Le système nerveux central est un organe privilégié et protégé, notamment grâce à l’existence des barrières histologiques entre le sang et les tissus nerveux. La barrière-hémato encéphalique (BHE) et la barrière hémato-rétinienne (BHR) séparent respectivement le parenchyme cérébral et la rétine des composés contenus dans l’espace vasculaire, grâce à l’expression de jonctions serrées et de transporteurs membranaires permettant une régulation spécifique des échanges entre le sang et le parenchyme nerveux. Ce travail a porté sur l’étude d’un nouveau transporteur de cations organiques mis en évidence fonctionnellement à la BHE de la souris. Ce transporteur appartenant très probablement à la superfamille des solute carrier (SLC), fonctionne comme un antiport proton. Actuellement, sa présence ne peut être démontrée que de façon fonctionnelle car son identité moléculaire est encore inconnue. Cet antiport proton constitue un nouvel acteur de la perméabilité cérébrale et ouvre une nouvelle voie d’accès au cerveau. Nous nous sommes tout d’abord attachés à approfondir les connaissances fonctionnelles de ce transporteur en étudiant de nouveaux substrats et tissus d’expression. Le transport cérébral de psychotropes a été étudié in vivo par la technique de perfusion carotidienne in situ chez la souris et in vitro grâce à une lignée de cellules endothéliales cérébrales humaines immortalisées (hCMEC/D3). Nous avons démontré que la haute perméabilité cérébrale de la cocaïne fait intervenir à la fois une diffusion passive et surtout une diffusion médiée par un antiport proton. La vitesse d’entrée des substances d’abus dans le cerveau est associée à un plus fort risque d’addiction et fait de ce transporteur un nouvel acteur critique de la régulation du passage cérébral. En effet, d’autres substances comme la nicotine et certaines amphétamines comme le MDPV et l'ecstasy sont également des substrats de cet antiport. Ce transporteur apparaît comme une cible pharmacologique potentielle dans la prise en charge de toxicomanies. Malgré la diversité chimique et pharmacologique d’interactions des composés avec cet antiport, les concentrations nécessaires pour l’inhiber dépassent celles retrouvées dans le sang. Pour aider l’identification d’inhibiteurs sélectifs et efficaces nous avons développé un modèle pharmacophorique d’inhibiteurs du transporteur à partir de données générées in vitro et de l’approche FLAPpharm. Ce modèle semble prédictif de nouveaux composés pouvant constituer de meilleurs inhibiteurs de ce transporteur. L’étude des échanges in vivo au niveau du tissu nerveux nous a menés à étudier l’impact de transporteurs ABC et de l’antiport-proton au niveau cérébral et rétinien à l’aide de substances spécifiques ou de substrats mixtes comme le vérapamil. L’antiport proton est fonctionnel au niveau de la BHR et transporte notamment la clonidine, le DPH et le vérapamil. Cependant, dans le cas d’un substrat mixte P-gp et SLC (ex : vérapamil), ce transport d’influx n’est visible à la BHE que lorsque la P-gp est neutralisée. Au contraire, à la BHR l’influx lié à cet SLC est visible naturellement. L’impact de la P-gp à la BHR étant 6.3-fois plus faible ce processus est probablement moins masqué. Cette étude illustre la difficulté actuelle de prédire l’impact fonctionnel d’un transporteur pour des substrats multi-spécifiques et l’existence d’une priorisation du transport. Enfin, nous avons essayé d’identifier l’antiport proton au niveau moléculaire par une méthode de photo-activation à l’aide d’un composé adapté. Cette méthode s’est avérée efficace pour fixer une molécule sur le transporteur, permettant par la suite de l’isoler plus facilement. En conclusion, ce travail a permis de mettre en évidence l’importance de l’antiport proton dans la distribution cérébrale de psychotropes et d’ouvrir de nouvelles perspectives dans l’addiction et la compréhension du transport de substrats multi-spécifiques. / The central nervous system is a privilege organ protected by histological barriers between the blood and the nervous tissue. The blood-brain barrier (BBB) and the blood-retinal barrier (BRB) separate cerebral parenchyma and retina from the circulating blood and both express tight junctions and membrane transporters, allowing a precise regulation of the exchanges between the blood and nervous tissues. We studied a new cationic transporter functionally evidenced at the mouse BBB. This molecularly unknown transporter belong to the solute carrier super family (SLC) and is a proton antiporter. It could constitute a new actor in the cerebral permeability and may be a new brain access pathway. First, we worked on the functional identification studying new substrates and new localization. Psychotropic brain transport was studied in vivo by brain in situ perfusion on mouse and in vitro with human immortalized endothelial cells (hCMEC/D3). We showed that cocaine brain entry depends on passive diffusion but also mainly on a proton antiporter. Brain entry rate of drugs of abuse is associated with modulation of addiction liability, making this transporter a new component of brain entry of cocaine, and also nicotine and some amphetamines such as ecstasy and MDPV. This proton antiporter appears to be a new potential target in addiction. Various chemical entities interact with this transporter; however concentrations used to inhibit the transporter are much higher than the one possibly found in the blood. In order to help find or design new selective and potent inhibitors, we developed a pharmacophore model of the proton antiporter inhibitors using in vitro data and the FLAPpharm approach. The model predicts well new possible inhibitors of this transporter. We also studied the impact of the ABC transporters and the proton antiporter at the BBB and the BRB using specific or multi-specific substrates such as verapamil. The proton antiporter is functionally expressed at the BRB and transports clonidine, DPH and verapamil. However, for the multi-specific (P-gp and SLC) compound verapamil, influx transport by the proton antiporter is visible at the BBB only when P-gp efflux is neutralized. On the contrary, at the BRB, the proton antiporter influx is always visible. This is certainly due to the lower impact (by 6.3 fold) of P-gp at the BRB compared to the BBB. These results show the difficulty to predict the functional impact of a transporter for multi-specific compounds and a probable transport prioritization. Finally we worked on the molecular identification of the proton antiporter using a photolabeling method. This work evidenced the importance of the proton antiporter in the brain distribution of psychotropic and drugs of abuse and opened toward new perspectives in addiction and transport comprehension.

