated upon FAM72A and FAM72D with an expression >1 fpkm: Syde1 and Shisa5. Besides, six genes specifically upregulated upon ectopic expression of FAM72D exhibiting fpkm > 1 were identified and characterized using the existing literature: Tapbp, Mtfp1, Slitrk5, Parp9, Cnp, Rbm43. Beyond that, gene ontology analysis showed significant enrichment of angiogenesis-related genes (e.g., Vegfc) upon FAM72A expression. Interestingly, there were more genes found to be enriched in NPCs that were upregulated compared to control upon FAM72D than FAM72A expression, but more NPC enriched genes downregulated upon FAM72A compared to FAM72D expression. In the case of differentially expressed neuron-enriched genes, the data was were inverse, which slightly supports the idea that FAM72D rather than FAM72A could positively affect the maintenance of NPC characteristics. Conclusions: In a previous study knockdown of Fam72a in adult mouse NPCs increased neurogenesis (Benayoun et al., 2014). This suggests, in conjunction with the present results, that FAM72A and FAM72D are not sufficient, but may be required, to promote NPC maintenance (Results II, III). This is why the gain of function experiments conducted in this study should be complemented by a loss of function approach in the developing mouse neocortex, in chimpanzee or human-derived brain organoids. Because of their expression in the NPCs of the developing human neocortex, it might be productive to analyze the potential synergistic effect on NPC proliferation of the FAM72s and the 12 other human-specific genes such as ARHGAP11B. Among other mechanisms discussed based on the gene expression analysis in this thesis (Results IV and Discussion), the upregulation of Slitrk5 upon ectopic expression of the human-specific FAM72D could be particularly remarkable. Slitrk5 is known to be involved in the recycling of the TrKB receptor (Song et al., 2015), which affects fundamental aspects of brain development. While FAM72A was found to inhibit the TrKB receptor (Nehar et al., 2009), the occurrence of FAM72D could indirectly rescue the TrKB receptor function via Slitrk5 and thereby prolonging or enhancing essential features such as precursor cell survival and neurogenesis in humans. Therefore, this study provides the first functional characterization of the evolutionary highly interesting region in the human genome comprising the FAM72 genes during embryonic neocortical development in vivo and offers numerous starting points for further investigations, that will collectively facilitate a comprehensive understanding of the genomic adaptations underlying the astonishing evolution of the human brain.:1 INTRODUCTION 11 1.1 WHAT MADE US HUMAN? 11 1.2 THE NEOCORTEX 12 1.2.1 Origin and structure 12 1.2.2 Neurogenesis in the developing neocortex 14 1.2.3 How to increase the neuronal output 18 1.3 EVOLUTION AND GENE DUPLICATION 19 1.3.1 Gene duplication and evolutionary novelty 19 1.3.2 Mechanisms of replication 21 1.3.3 Fates of duplicated genes 22 1.3.4 Which genes tend to duplicate? 24 1.3.5 Human adaptation and gene duplication 24 1.4 HUMAN-SPECIFIC SIGNATURES OF NEOCORTICAL EXPANSION 25 1.5 IDENTIFICATION OF HUMAN-SPECIFIC GENES EXPRESSED IN THE DEVELOPING NEOCORTEX.. 