En milieu forestier, la décomposition de la matière organique d’origine végétale et son assimilation par les microorganismes sont des processus essentiels au bon fonctionnement des sols et du cycle du carbone. Les mécanismes impliqués dans ces phénomènes de dégradation sont fortement contrôlés par les champignons saprotrophes qui sécrètent de nombreuses enzymes hydrolytiques afin d’accéder à leur principale source de nutriments qui se trouve sous la forme de polysaccharides (cellulose et hémicelluloses). L’hydrolyse enzymatique de ces polymères végétaux engendre une grande diversité de composés de faible poids moléculaire (mono- et oligosaccharides). Ces molécules pénètrent dans la cellule fongique via des systèmes de transporteurs membranaires dont la présence/absence et la spécificité de substrat contribuent à la versatilité métabolique de ces microorganismes du sol. La nature de l’essence forestière affecte fortement la diversité et la composition des communautés fongiques. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que les communautés fongiques sélectionnées par les différentes essences forestières diffèrent entre elles par la diversité des mécanismes qu’elles mettent en place lors du processus de décomposition de la matière organique d'origine végétale et lors du transport des produits de dégradation ; et que de ce fait chaque communauté fongique est spécifiquement adaptée à la nature de la litière produite par l’espèce végétale considérée. Par des approches de séquençage haut-débit d’amplicons générés à partir d’ADNc environnementaux, nous avons analysé la diversité des transcrits codant des protéines fongiques impliquées à la fois dans la dégradation des polysaccharides végétaux et dans le transport des sucres issus de cette hydrolyse enzymatique au sein de sols localisés sous des forêts de hêtres et d’épicéas. L’analyse des données obtenues a mis en évidence des transcrits jusqu’alors inconnus et spécifiquement retrouvés pour plus 80% d’entre eux sous l’un des deux couverts végétaux conduisant ainsi à un effet significatif de l’essence forestière sur la composition des gènes exprimés par les communautés fongiques. Des transporteurs potentiellement spécifiques du mannose ont été détectés, pour la première fois, sous la forêt d’épicéas par une approche de crible fonctionnel dans la levure de banques d’ADNc environnementaux. Or, cette essence forestière est connue pour posséder d’importantes quantités de mannose au niveau de ses hémicelluloses. Les résultats obtenus au cours de cette thèse soulignent l’importance d’étudier la diversité fonctionnelle des communautés fongiques pour comprendre l’impact du couvert végétal sur leur composition et le fonctionnement des écosystèmes forestiers / The degradation of plant biomass is an essential process for the proper functioning of forest soils and terrestrial carbon cycling. Mechanisms involved in these processes are strongly controlled by saprotrophic fungi which secrete several hydrolytic enzymes to access at their primary nutrient sources found under the form of polysaccharides (cellulose and hemicelluloses). Enzymatic hydrolysis of plant polymers releases a high diversity of low molecular weight compounds (mono- and oligosaccharides). These molecules enter in fungal cell using transmembrane transporter systems. Consequently, the presence/absence and the substrate specificity of these transporters might contribute to the metabolic versatility of soil fungi. Several studies have demonstrated that tree species strongly affect diversity and composition of fungal communities. In this context, we hypothesized that the fungal communities selected by the different tree species expressed specific lignocellulolytic enzymes and sugar transporters; and thereby each fungal community was specifically adapted to the nature of litter produced by the tree species considered. We assessed, by the high-throughput sequencing of gene-fragments amplified from soil cDNA, the impact of tree species (Beech vs Spruce) on the diversity of genes encoding either lignocellulolytic enzymes or sugar porters expressed by soil fungi in two mono-specific forests. Our results revealed that most detected genes, encoding either lignocellulolytic enzymes or sugar transporters, have an unknown origin and are specifically found (for more than 80% of them) in one of the two forest soils. This work showed a significant “tree species effect” on the composition of functional genes expressed by soil fungi and suggests that beyond the species level, functional diversity of fungal communities must be addressed to better understand ecosystem functioning. Moreover, by using a functional metatranscriptomic approach, we identified functional transporter sequences differing with respect to their substrate specificities. From a spruce cDNA library, and for the first time, we identified high affinity or mannose specific transporters. Coincidently, as opposed to beech, spruce is indeed a tree species with a large proportion of mannose in its hemicelluloses