Les cancers du foie et du pancréas sont classés parmi les cancers les plus fréquents et agressifs à travers le monde et présentent une résistance à la chimiothérapie. L'efficacité des médicaments anticancéreux est affectée par les activités des enzymes métaboliques, transporteurs membranaires et par l’environnement tumoral. Le but de notre thèse est 1) de développer un modèle cellulaire hépatique et caractériser les mécanismes sous-jacents de la modulation de l’expression et de la fonctionnalité des transporteurs membranaires et des enzymes clés qui régissent le métabolisme des médicaments et 2) d’évaluer in vitro, dans différents modèles cellulaires (hépatique et pancréatique) en 2D et 3D, l’effet apoptotique de médicaments anticancéreux associés à des polyphénols en vue d’optimiser leur activité. Dans une première partie, nous avons mis en place une nouvelle lignée cellulaire hépatique humaine dérivée des HepG2, stable, exprimant suffisamment et significativement les enzymes CYP450 et les transporteurs hépatiques (MRP2, MDR1 et OATP1B1). Ce modèle pourrait être un outil de choix pour des études précliniques de métabolisme et de prédiction d’hépatotoxicité. Dans une deuxième partie, nous avons pu voir que les cellules pancréatiques et hépatiques dans un environnement 3D sont plus prédictives d’une tumeur in vivo et peuvent être un modèle de choix pour des études pharmacologiques de criblage de nouveaux médicaments anticancéreux ou des stratégies de combinaisons de molécules (avec des PP). Ainsi, nous avons montré que la quercétine, dans les cellules 3D, était capable d’augmenter l’activité de la gemcitabine et de la doxorubicine, en augmentant le taux des cellules mortes jusqu’à 60 %, par modulation des protéines MDR1 et par diminution significative du facteur HIF-1 alpha dans les cellules cancéreuses. En conclusion, les polyphénols peuvent être des molécules d’intérêt en combinaison avec des médicaments anticancéreux pour diminuer la résistance à ces traitements et servir d’outil pharmacologique pour mieux comprendre les mécanismes de résistance des cellules tumorales. / Liver and pancreatic cancers are among the most common and aggressive cancers worldwide that are resistant to chemotherapy. The efficacy of anticancer drugs is affected by the activities of metabolic enzymes, transporters and the tumor environment. The aim of my thesis was based on to main objectives: 1) developement of a hepatic cellular model and characterize the underlying mechanisms of modulation of the expression and functionality of transporters and key enzymes involved in the regulation of drug metabolism 2) study the effect of new strategies in vitro by combining anti-cancer drugs with polyphenols in these processes in order to optimize their activities on different cellular models (hepatic and pancreatic) in 2D and 3D cultures. Our results showed that we have developed a new human hepatic cell line derived from HepG2 cells. The novel cell line is a good in vitro model with a capacity of predicting hepatotoxicity of novel drugs with significant differences for chromosomes 5, 17 and 20 and high expression level of CYP450 and transporters (MRP2, MDR1 and OATP1B1). Secondly, our results indicate that the combination of anticancer drugs and polyphenols increased the rate of apoptosis in cancer cells by up regulation of the expression levels of cleaved caspase-3 and the regulator of apoptosis p53. Moreover, our results demonstrated that polyphenols inhibit the efflux activity of MDR1. In addition, our results indicate that the combination of anti-cancer drugs and quercetin down regulated the expression of HIF-1α and increased the expression levels of the cleaved caspase-3 and p53 on human pancreatic and liver cell line cultured in 3D culture. In conclusion, polyphenols may be promising agents for novel combination therapy since they potentialize the cytotoxic activity of anticancer drugs to eradicate cancer and therefore the cellular resistance.