25 1.6 FAMILY WITH SEQUENCE SIMILARITY 72 (FAM72) 26 1.6.1 Evolutionary origin 26 1.6.2 Subcellular localization 27 1.6.3 Cell cycle regulation 28 1.6.4 NPC maintenance 28 2 AIMS & APPROACHES 30 3 RESULTS I 31 3.1 FROM GENES TO PROTEINS: 1 FAMILY – 4 PARALOGUES 31 3.2 FAM72 MRNA EXPRESSION LEVELS IN THE DEVELOPING MOUSE AND HUMAN NEOCORTEX 32 3.3 COMPUTATIONAL ANALYSES 34 3.3.1 Proportion of cysteines 34 3.3.2 Transmembrane domain 34 3.4 AMPLIFICATION, SUBCLONING AND MUTAGENESIS 36 3.4.1 Amplification from human cDNA 36 3.4.2 Verification of the pCAGGs vectors 36 4 RESULTS II 38 4.1 ECTOPIC EXPRESSION OF FAM72A AND FAM72D IN THE MOUSE DORSOLATERAL NEOCORTEX AT MID-NEUROGENESIS 38 4.2 NPC PROLIFERATION 39 4.2.1 Assessment of NPC proliferation using Ki67 immunofluorescence 39 4.2.2 Cell cycle reentry 41 4.2.3 Assessment of mitosis using PH3 immunofluorescence 43 4.2.4 Conclusion 45 4.3 NPC ABUNDANCE 46 4.3.1 Assessment of NPC abundance using Tbr2 and Sox2 immunofluorescence 46 4.3.2 Conclusion 49 5 RESULTS III 50 5.1 ECTOPIC EXPRESSION OF FAM72A and FAM72D IN THE MOUSE MEDIAL CORTEX AT LATE-NEUROGENESIS 50 5.2 NPC PROLIFERATION 51 5.2.1 Assessment of the NPC proliferation using Ki67 immunofluorescence 51 5.3 NPC ABUNDANCE 52 5.3.1 Assessment of NPC abundance using Tbr2 and Sox2 immunofluorescence 52 5.4 GLIOGENESIS 53 5.4.1 Assessment of gliogenesis using Olig2 immunofluorescence 53 5.5 CONCLUSION 54 6 RESULTS IV 55 6.1 DIFFERENCES IN GENE EXPRESSION UPON ANCESTRAL FAM72A AND HUMAN-SPECIFIC FAM72D EXPRESSION AT MID-NEUROGENESIS 55 6.1.1 Rationale and experimental setup 55 6.2 DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES UPON ECTOPIC FAM72A AND FAM72D EXPRESSION IN THE DEVELOPING MOUSE DORSOLATERAL NEOCORTEX 56 6.3 UPREGULATED GENES UPON THE ECTOPIC FAM72A OR FAM72D EXPRESSION 57 6.3.1 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A and FAM72D expression 57 6.3.2 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A or D expression – cut off: fpkm >1 58 6.3.3 Upregulated genes upon the ectopic FAM72A and D expression – cut off: fpkm >1 59 6.4 UPREGULATED GENES SPECIFICALLY UPON THE ECTOPIC FAM72D EXPRESSION – CUT OFF: FPKM >1 60 6.4.1 Tapbp (TAP binding protein, Tapasin) 60 6.4.2 Mtfp1 (mitochondrial fission protein 1, Mtp18) 61 6.4.3 Slitrk5 (Slit and Ntrk-like protein 5) 61 6.4.4 Parp9 (Poly(ADP-ribose) polymerase 9) 63 6.4.5 Cnp (2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase) 63 6.4.6 Rbm43 (RNA binding motif protein 43) 65 6.5 DOWNREGULATED GENES UPON THE ECTOPIC FAM72A OR FAM72D EXPRESSION 66 6.5.1 Downregulated genes upon the ectopic FAM72A or D expression – cut off: fpkm >1 66 6.5.2 Downregulated genes upon ectopic FAM72A expression – cut off: fpkm >1 66 6.5.3 Downregulated genes upon ectopic FAM72D expression – cut off: fpkm >1 67 6.6 GENES PREVIOUSLY SHOWN TO BE DIFFERENTIALLY EXPRESSED UPON FORCED FAM72A EXPRESSION 69 6.6.1 Cell cycle regulators 69 6.6.2 Tumor suppressor genes 69 6.6.3 PROTEINS PREVIOUSLY OBSERVED TO INTERACT WITH FAM72A 70 6.7 EFFECT OF ECTOPIC FAM72A AND FAM72D EXPRESSION ON GENES IMPLICATED IN NEURAL LINEAGE FATE DECISION 70 6.7.1 Upregulated and NPC-enriched genes 71 6.7.2 Downregulated and NPC-enriched genes 73 6.7.3 Upregulated and neuron-enriched genes 74 6.7.4 Downregulated and neuron-enriched genes 75 6.8 GO ENRICHMENT ANALYSIS 75 6.9 CONCLUSION 75 7 DISCUSSION 78 7.1 WHAT MAKES US HUMAN? 