Chez les plantes, la subérine est un biopolymère constitué de composés aliphatiques etaromatiques déposés au niveau de la paroi des cellules de plusieurs tissus comme l’endodermeet le périderme des racines ou encore le manteau des graines. La subérine forme une barrièrehydrophobe permettant entre autres de contrôler les flux d’eau et de solutés, et de protéger laplante de stress environnementaux comme la sécheresse ou les pathogènes. Grâce à desanalyses en LC-MS/MS et en GC-MS, nous avons pu montrer que la majorité des alcools grasprésents dans la fraction soluble de racines d’Arabidopsis thaliana est sous forme d’alkylcaféates et d’alkyl coumarates. De plus, nous avons montré que ces cires associées aupolymère de subérine sont présentes dès les premiers stades du développement de la racine.Une étude de la distribution des chaînes acyles des racines nous a permis de mettre enévidence la contribution majeure des alcools gras dans la composition de la subérine ainsi quel’importance de la subérine dans le métabolisme lipidique des racines. Afin d’identifier desacteurs impliqués dans l’export des précurseurs de la subérine vers l’espace extracellulaire,nous avons mené une approche de génétique inverse en utilisant des lignées mutées pour desgènes codant notamment pour des ABCG transporteurs co-exprimés avec des gènes connuspour participer à la biosynthèse de la subérine. Les résultats de ces analyses ont confirmé quele processus d’export fait intervenir plusieurs protéines pouvant avoir des fonctionsredondantes et ont suggéré l’implication d’un nouveau transporteur dans l’export desprécurseurs de subérine. / In plants, suberin is a complex biopolymer made of aliphatic and aromatic compounds.It is deposited in the cell wall of tissues such as the endoderm and the periderm of roots or thecoat of the seeds. Suberin forms a hydrophobic barrier controlling the flow of water andsolutes, and protecting the plant from environmental stresses such as drought or pathogens.Through LC-MS/MS and GC-MS analyses, we have shown that the majority of the fattyalcohols present in the soluble fraction of Arabidopsis roots is in the form of alkyl caffeatesand alkyl coumarates. Such waxes, most probably associated with the suberin polymer, arealready detected at early stages of root development. A study of the distribution of all acylchains present in roots allowed us to highlight the major contribution of fatty alcohols in thecomposition of suberin and the importance of suberin in the global lipid metabolism of theroots. To identify proteins involved in the export of suberin precursors to the extracellularspace, we conducted a reverse genetic approach using lines mutated in genes coding forseveral ABCG transporters which were co-expressed with genes known to participate in thebiosynthesis of suberin. The results of these analyses confirmed that the export processinvolves several proteins that can have redundant functions, and supported the involvement ofa new transporter in the export of the suberin precursors.

L’Adrénoleucodystrophie liée à l’X est une maladie neurodégénérative rare due à des mutations dans le gène ABCD1. Ce gène code un demi-transporteur ABC peroxysomal, impliqué dans l’importation d’acides gras à très longue chaîne. Deux autres demi-transporteurs sont localisés dans la membrane peroxysomale : ABCD2 et ABCD3. La surexpression d’ABCD2 permet de compenser la déficience en ABCD1, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques. Dans cette optique, l’objectif principal de ma thèse était d’étudier la fonction et la structure d’ABCD2, et plus largement des transporteurs ABC peroxysomaux.Les demi-transporteurs doivent au minimum se dimériser pour constituer un transporteur fonctionnel. Leur dimérisation alternative pourrait moduler leur spécificité de substrat. Afin de tester cette hypothèse, nous avons réalisé des constructions plasmidiques codant différents dimères chimériques, dont la fonctionnalité a été vérifiée par transfection transitoire dans deux modèles cellulaires (fibroblastes humains et levures). D’après nos résultats, ABCD1 et ABCD2 seraient fonctionnels quel que soit leur agencement dimérique. De plus, comme d’autres transporteurs ABC, les transporteurs ABC peroxysomaux pourraient s’oligomériser. En utilisant différentes techniques biochimiques (co-immunoprécipitation, sédimentation sur gradient de sucrose et électrophorèse en conditions natives), sur un modèle cellulaire surexprimant ABCD2-EGFP, nous démontrons qu’ABCD2-EGFP interagit avec ABCD1 et ABCD3, et que les transporteurs ABC peroxysomaux sont capables de s’oligomériser. Il reste désormais à déterminer les facteurs qui contrôlent cette oligomérisation et comprendre la valeur fonctionnelle de ces interactions. / X-linked Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare neurodegenerative disease caused by deficiency of the peroxisomal half-transporter ABCD1, implicated in very long chain fatty acids import. Two additional half-transporters are located in the peroxisomal membrane: ABCD2 and ABCD3. Over-expression of ABCD2 is known to compensate for ABCD1 deficiency, making ABCD2 a therapeutic target for X-ALD treatment. In this context, the main objective of my thesis was to investigate the function and the structure of ABCD2, and more broadly, of peroxisomal ABC transporters.Half-transporters must at least dimerize to form a functional transporter. Alternative dimerization could modulate substrate specificity. In order to test this hypothesis, we engineered plasmidic constructs encoding chimeric ABCD dimers, whose functionality has been evaluated by transient transfection in two cell models (human fibroblasts and yeasts). Our results show that, ABCD1 and ABCD2 are functional whatever their dimeric organization. Besides, like other ABC transporters, peroxisomal ABC transporters could oligomerize. By using a multi-technical approach (co-immunoprecipitation, velocity sucrose gradient and native polyacrylamide gel electrophoresis experiments) on stably transfected hepatoma cells expressing ABCD2-EGFP, we demonstrate that ABCD2-EGFP interacts with ABCD1 and ABCD3, and that peroxisomal ABC transporters oligomerize. The perspectives will consist in determining which factors control the oligomerization process and understanding the functional value of these interactions.