Les brûlures sévères de plus de 20 % de la surface corporelle sont associées à un stress oxydant, à une réponse inflammatoire et à un hypermétabolisme intenses. La déficience en éléments-trace essentiels comme le zinc et le sélénium est également bien établie. Or, l'importance de ces éléments a été redécouverte avec la démonstration de leurs fonctions clés au niveau des systèmes antioxydants, de l'immunité, de l'inflammation, de la cicatrisation, de l'érythropoïèse... Dans ce contexte, le rôle de la supplémentation nutritionnelle, chez les patients brûlés, est primordial car elle participe à la qualité des soins et améliore leurs rétablissements. Toutefois, ce domaine reste encore trop peu exploré et un consensus dans les apports doit être trouvé. L'objectif de notre travail a été d'étudier, sur un modèle expérimental de rats brûlés subdéficients en zinc, l'impact d'une brûlure sévère sur l'évolution du statut en zinc, le statut antioxydant, le système glucose/insuline et l'expression de gènes impliqués dans l'homéostasie et le transport du Zn (ZnT, Zip, métallothionéine) ainsi que les conséquences d'un apport thérapeutique en zinc sur ces mêmes paramètres. La subdéficience en zinc entraîne, après brûlure, une modification des flux inter-organes de zinc ainsi qu'une accentuation de l'insulino-résistance sans toutefois altérer massivement le statut antioxydant. Si, les apports en zinc permettent de restaurer le statut en Zn et d'accroître l'expression de la métallothionéine, ils ne réussissent pas à augmenter l'activité des enzymes antioxydantes et affectent les transporteurs du zinc de manière aléatoire et inattendue. Par conséquent, conserver un statut en zinc optimal, après brûlure, est primordial. Cependant, la mise en œuvre de la supplémentation en zinc reste complexe et des travaux complémentaires sont nécessaires pour la maîtriser.

Les astrocytes participent activement au fonctionnement cérébral. Ils réalisent des échanges métaboliques et trophiques avec les neurones et exercent un contrôle sur l'entrée des substrats énergétiques dans le parenchyme cérébral. Ils sont aussi res ponsables -par le biais de leurs transporteurs GLAST et GLT-1- de la recapture et du recyclage du glutamate, le principal neurotransmetteur excitateur qui a aussi un potentiel neurotoxique. Les astrocytes répondent à des situations pathologiques variées en devenant réactifs. Ils apparaissent hypertrophiques et surexpriment certaines protéines comme les filaments intermédiaires. Bien que cette modification du phénotype astrocytaire soit connue depuis longtemps, ses conséquences fonctionnelles sont toujours débattues. S'agit-il d'un mécanisme de protection et d'adaptation à des conditions pathologiques ou, au contraire, d'un processus délétère participant à la dégénérescence neuronale ? Nous avons développé un modèle in vivo d'activation astrocytaire en utilisant un lentivirus (lenti-CNTF) pour induire une surexpression dans le striatum de rat du Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), un activateur endogène des astrocytes. Grâce à ce modèle d'activation stable et reproductible des astrocytes, nous avons pu mettre en évidence des modifications profondes du métabolisme énergétique cérébral avec une augmentation de l'utilisation des corps cétoniques au dépend du glucose. Par ailleurs, l'activation astrocytaire par le CNTF induit de nombreux changements dans la machinerie de recapture du glutamate. Les transporteurs astrocytaires sont hyperglycosylés et sont enrichis dans les microdomaines membranaires rafts. En conditions excitotoxiques, la gestion du glutamate, l'apport énergétique et la survie neuronale sont significativement améliorés dans le groupe lenti-CNTF. Ces résultats soulignent le rôle bénéfique des astrocytes activés qui présentent un phénotype et un fonctionnement favorables à la survie des neurones. Cette étude permet à la fois de mieux cerner le rôle et l'intérêt de la réponse astrocytaire dans les processus pathologiques et également de caractériser les effets du CNTF , qui est un candidat thérapeutique pour différentes maladies neurodégénératives.

L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.<br />Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.