78 7.2 IN UTERO ELECTROPORATION OF A HUMAN-SPECIFIC GENE IN THE DEVELOPING MOUSE NEOCORTEX 81 7.2.1 Opportunities and limitations of the approach 81 7.3 THE FAMILY OF SEQUENCE SIMILARITY 72 AND HUMAN UNIQUENESS 83 7.3.1 Cell cycle regulation and NPC maintenance 83 7.3.2 Cell death 84 7.3.3 Neurogenic period 85 7.3.4 TrkB signaling 85 7.3.5 Mitochondria 86 7.3.6 Angiogenesis 88 7.3.7 An evolutionary immunological adaptation in the brain? 89 7.3.8 FAM72 and SRGAP2 90 7.3.9 FAM72, Neanderthals, and lncRNAs 91 7.4 FUTURE DIRECTIONS 92 7.4.1 Loss of function 92 7.4.2 Gain of function 92 8 SUMMARY / ZUSAMMENFASSUNG 95 8.1 SUMMARY 95 8.2 ZUSAMMENFASSUNG 98 9 MATERIALS AND METHODS 101 9.1 CHART OF ALL EXPERIMENTS 101 9.2 COMPUTATIONAL ANALYSIS 101 9.2.1 Reference sequences and multiple sequence alignments 101 9.2.2 Transmembrane domain prediction 102 9.3 AMPLIFICATION, SUBCLONING, MUTAGENESIS 102 9.3.1 Amplification from human brain cDNA 102 9.3.2 Subcloning 103 9.2.3 Mutagenesis 103 9.4 PLASMID VERIFICATION 104 9.4.1 Transfection of Cos7 cells 104 9.4.2 Immunoblots 104 9.4.3 In situ hybridization (ISH) 105 9.5 MICE 105 9.6 IN UTERO ELECTROPORATION 105 9.7 FIXATION AND CRYOSECTIONS 106 9.8 IMMUNOFLUORESCENCE AND ANTIBODIES 106 9.9 EDU DETECTION 107 9.10 IMAGE ACQUISITION 108 9.11 STATISTICS 108 9.12 MICRODISSECTION AND SINGLE CELL SUSPENSION 108 9.13 FACS 109 9.14 RNA SEQUENCING 109 9.15 TRANSCRIPTOME ANALYSIS 110 10 REFERENCES 111 11 APPENDIX 145 11.1 CONFERENCE PRESENTATION 145 V. ACKNOWLEDGMENTS 146

Acidophilic iron oxidizing bacteria of the betaproteobacterial genus “Ferrovum” are ubiquitously distributed in acid mine drainage (AMD) habitats worldwide. Since their isolation and maintenance in the laboratory has proved to be extremely difficult, members of this genus are not accessible to a “classical” microbiological characterization with exception of the designated type strain “Ferrovum myxofaciens” P3G. The present study reports the characterization of “Ferrovum” strains at genome and transcriptome level. “Ferrovum” sp. JA12, “Ferrovum” sp. PN-J185 and “F. myxofaciens” Z-31 represent the iron oxidizers of the mixed cultures JA12, PN-J185 and Z-31. The mixed cultures were derived from the mine water treatment plant Tzschelln close to the lignite mining site in Nochten (Lusatia, Germany). The mixed cultures also contain a heterotrophic strain of the genus Acidiphilium. The genome analysis of Acidiphilium sp. JA12-A1, the heterotrophic contamination of the mixed culture JA12, indicates an interspecies carbon and phosphate transfer between Acidiphilium and “Ferrovum” in the mixed culture, and possibly also in their natural habitat. The comparison of the inferred metabolic potentials of four “Ferrovum” strains and the analysis of their phylogenetic relationships suggest the existence of two