La concentration en protéines des grains est un critère qualitatif majeur qui conditionne la valeur économique et technologique du blé tendre (Triticum aestivum L.). Cependant, la forte relation négative existant entre concentration en protéines et rendement en grains implique que l’amélioration de la concentration en protéines par une approche génétique soit complexe à atteindre sans impacter négativement le rendement. Pour contourner cette difficulté, il a été proposé qu’une sélection variétale basée sur l’écart à cette relation négative (nommé Grain Protein Deviation ; GPD) permette d’améliorer la concentration en protéines indépendamment du rendement. Au niveau physiologique, le GPD est fortement corrélé à la capacité des génotypes à absorber de l’azote après floraison indépendamment de la quantité d’azote déjà absorbée à floraison, suggérant que la satiété en azote soit à la base de son établissement. Envisager une sélection sur la base du GPD nécessite cependant d’acquérir des connaissances approfondies des mécanismes impliqués dans la régulation de l’absorption d’azote par la satiété en azote, qui permettraient de cibler précisément des traits simples à quantifier et robustement associés à cette capacité accrue d’accumulation de protéines dans les grains.Cette étude se base sur deux expérimentations conduites en conditions contrôlées et une expérimentation au champ. Dans chacune de ces expérimentations, différents niveaux de fertilisation ont été appliqués en pré-floraison afin d’obtenir des statuts azotés contrastés à floraison. L’effet du statut azoté à floraison sur l’absorption post-floraison a ensuite été observé dans différentes conditions de disponibilités d’azote après floraison. Des mesures physiologiques et moléculaires ont été réalisées en parallèle des mesures d’absorption d’azote.Nous avons mis en évidence que l’absorption d’azote post-floraison présente une dynamique élaborée qui suppose qu’elle est soumise à des régulations complexes. Parmi celles-ci, le statut azoté des plantes à floraison conditionne en grande part la quantité d’azote absorbée dans les jours qui suivent la floraison (PANUprécoce , de floraison à floraison + 250 degrés-jour). La quantité de PANUprécoce se présente comme un déterminant fort de la concentration en protéines des grains du fait de la forte corrélation positive observée entre ces deux traits en conditions contrôlées et au champ, et ce indépendamment du niveau de rendement. L’étude de deux génotypes robustement contrastés pour le GPD a montré qu’à statuts azotés équivalents, la quantité de PANUprécoce est sujette à des effets génétiques qui tendent à confirmer l’impact de la variabilité génétique de satiété en azote sur l’établissement du GPD.Ces travaux ont permis de proposer des marqueurs du GPD potentiellement valorisables en sélection. Au niveau physiologique, la croissance des tiges après floraison se présente comme un marqueur prometteur du GPD car ce trait est fortement corrélé à la PANUprécoce. Au niveau moléculaire, la concentration en nitrates des racines, également soumise à des effets génétiques, est proposée comme marqueur potentiel du fait de son rôle probable dans la régulation expressionnelle des gènes impliqués dans l’absorption et l’assimilation d’azote. / Grain protein concentration is one of the major qualitative criteria of bread wheat (Triticum aestivum L.) economic and technological value. However, the negative relationship existing between protein concentration and grain yield implies that grain protein concentration improvement is complex to achieve without detrimental effect on grain yield. Breeding programs based on the deviation to this negative relationship (Grain protein deviation of GPD) have been proposed to be a suitable strategy to improve grain nitrogen concentration without detrimental effects on yield. At a physiological level, GPD is strongly correlated with genotypes aptitude to uptake nitrogen after flowering independently of the nitrogen amount already taken up before this stage, suggesting that satiety for nitrogen could be involved in its establishment. Breeding for GPD implies however a more detailed knowledge of the processes implied in nitrogen uptake regulation by nitrogen plant satiety. This would allow targeting traits both simple to measure and robustly associated with this increased capacity to accumulate proteins in grains.The present study is based on two experiments carried on under controlled conditions and a third led under field conditions. In all experiments, various levels of pre-flowering fertilization were applied in order to obtain contrasted plant nitrogen status at flowering. Nitrogen status effect on post-flowering nitrogen uptake was observed under various post-flowering N availability conditions. Physiological and molecular measurements were carried out in parallel with uptake measurements.We highlighted that post-flowering nitrogen uptake has an elaborate dynamic, suggesting the involvement of complex regulations. Among these, plant nitrogen status at flowering determines to a great extent the amount of nitrogen taken up during the days following flowering (early PANU, from flowering to flowering +250 °C.days-1). Early PANU appears to be a strong determinant of grain protein concentration, as strong positive correlations were observed between these two traits both under controlled conditions and field conditions, independently of grain yield level. The study of two genotypes strongly contrasted for GPD highlighted that, despite comparable N status, early PANU is subjected to strong genetic variations which tend to identify N satiety as a determinant of GPD.The present study identified robust markers of GPD of potential use in plant breeding. At a physiological level, post flowering stem elongation appears to be a promising marker of GPD since this trait is strongly correlated with early PANU. At a molecular level, root nitrate concentration, a trait submitted to genetic variations, is also proposed as a marker of GPD because of its role in the expression regulation of the genes governing nitrogen uptake and assimilation.