Le système nerveux central est un organe complexe et privilégié, protégé, entre autres, par la barrière hémato-encéphalique (BHE), sur laquelle se trouvent des transporteurs d'efflux telle que la P-glycoprotéine (Pgp).<br />La BHE est impliquée dans la neuro-inflammation et les maladies cérébrales associées, et la littérature laisse penser que l'endothéline 1 (ET-1) y joue un rôle important. En utilisant un modèle in vitro autologue de BHE humaine adulte et un modèle in vitro de BHE humaine fœtale (co-culture de cellules gliales et de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales), nous avons étudié l'effet de l'ET-1 sur la Pgp.<br />Une différence, en termes de modulation de l'activité de la Pgp, a été observée entre la BHE fœtale et la BHE adulte suite à l'exposition à l'ET-1. Nous avons également évalué la modulation induite par l'ET-1 sur la sécrétion de la MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1) et de l'IL-8. Les résultats montrent que l'ET-1 diminue l'activité de la Pgp et induit la sécrétion de MCP-1 et d'IL-8.

L'acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l'expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l'efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH.<br />Dans un premier temps, ce travail a porté sur l'étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L'étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats.<br />La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l'activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l'isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie.<br />Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1.

La multichimiorésistance est caractérisée par une résistance simultanée à des agents chimiothérapeutiques de structures diverses, induite notamment par l'efflux des substances actives hors des cellules. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) sont des protéines transmembranaires impliquées dans cet efflux et qui participent à l'échec du traitement de certains cancers. Par ailleurs, ce mécanisme d'efflux a également été évoqué dans le cadre de la résistance de certains microorganismes aux antimicrobiens. Dans cette étude, nous avons conçu et synthétisé des dérivés susceptibles d'inhiber certains transporteurs ABC, en particulier, la glycoprotéine-P (Pgp) impliquée dans la multichimiorésistance des tumeurs humaines, et CpABC3, rencontré chez le parasite Cryptosporidium parvum. Dans un premier temps, nous avons synthétisé trois dérivés de type 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one, hétérocycles destinés à se fixer sur le site à ATP des transporteurs ABC. L'activité de ces composés a été évaluée vis-à-vis d'un fragment recombinant (H6-NBD1) de CpABC3, et un de ceux-ci a montré une liaison (faible) à ce fragment. Nous avons ensuite préparé dix-sept dérivés bivalents susceptibles d'inhiber la Pgp, constitués d'une molécule d'adénine (ciblant le site à ATP) reliée à la progestérone (ciblant le site aux stéroïdes) par un bras de géométrie variable. Ces dérivés ont été testés sur des lignées cellulaires K562/R7 surexprimant la Pgp, et un de ceux-ci a montré une activité supérieure à celle de la progestérone. Enfin, nous avons mis au point une synthèse de chaînes de type oligocyclohexylidène, qui sont de bons candidats pour constituer des bras espaceurs rigides

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

ABCB1 (ou P-gp pour "glycoprotéine-P"), ABCC1 (ou MRP1 pour "Multidrug Resistance Protein 1") et ABCG2 (ou BCRP pour "Breast Cancer Resistance Protein") sont les trois transporteurs ABC humains les plus impliqués dans la chimiorésistance de certaines cellules cancéreuses. Deux stratégies sont possibles pour éradiquer cette résistance : 1) l'élimination ciblée des cellules surexprimant ces transporteurs, grâce au talon d'Achille qu'elles ont développé comme conséquence de leur chimiorésistance : la sensibilité collatérale (ou hypersensibilité), et 2) l'identification et l'optimisation d'inhibiteurs spécifiques. Lors de ce projet, nous nous sommes particulièrement intéressés au transporteur ABCG2. Dans un premier temps, comme la sensibilité collatérale avait été décrite dans le cas de la surexpression d'ABCB1 ou d'ABCC1, nous voulions vérifier son implication éventuelle dans le cas de la surexpression d'ABCG2. Sans pouvoir finalement conclure sur son existence, nous avons démontré que le mécanisme d'action ne pouvait pas impliquer un efflux massif de glutathion par la protéine, comme c'est le cas pour ABCC1, contrairement à certaines données de la littérature. Dans le cadre de la seconde approche, nous avons criblé différentes séries de composés, apparentés aux flavonoïdes, pour identifier des inhibiteurs spécifiques d'ABCG2. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des relations structure-activité démontrant l'importance de certains substituants, notamment des groupements méthoxy, non seulement pour l'inhibition de l'activité du transporteur mais aussi pour la cytotoxicité des molécules. Ces études nous ont également permis de classer les inhibiteurs identifiés en 4 familles distinctes, quant à leur mécanisme d'action à la fois sur l'efflux de drogues comme la mitoxantrone et l'activité ATPasique d'ABCG2. Enfin, le meilleur inhibiteur spécifique d'ABCG2 décrit à ce jour, la chromone 6g (ou MBL-II-141) a été caractérisé plus en détails. Son efficacité in vivo pour empêcher la croissance de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris nous incite à être optimistes sur la possibilité de proposer un inhibiteur d'ABCG2 comme candidat médicament pour de futures études précliniques