subgroups within the genus “Ferrovum” (i.e. the operational taxonomic units OTU-1 and OUT-2) harboring characteristic metabolic profiles. OTU-1 includes the “F. myxofaciens” strains P3G and Z-31, which are predicted to be motile and diazotrophic, and to have a higher acid tolerance than OTU-2. The latter includes two closely related proposed species represented by the strains JA12 and PN-J185, which appear to lack the abilities of motility, chemotaxis and molecular nitrogen fixation. Instead, both OTU-2 strains harbor the potential to use urea as alternative nitrogen source to ammonium, and even nitrate in case of the JA12-like species. The analysis of the genome architectures of the four “Ferrovum” strains suggests that horizontal gene transfer and loss of metabolic genes, accompanied by genome reduction, have contributed to the evolution of the OTUs. A trial transcriptome study of “Ferrovum” sp. JA12 supports the ferrous iron oxidation model inferred from its genome sequence, and reveals the potential relevance of several hypothetical proteins in ferrous iron oxidation. Although the inferred models in “Ferrovum” spp. share common features with the acidophilic iron oxidizers of the Acidithiobacillia, it appears to be more similar to the neutrophilic iron oxidizers Mariprofundus ferrooxydans (“Zetaproteobacteria”) and Sideroxydans lithotrophicus (Betaproteobacteria). These findings suggest a common origin of ferrous iron oxidation in the Beta- and “Zetaproteobacteria”, while the acidophilic lifestyle of “Ferrovum” spp. may have been acquired later, allowing them to also colonize acid mine drainage habitats.

Acidophilic iron oxidizing bacteria of the betaproteobacterial genus “Ferrovum” are ubiquitously distributed in acid mine drainage (AMD) habitats worldwide. Since their isolation and maintenance in the laboratory has proved to be extremely difficult, members of this genus are not accessible to a “classical” microbiological characterization with exception of the designated type strain “Ferrovum myxofaciens” P3G. The present study reports the characterization of “Ferrovum” strains at genome and transcriptome level. “Ferrovum” sp. JA12, “Ferrovum” sp. PN-J185 and “F. myxofaciens” Z-31 represent the iron oxidizers of the mixed cultures JA12, PN-J185 and Z-31. The mixed cultures were derived from the mine water treatment plant Tzschelln close to the lignite mining site in Nochten (Lusatia, Germany). The mixed cultures also contain a heterotrophic strain of the genus Acidiphilium. The genome analysis of Acidiphilium sp. JA12-A1, the heterotrophic contamination of the mixed culture JA12, indicates an interspecies carbon and phosphate transfer between Acidiphilium and “Ferrovum” in the mixed culture, and possibly also in their natural habitat. The comparison of the inferred metabolic potentials of four “Ferrovum” strains and the analysis of their phylogenetic relationships suggest the existence of two subgroups within the genus “Ferrovum” (i.e. the operational taxonomic units OTU-1 and OUT-2) harboring characteristic metabolic profiles. OTU-1 includes the “F. myxofaciens” strains P3G and Z-31, which are predicted to