L’environnement naturel des levures est constitué d’une communauté de cellules. Les chercheurs, cependant, préfèrent étudier les levures dans des environnements plus simples et homogènes, comme des cultures en cellule unique ou en population, s’affranchissant ainsi de la complexité de la croissance spatiotemporelle, la différentiation, l’auto-organisation, ainsi que la façon dont ces caractéristiques sont formées et s’entrelacent à travers l’évolution et l’écologie. Nous avons mis en place un dispositif microfluidique multicouches permettant la croissance de colonie de levures dans des environnements dynamiques, spatialement structurés, contrôlés, partant d’une monocouche de levures à une colonie multicouches. La croissance des colonies, dans son ensemble comme à des positions spécifiques, est le résultat de la formation d’un gradient de nutriment au sein de celles-ci - gradient qui trouve son origine dans le différent taux de diffusion des nutriments, des taux d’absorption de ceux-ci par les cellules, ainsi que de leurs concentrations initiales. Lorsqu’un nutriment en quantité limitante (par exemple le glucose ou un acide aminé) est épuisé, à une distance spécifique de la source de nutriments, les cellules au sein de la colonie cessent de croitre. Nous avons été en mesure de moduler cette distance spécifique en variant la concentration initiale de nutriments ainsi que le taux d’absorption des cellules. Les motifs d’expression de gènes de la colonie nous ont donné des informations sur la formation de micro environnements spécifiques ainsi que sur le développement subséquent, la différentiation et l’auto-organisation. Nous avons quantifié les motifs d’expression de sept gènes de transport du glucose (HXT1-7), chacun exprimé spécifiquement suivant la concentration de glucose, ce qui nous a permis de reconstituer la formation de gradients de glucose au sein d’une colonie. En étudiant des gènes spécifiques de la fermentation et de la respiration, nous avons pu observer la différentiation en deux sous-populations. Nous avons de plus cartographié l’expression de gènes impliqués dans différentes parties du métabolisme des glucides, suivi et quantifié la dynamique spatio-temporelle de croissance et d’expression génétique et finalement modélisé la croissance de la colonie ainsi que la formation du gradient de nutriment. Pour la première fois, nous avons observé la croissance, la différentiation et l’auto-organisation des colonies de S. cerevisiae avec une résolution spatio-temporelle jusqu’à maintenant inégalée / The natural environment of yeast is often a community of cells but researchers prefer to study them in simpler homogeneous environments like single cell or bulk liquid cultures, losing insight into complex spatiotemporal growth, differentiation and self-organization and how those features are intertwined and shaped through evolution and ecology. I developed a multi-layered microfluidic device that allows us to grow yeast colonies in spatially controlled dynamically structured changing environments from a monolayer of single yeast cells to a multi-layered colony. Colony growth, as a whole and at specific locations, is a result of the nutrient gradient formation within a colony through interplay of nutrient diffusion rates, nutrient uptake rates by the cells and starting nutrient concentrations. Once a limiting nutrient (e.g. glucose or amino acids) is depleted at a specific distance from the nutrients source the cells within a colony stop to grow. I was able to modulate this specific distance by changing the starting nutrient concentrations and uptake rates of cells. Colony gene expression patterns gave us information on specific micro environments formation and consequential development, differentiation and self-organization. I quantified the patterns of expression of seven glucose transporter genes (HXT1-7), each of them specifically expressed depending on the glucose concentration. This enabled us to reconstruct glucose gradients formation in a colony. I further followed the expression of fermentation and respiration specific genes and observed differentiation between two subpopulations. We also mapped other genes specific for different parts of carbohydrate metabolism, followed and quantified the spatiotemporal dynamics of growth and gene expression, and finally modelled the colony growth and nutrient gradient formation. For the first time, we were able to observe growth, differentiation and self-organization of S. cerevisiae colony with such an unprecedented spatiotemporal resolution

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central des vertébrés, et le codage de l’information cérébrale repose en partie sur des modulations de l’amplitude et de la fréquence des transmissions synaptiques glutamatergiques. De ce fait, la résolution spatiale et temporelle de ces transmissions nécessite un contrôle fin de la présence de glutamate dans la fente synaptique. Cette durée de vie du glutamate dans les synapses dépend directement de l’action de transporteurs spécifiques exprimés à la surface des astrocytes, en particulier les transporteurs de type GLT-1, qui retirent le neurotransmetteur et permettent ainsi de « nettoyer » la fente synaptique avant la survenue d’un nouvel épisode de neurotransmission. / A classic understanding of neurotransmitter clearance at glutamatergic synapses is that, in order to ensure sufficient glutamate uptake on a fast timescale, it is necessary to have high numbers of glutamate transporters in the vicinity of release sites to compensate for their slow transport kinetics. Using a combination of single molecule imaging and electrophysiological approaches, we now challenge this view by first demonstrating that GLT-1 transporters are not static but highly mobile at the surface of astrocytes, and that their surface diffusion is dependent upon both neuronal and glial cell activities. In the vicinity of glutamate synapses, GLT-1 dynamics are strongly reduced favoring their retention within this strategic location. Remarkably, glutamate uncaging at synaptic sites instantaneously increases GLT-1 diffusion, displacing the glutamate-bound transporter away from this compartment. Functionally, impairment of the transporter lateral diffusion through an antibody-based surface cross linking, both in vitro and in vivo, significantly slows the kinetics of excitatory postsynaptic currents. Taken together, these data reveal the unexpected and major role of the astrocytic surface GLT-1 fast dynamics in shaping glutamatergic synaptic transmission.Keywords:

Les maladies tropicales négligées, causées par des trypanosomes telles que la leishmaniose, la trypanosomiase africaine (maladie du sommeil) et la trypanosomiase américaine (la maladie de Chagas), imposent une morbidité et un taux de mortalité graves ayant un grand impact sur les populations les plus pauvres. Les traitements contemporains de ces maladies sont limités en raison des effets secondaires toxiques et de l’émergence des souches résistantes. Dans le but de répondre au besoin croissant de traitement, l’exploration de nouveaux agents antiprotozoaires est donc plus que nécessaire. La recherche décrite dans cette thèse vise à développer une nouvelle thérapie pour traiter ces infections parasitaires en ciblant de multiples fonctions vitales pour la survie du parasite. Une série de peptides, petites molécules et combinaison de peptides et petites molécules conjugués ont été préparés et étudiés. Par exemple, les lipopeptides almiramides N-méthylés présentent une activité antiparasitaire avec un indice thérapeutique élevé en ciblant le glycosome, un organite typique des trypanosomes. Une étude de la relation structure-activité a été réalisée pour examiner l’influence de la N-méthylation et de la conformation sur l’activité contre diverses souches de Leishmania et sur la cytotoxicité. La synthèse et l’analyse biologique de vingt-cinq analogues ont démontré que les dérivés portant un acide aminé Na-méthylé aux deux extrémités présentaient une activité supérieure à celle des peptides perméthylés et une puissance relativement élevée contre les souches résistantes. Le remplacement des résidus d’acides aminés dans le peptide par un α-amino γ-lactam (Agl) et N-aminoimidazalone (Nai) réduit l’activité antiparasitaire; cependant, les amides peptidiques possédant des résidus d’Agl à la deuxième position conservaient une puissance significative dans les séries non méthylées et perméthylées. L’étude systématique des effets de la N-méthylation et de la géométrie de tour sur l’activité antiparasitaire a montré la pertinence d’un conformère étendu sur les résidus centraux et la mobilité conformationnelle par isomérisation des amides tertiaires et la géométrie des tours aux extrémités des peptides actifs. L’alcaloïde naturel anisomycine a été étudié en raison de son importance en tant qu’inhibiteur de la synthèse des protéines avec une vaste activité antiparasitaire. L’évaluation des relations structure-activité antiprotozoaires de l’anisomycine a été réalisée en modifiant les groupements fonctionnels du cycle de pyrrolidine ainsi que sa partie aromatique. L’examination de la cytotoxicité et l’activité antiprotozoaire contre diverses souches de Leishmania en comparant avec le produit naturel ont révélé une stratégie de préparation d’analogues à forte puissance et à faible toxicité pour l’hôte. L’étude préliminaire de l’activité antiprotozoaire et de la sélectivité a favorisé ii l’exploration de conjugués phénoliques de l’anisomycine. Une série d’analogues de l’anisomycine ont été synthétisés en conjuguant l’anisomycine sur des peptides almiramides et des résidus d’acides aminés qui peuvent respectivement cibler les fonctions glycosome et transporteur du parasite. La cytotoxicité et l’activité antiprotozoaire contre diverses souches de Leishmania, Trypanosoma brucei et Trypanosoma cruzi ont démontré que la conjugaison de divers acides aminés et résidues insaturées donnait des agents antiparasitaires prometteurs qui ciblaient sélectivement les différents parasites avec une cytotoxité minimale en comparaison avec celle du produit naturel. L’activité antiprotozoaire de l’anisomycine et de ses dérivés a incité à poursuivre l’exploration des relations structure-activité pour le développement d’un traitement antiparasitaire. Compte tenu de l’utilité de l’anisomycine dans cette étude, une synthèse formelle du produit naturel a été développée. En utilisant la (2S,4R)-4-hydroxyproline comme précurseur chiral peu coûteux, une voie de synthèse a été développée impliquant le couplage Negishi. L’introduction dans les analogues de la décacéoxy-anisomycine a également été réalisée par un protocole similaire. Les études de relation structure-activité des peptides almiramides et des analogues de l’anisomycine décrites dans cette thèse ont ouvert une voie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antiparasitaires à haute puissance et à faible toxicité pour l’hôte. En ciblant plusieurs points d’intervention, les nouveaux agents offrent la promesse de ralentir les modes de résistance. En outre, la synthèse d’analogues désacétoxy-anisomycine a ouvert la porte à des intermédiaires clés pour une exploration plus approfondie des dérivés de l’anisomycine et pour améliorer la synthèse de prototypes thérapeutiques afin de relever des défis importants dans l’atténuation des maladies tropicales négligées. / Neglected Tropical Diseases (NTDs) which are caused by trypasonomatid infections, such as leishmaniasis, human African trypanosomiasis (HAT) and Chagas disease are known to inflict serious morbidity and mortality with greatest impact on the poorest populations. Contemporary anti-trypanosomatid therapy is limited due to toxic side effects and the rise of resistant stains. A growing need has emerged for novel anti-protozoal agents. The research described in this thesis seeks to develop