be motile and diazotrophic, and to have a higher acid tolerance than OTU-2. The latter includes two closely related proposed species represented by the strains JA12 and PN-J185, which appear to lack the abilities of motility, chemotaxis and molecular nitrogen fixation. Instead, both OTU-2 strains harbor the potential to use urea as alternative nitrogen source to ammonium, and even nitrate in case of the JA12-like species. The analysis of the genome architectures of the four “Ferrovum” strains suggests that horizontal gene transfer and loss of metabolic genes, accompanied by genome reduction, have contributed to the evolution of the OTUs. A trial transcriptome study of “Ferrovum” sp. JA12 supports the ferrous iron oxidation model inferred from its genome sequence, and reveals the potential relevance of several hypothetical proteins in ferrous iron oxidation. Although the inferred models in “Ferrovum” spp. share common features with the acidophilic iron oxidizers of the Acidithiobacillia, it appears to be more similar to the neutrophilic iron oxidizers Mariprofundus ferrooxydans (“Zetaproteobacteria”) and Sideroxydans lithotrophicus (Betaproteobacteria). These findings suggest a common origin of ferrous iron oxidation in the Beta- and “Zetaproteobacteria”, while the acidophilic lifestyle of “Ferrovum” spp. may have been acquired later, allowing them to also colonize acid mine drainage habitats.:EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ... 2 CONTENT ... 4 SUMMARY ... 9 CHAPTER I ... 11 ORIGIN AND MICROBIOLOGY OF ACID MINE DRAINAGE ... 11 ACIDOPHILIC IRON OXIDIZING BACTERIA OF THE GENUS “FERROVUM” ... 12 APPLICATION OF OMICS-BASED APPROACHES TO CHARACTERIZE ACIDOPHILES ... 14 AIMS OF THE PRESENT WORK ... 15 CHAPTER II ... 17 ABSTRACT ... 18 INTRODUCTION ... 18 METHODS ... 19 GENOME PROJECT HISTORY ... 19 GROWTH CONDITIONS AND GENOMIC DNA PREPARATION ... 20 GENOME SEQUENCING AND ASSEMBLY ... 20 GENOME ANNOTATION ... 21 RESULTS ... 21 CLASSIFICATION AND FEATURES ... 21 GENOME PROPERTIES ... 24 INSIGHTS FROM THE GENOME SEQUENCE ... 24 COMPARATIVE GENOMICS ... 28 CONCLUSIONS ... 30 ACKNOWLEDGMENTS ... 32 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 32 CHAPTER III ... 33 ABSTRACT ... 34 INTRODUCTION ... 34 METHODS ... 36 ORIGIN AND CULTIVATION OF “FERROVUM” STRAIN JA12 ... 36 GENOME SEQUENCING, ASSEMBLY AND ANNOTATION ... 37 VISUALIZATION OF THE NEARLY COMPLETE GENOME ... 38 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 39 PREDICTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS ... 39 NUCLEOTIDE SEQUENCE ACCESSION NUMBER ... 39 RESULTS AND DISCUSSION ... 39 PHYLOGENETIC CLASSIFICATION OF “FERROVUM” STRAIN JA12 ... 39 GENOME PROPERTIES ... 40 NUTRIENT ASSIMILATION AND BIOMASS PRODUCTION ... 44 Carbon dioxide fixation ... 44 Central carbon metabolism ... 45 Nitrogen ... 47 Phosphate ... 49 Sulfate ... 50 ENERGY METABOLISM ... 50 Ferrous iron oxidation ... 50 Other redox reactions connected to the quinol pool ... 54 Predicted formate dehydrogenase ... 55 STRATEGIES TO ADAPT TO ACIDIC ENVIRONMENTS, HIGH METAL LOADS AND OXIDATIVE STRESS ... 55 Acidic environment ... 