novel therapy to treat trypasonomatid infection by targeting multiple vital functions for parasite survival. A series of peptide, small molecule, and peptide-small molecule conjugates have been prepared and studied. For example, the almiramide N-methylated lipo-peptides exhibit anti-parasitic activity with high therapeutic index by targeting the glycosome, an organelle without a mammalian counterpart. A structure-activity relationship study has been performed to examine the influences of N-methylation and conformation on activity against various strains of leishmaniasis protozoan and on cytotoxicity. The synthesis and biological analysis of twenty-five analogs demonstrated that derivatives with a single methyl group on specific residue amide nitrogen exhibited greater activity than the permethylated peptides and relatively high potency against resistant strains. Replacement of amino amide residues in the peptide by turn inducing α-amino γ-lactam (Agl) and N-aminoimidazalone (Nai) counterparts reduced typically anti-parasitic activity; however, peptide amides possessing Agl residues at the second residue retained significant potency in the unmethylated and permethylated series. Systematic study of the effects of methylation and turn geometry on anti-parasitic activity indicated the relevance of an extended conformer about the central residues and conformational mobility by tertiary amide isomerization and turn geometry at the extremities of the active peptides. The natural alkaloid anisomycin was studied because of significance as a protein synthesis inhibitor with broad anti-parasitic activity. Assessment of the structure - anti-protozoan activity relationships of anisomycin was performed by modifying pyrrolidine and aromatic functional groups. Examination of cytotoxicity and antiprotozoal activity against various strains of Leishmania and comparison with the natural product revealed a strategy for preparing analogs with high potency and low host toxicity. The preliminary study of antiprotozoal activity and selectivity promoted the exploration phenolic conjugates of anisomycin. A serie of anisomycin analogs were synthesized by conjugating anisomycin onto almiramide peptides and amino acids residues which iv may respectively target the glycosome and transporter functions of the parasite. The cytotoxicity and antiprotozoal activity against various strains of Leishmania, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi demonstrated that conjugation of various amino acid and unsaturated moieties yielded promising agents that selectively targeted the different parasites with minimal cytotoxity compared to that of the natural product. The antiprotozoal activity of anisomycin and derivatives has led to a better understanding of structure-activity relationships for the development of anti-parasitic therapy. Considering the utility of anisomycin in this study, a formal synthesis of the natural product was developed. Employing (2S,4R)-4-hydroxyproline as an inexpensive chiral building block, a route was conceived featuring the Negishi coupling. Entry into deacteoxy-anisomycin analogs was also achieved by a similar protocol. The structure-activity relationship studies of almiramide peptides and anisomycin analogs described in this thesis have opened a promissing gateway for developing new anti-parasitic agents with high potency and low host toxicity. By targeting multiple points of intervention, the new agents offer promise to minimize modes of resistance. Moreover, the synthesis of deacetoxyanisomycin analogs has paved the way to key intermediates for further exploration of anisomycin derivatives and for improving the synthesis of therapeutic prototypes to tackle important challenges in mitigating Neglected Tropical Diseases.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les anomalies de l'activité des transporteurs d'ions et de l'expression des protéines de choc thermique (HSPs) ont été décrites dans les reins d'animaux hypertendus. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi. Les isoformes NKCC 1 et NKCC2 du co-transporteur Na, K+, Cl- sont inhibées par des diurétiques tels que le furosémide et le bumétanide et sont impliquées dans la sécrétion et la réabsorption transépithéliale du sodium et de l'eau. L'implication de l'isoforme NKCC 1 a aussi été démontrée dans la régulation du volume cellulaire, ainsi que dans la progression du cycle cellulaire et dans la prolifération. Le co-transporteur Na, Pi de type II joue un rôle majeur dans la réabsorption du phosphate par le tubule proximal, ainsi que dans la régulation des concentrations plasmatiques du phosphate inorganique et du Ca2+. La régulation de ces transporteurs est spécifique à chaque tissu et à chaque segment des tubules rénaux. Puisqu'il est connu que les HSPs sont impliquées dans la protection de certaines fonctions du transport transépithélial dans les tubules rénaux de poisson, notre hypothèse était que les HSPs modulent la régulation des transporteurs rénaux d'ions connus pour leur activité anormale dans l'hypertension artérielle. Toutefois, aucune étude n'avait évalué l'implication des HSPs dans la régulation des transporteurs d'ions dans des cellules d'épithélium rénal de mammifère. De plus, les HSPs peuvent jouer un rôle non seulement dans la modulation de l'activité basale des transporteurs d'ions, mais aussi dans leur régulation. Encore une fois, il n'existait aucune donnée sur ce sujet. Pour cette thèse de doctorat, nous avons donc choisi d'étudier un modèle physiologique d'épithélium rénal avant d'entreprendre des études sur un modèle pathologique tel que l'hypertension artérielle. Le but de nos travaux de recherche était d'examiner les voies de signalisation impliquées dans la régulation de différents transporteurs d'ions dans des cellules d'épithélium rénal de mammifère, ainsi que la modulation de ces transporteurs par le stress thermique et les HSPs. Nous avons choisi comme