55 Strategies to cope with high metal and metalloid loads ... 58 Oxidative stress ... 59 HORIZONTAL GENE TRANSFER ... 60 CONCLUSIONS ... 61 ACKNOWLEDGMENTS ... 62 AUTHORS\' CONTRIBUTIONS ... 62 CHAPTER IV ... 63 ABSTRACT ... 64 INTRODUCTION ... 64 METHODS ... 66 ORIGIN AND CULTIVATION OF “FERROVUM” STRAINS PN-J185 AND Z-31 ... 66 GENOME SEQUENCING, ASSEMBLY AND ANNOTATION ... 66 PREDICTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS ... 67 COMPARATIVE GENOMICS ... 68 Phylogenomic analysis ... 68 Assignment of protein-coding genes to the COG classification ... 68 Identification of orthologous proteins ... 68 Comparison and analysis of genome architectures ... 69 RESULTS ... 69 GENERAL GENOME FEATURES AND PHYLOGENETIC RELATIONSHIP OF THE FOUR “FERROVUM” STRAINS ... 69 COMPARISON OF INFERRED METABOLIC TRAITS ... 71 Identification of core genes and flexible genes ... 71 Comparison of the central metabolism ... 74 Central carbon metabolism ... 74 Nitrogen metabolism ... 77 Energy metabolism ... 78 Cell mobility and chemotaxis ... 78 Diversity of predicted stress tolerance mechanisms ... 78 Maintaining the intracellular pH homeostasis ... 78 Coping with high metal loads ... 79 Oxidative stress management ... 79 IDENTIFICATION OF POTENTIAL DRIVING FORCES OF GENOME EVOLUTION ... 80 Prediction of mobile genetic elements ... 81 Linking the differences in the predicted metabolic profiles to the genome architectures ... 82 Gene cluster associated with flagella formation and chemotaxis in “F. myxofaciens” ... 84 Gene clusters associated with the utilization of alternative nitrogen sources ... 86 Gene cluster associated with carboxysome formation in “F. myxofaciens” and OTU-2 strain JA12 ... 87 Putative genomic islands in the OTU-strain JA12 ... 89 CRISPR/Cas in “F. myxofaciens” Z-31: a defense mechanism against foreign DNA ... 91 DISCUSSION ... 92 THE COMPARISON OF THEIR METABOLIC PROFILES INDICATES THE EXISTENCE OF OTU- AND STRAIN-SPECIFIC FEATURES ... 92 GENOME EVOLUTION OF THE “FERROVUM” STRAINS APPEARS TO BE DRIVEN BY HORIZONTAL GENE TRANSFER AND GENOME REDUCTION ... 94 Horizontal gene transfer ... 94 Mechanisms of genome reduction ... 95 CONCLUDING REMARKS ... 98 ACKNOWLEDGMENTS ... 98 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 98 CHAPTER V ... 99 ABSTRACT ... 100 INTRODUCTION ... 100 METHODS ... 102 CULTIVATION OF THE “FERROVUM”-CONTAINING MIXED CULTURE JA12 ... 102 Up-scaling of pre-cultures for the transcriptome study ... 103 Experimental setup of the transcriptome study ... 103 Cell harvest from large culture volumes ... 106 EXTRACTION OF TOTAL RNA ... 106 LIBRARY CONSTRUCTION AND SEQUENCING ... 107 DATA ANALYSIS ... 107 Processing of raw data ... 107 Quantification of gene expression levels ... 108 Functional analysis ... 108 RESULTS ... 108 CULTIVATION OF THE MIXED CULTURE JA12 IN THE MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 108 Growth monitoring ... 108 Microbial composition ... 111 RNA SEQUENCING (RNA-SEQ) ... 112 FUNCTIONAL CATEGORIZATION OF EXPRESSED GENES ... 113 Functional assignment of highly expressed genes ... 117 Functional assignment of poorly expressed genes ... 