modèle d'épithélium rénal les cellules "Madin-Darby canine kidney" (MDCK) puisque cette lignée cellulaire a conservé, in vitro, plusieurs propriétés de l'épithélium rénal in vivo, dont le transport vectoriel et la régulation hormonale. De plus, des protéines de choc thermique HSPs peuvent être induites dans cette lignée. L'activité des transporteurs d'ions a été évaluée à l'aide d'isotopes radioactifs. L'effet des stress thermiques modéré et sévère, ainsi que du stress hyperosmotique, a été évalué. L'accumulation de l'ARN messager et l'expression des protéines HSP70 et HSP27 ont été étudiées par buvardages de type northern et western. Dans des études complémentaires, nous avons aussi mesuré les concentrations intracellulaires de Na, de K+, et de Cl- à l'aide d'isotopes radioactifs; les concentrations intracellulaires de Ca2+ à l'aide du fluo-3; la production d'inositol triphosphate par la mesure du composé marqué myo-[2-31P]-inositol et la phosphorylation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) par immuno-buvardage de lysats cellulaires avec les anticorps anti-phospho ERK. Nous avons démontré que, dans les cellules MDCK, la régulation du co-transporteur Na, K+, Cl- s'effectue principalement via des voies de signalisation impliquant les isoformes de la protéine kinase C sensibles au 4β-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et via l'activation des purinocepteurs-P2X et/ou P2Y. Nous avons aussi démontré qu'aucun mécanisme connu de la signalisation induite par l'ATP n'est impliqué dans l'inhibition du co-transporteur Na, K+, Cl- par les purinocepteurs-P2X. Nos résultats suggèrent la présence d'une nouvelle voie de signalisation induite par les purinocepteurs-P2X. Le co-transporteur Na, Pi est aussi régulé par le PMA et par l'ATP. L'activation des purinocepteurs-P2 par l'ATP, ainsi que l'activation de la protéine kinase C par le PMA, diminuent de façon importante l'activité des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi. L'activité basale des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi est indépendante de la production des HSPs induites par le stress thermique. Nous avons observé que le stress thermique sévère augmente l'activité basale des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi et abolit complètement la régulation de ces transporteurs par le PMA, sans modifier significativement celle obtenue par l'activation des purinocepteurs-P2. La production de HSP70 induite par le stress thermique modéré n'empêche pas l'activation des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi à la suite d'un stress thermique sévère ni leur inhibition par les purinocepteurs-P2. En conclusion, dans les cellules MDCK, les purinocepteurs-P2 et les isoformes de la protéine kinase C sensibles au PMA sont impliqués dans la régulation de l'activité des co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi par des mécanismes différents, l'un insensible et l'autre sensible au stress thermique, respectivement. Mais cette régulation est indépendante de l'induction des HSP70 et HSP27. De plus, la régulation du co-transporteur Na, K+, Cl- par les purinocepteurs-P2 ne se fait pas par les mécanismes connus de la signalisation induite par l'ATP. Compte tenu de l'importance relative des membranes apicale et basolatérale pour la fonction de plusieurs transporteurs rénaux d'ions, dont les co-transporteurs Na, K+, Cl- et Na, Pi, des travaux sur le rôle des HSPs dans la régulation de ces transporteurs dans des cellules d'épithélium rénal cultivées sur un support perméable méritent d'être entrepris.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le transport des molécules à travers les membranes est un processus cellulaire fondamental. Les transporteurs ABC (pour ATP-binding cassette) sont des protéines transmembranaires médiant le transport actif de substrats variés (peptides, ions, acides aminés, antibiotiques, etc). Le gène ATMI de Saccharomyces cerevisiae code pour un transporteur ABC de 690 acides aminés localisé dans la membrane interne de la mitochondrie. La protéine Atml est une proche homologue de la P-glycoprotéine impliquée dans la résistance aux agents anticancéreux. Il a été démontré qu'Atml est essentielle pour la croissance des cellules, procurant ainsi un phénotype idéal pour l'analyse fonctionnelle de ce transporteur. Nous utilisons une technique, appelée plasmid shuffling', basée sur l'échange de plasmides par contre-sélection d'un plasmide portant le marqueur de sélection URA3 en présence d'acide 5-fluoroorotique (5-F0A) pour étudier Atml. Nous avons construit une souche haploïde de S. cerevisiae dans laquelle la copie chromosomique du gène ATMI est excisée mais qui est viable grâce à la présence d'un plasmide URA3 portant une copie fonctionnelle du gène ATMI. Cette souche a été transformée avec une banque d'allèles mutés d'ATM1 portés par un plasmide LEU2 et criblée pour des mutants thermosensibles (ts) d'Atml après contre-sélection du plasmide URA3 sur 5-F0A. Trois mutants ts d'Atml ont été isolés et les mutations causant le phénotype ts ont été identifiées par séquençage de l'ADN. Des courbes de croissance de ces mutants ont été tracées, démontrant une croissance normale à température permissive mais un arrêt de croissance après quelques divisions à température restrictive. Nous avons produit des anticorps polyclonaux anti-Atml qui nous ont permis d'étudier la protéine de type sauvage et celle des trois mutants ts. Ces études ont révélé l'absence d'Atml seulement dans les mitochondries des mutants ts à température restrictive. D'autre part, des expériences de coimmunoprécipitation ont démontré qu'Atml forme des homodimères et que cette interaction est médiée par la partie C-terminale d'Atml, qui contient le domaine de liaison à l'ATP. Nos expériences ont donc permis d'identifier des acides aminés importants pour la fonction d'Atml ainsi qu'un domaine impliqué dans la structure quaternaire de ce transporteur.

L’échec thérapeutique des maladies cérébrales est lié, entre autres, à la présence de barrières entre le sang et le Système Nerveux Central (SNC), en particulier la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). La BHE est une structure neuro-vasculaire localisée au niveau des MicroVaisseaux Cérébraux (MVC) limitant l’entrée des molécules thérapeutiques dans le cerveau. Ce rôle barrière est dû à plusieurs facteurs, dont principalement, l’existence du côté luminal et/ou abluminal de la BHE de plusieurs transporteurs d’efflux, dont les transporteurs de type ABC (ATP Binding Casette) et SLC (SoLute Carrier) et qui sont à l’origine des phénomènes de résistance aux médicaments. Les études de recherche actuelles visent à identifier les voies de signalisation régulant l’activité de ces protéines d’efflux afin d’optimiser la pharmacothérapie cérébrale. Mais la majorité de ces études sont effectuées chez l’adulte. Très peu de données existent chez l’enfant.Cette étude a été réalisé dans la perspective de 1) Etudier l’ontogenèse des transporteurs ABC et SLC de la BHE au cours de la maturation cérébrale, 2) Elucider le rôle fonctionnel de quatre transporteurs d’efflux ((P-glycoproteine (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) dans le cerveau des enfants et 3) Elucider les mécanismes qui régulent leur expression fonctionnelle dans des conditions normales et pathologiques, notamment inflammatoires, parce que des modifications dans les composantes structurales et fonctionnelles de l'unité neurovasculaire ont été rapportées dans une longue liste de pathologies du SNC chez les enfants et les adultes. Nos résultats ont montré l’existence de différences fonctionnelles, en terme de passage de molécules, entre la BHE pédiatrique et celle adulte. De plus, cette étude a mis en évidence une régulation différentielle liée à l'âge des transporteurs d'efflux de médicaments de la barrière dans des conditions normales et inflammatoires.Ces résultats fournissent des preuves sur l’intérêt de prendre en compte les propriétés spécifiques de la BHE pédiatrique et la distinguer de la BHE adulte lors des définitions des stratégies thérapeutiques destinées à traiter les maladies cérébrales chez les enfants. / One major reason of CNS pharmacotherapy’s impediment is the existence of “barriers” between blood and CNS, especially the Blood-Brain Barrier (BBB), a neurovascular structure localized at the level of brain microvasculature. Main factors responsible for this barrier function are drug efflux transporters type ABC (ATP-Binding Cassette) and SLC (SoLute Carrier) expressed at BBB level and known to be at the origin of multi-drug resistance phenomenon. Recent researches aim at unraveling the signaling mechanisms regulating these transporters in order to modulate their activity and improve pharmacotherapy in brain diseases. For years, these transporters have been studied in adult organism. But, there is a wide spread belief that the BBB in embryo, fetus, new born and infant is “immature”, implying caution in giving drugs to infants. However, current knowledge on the functional status of the BBB in immature organism remains very limited.This study was performed in the aim of understanding: 1) The ontogenesis of ABC and SLC transporters during brain maturation, 2) the functional role of four BBB drug efflux transporters (P-glycoprotein (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) in children’s brain, and 3) the mechanisms that regulate their functional expression under normal and pathological conditions, mostly under inflammatory conditions, because indeed alterations in structural and functional components of the BBB have been reported in a long list of CNS pathologies in adults. Our results showed changing properties of the BBB during ontogenesis, as well as an age-related differential regulation of BBB drug efflux transporters under normal and inflammatory conditions.These findings highlight the importance of considering an age-related response of CNS to drugs and of taking into account the specific properties of juvenile BBB during definition of therapeutic strategies designed to treat childhood brain diseases, and this in the clinical perspective of developing new drugs with enhanced efficacy in children’s CNS.