121 COMPARISON OF EXPRESSION LEVELS OF GENES PREDICTED TO BE INVOLVED IN OXIDATIVE STRESS MANAGEMENT ... 122 DISCUSSION ... 124 METABOLIC PATHWAYS RELEVANT UNDER CULTURE CONDITIONS MIMICKING THE NATURAL CONDITIONS IN THE MINE WATER TREATMENT PLANT ... 125 Novel insights into the energy metabolism of “Ferrovum” sp. JA12 ... 125 Insights from poorly expressed genes ... 126 VARIATION OF GENE EXPRESSION PATTERNS UNDER THE DIFFERENT CONDITIONS ... 128 EVALUATION OF THE EXPERIMENTAL SET-UP INVOLVING THE MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 129 CONCLUDING REMARKS: SIGNIFICANCE OF THE PRESENT TRANSCRIPTOME STUDY ... 130 ACKNOWLEDGMENTS ... 131 AUTHOR CONTRIBUTIONS ... 131 CHAPTER VI ... 133 ABSTRACT ... 133 EXTENDED INSIGHTS INTO THE FERROUS IRON OXIDATION IN BETAPROTEOBACTERIA ... 133 MECHANISMS OF PHYLOGENETIC AND METABOLIC DIVERSIFICATION WITHIN THE GENUS “FERROVUM” ... 136 INFERRED ROLES OF “FERROVUM” SPP. IN THE MICROBIAL NETWORK OF THE MINE WATER TREATMENT PLANT ... 138 PERSPECTIVES ... 143 REFERENCES ... 145 SUPPLEMENTARY MATERIAL ... 170 DATA DVD ... 170 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER III ... 171 NUCLEOTIDE ACCESSION NUMBERS ... 171 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 171 GENOME PROPERTIES ... 173 NUTRIENT ASSIMILATION ... 174 Carbon metabolism ... 174 FERROUS IRON OXIDATION ... 176 HORIZONTAL GENE TRANSFER ... 179 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER IV ... 180 PHYLOGENETIC ANALYSIS ... 180 ASSIGNMENT OF PROTEIN-CODING GENES TO THE COG CLASSIFICATION ... 180 COMPARISON OF THE CENTRAL METABOLISM ... 181 Predicted metabolic potential of the four “Ferrovum” strains ... 181 Genes predicted to be involved in the central metabolism, energy metabolism, cell motility and stress management in the four “Ferrovum” strains ... 183 PREDICTED MOBILE GENETIC ELEMENTS IN THE GENOMES OF THE FOUR “FERROVUM” STRAINS ... 184 THE FLAGELLA AND CHEMOTAXIS GENE CLUSTER ... 184 THE UREASE GENE CLUSTER ... 185 THE CARBOXYSOME GENE CLUSTER ... 186 PUTATIVE GENOMIC ISLANDS IN “FERROVUM” SP. JA12 ... 187 Gene content of the genomic islands ... 187 Flanking sites of the putative genomic islands 1 and 2 ... 188 SUPPLEMENTARY MATERIAL FOR CHAPTER V ... 189 ORGANIZATION AND OPERATION OF THE LABFORS 5 MULTIPLE BIOREACTOR SYSTEM ... 189 INVESTIGATION OF THE MICROBIAL COMPOSITION IN THE IRON OXIDIZING MIXED CULTURE JA12 ... 192 SUPPLEMENTARY DATA OF THE TRANSCRIPTOME DATA ANALYSIS ... 193 RNA-Seq statistics ... 193 Expression strength of protein-coding genes ... 194 Expression of genes involved in carboxysome formation ... 197 Expression of a ribosomal proteins-encoding gene cluster ... 199 Expression of a gene cluster presumably involved in ferrous iron oxidation ... 202 Lowest expressed genes ... 205 Expression of genes predicted to be involved in oxidative stress response ... 206 ACKNOWLEDGMENTS ... 208 COLLEAGUES ... 208 ERFOLGSTEAM “JUNGE FRAUEN AN DIE SPITZE” (“YOUNG WOMEN TO THE TOP“) ... 208 FAMILY AND FRIENDS ... 209 FUNDING ... 209 CURRICULUM VITAE ... 210 LIST OF PUBLICATIONS ... 212 RESEARCH ARTICLES ... 212 CONFERENCE PROCEEDINGS ... 212 ORAL PRESENTATIONS AND POSTERS ... 213